一种检测辣椒红中的苏丹红含量的检测方法与流程

1.本技术涉及苏丹红检测的领域，更具体地说，它涉及一种检测辣椒红中的苏丹红含量的检测方法。


背景技术：

2.苏丹红是一种化学染料，包括ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ四种类型。主要是用于石油、机油和其他的一些工业溶剂中，目的是使其增色。曾引发“红心鸭蛋”，“亨氏辣椒酱”等食品安全事件。之所以将作为化工原料的苏丹红添加到食品中，尤其使运用与辣椒产品加工当中：一是，由于苏丹红用后不容易褪色，这样可以弥补辣椒放置久后变色的现象，保持辣椒鲜亮的色泽；二是，一些企业将玉米等植物粉末用苏丹红染色后，混在辣椒粉中，以降低成本牟取利益。
3.目前检测苏丹红染料的检测方法有《gb/t 19681-2005食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法》、《db31/t 441-2009食品中苏丹红i、ii、iii、iv和对位红的测定》，上述方法的适用性差，尤其是国标中的流动相配制复杂，长期使用对色谱柱柱效影响很大，非常容易造成柱床塌陷，检测过程中基质干扰严重，苏丹红的检出限高且出峰峰形差，检测结果准确度不佳。


技术实现要素：

4.本技术提供一种检测辣椒红中的苏丹红含量的检测方法，通过对样品的特定处理，配合简单高效的流动相，能够有效降低苏丹红的检出限，以使得色谱分离效果好，基线平稳，出峰峰形佳，显著提高检测结果准确性。
5.本技术提供的一种检测辣椒红中的苏丹红含量的检测方法采用如下的技术方案：一种检测辣椒红中的苏丹红含量的检测方法，包括以下步骤：样品溶解液制备步骤：向样品中加入有机溶剂，涡旋混匀后，进行超声提取和离心处理，取上清液得到溶解液；重复上述操作1-3次，将每次取得的上清液混合得到样品溶解液；标准液制备步骤：在中性氧化铝柱中铺设一层脱脂棉，先采用直链饱和烷烃淋洗中性氧化铝柱，随后将样品溶解液过中性氧化铝柱，再采用直链饱和烷烃复淋，弃去淋洗液，采用二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，将洗脱液在惰性气体下吹干，采用甲酸-甲醇溶液和乙腈溶液的混合液进行复溶，超声处理后制得复溶溶液，将复溶溶液过滤后制得标准液；检测步骤：采用液相色谱-质谱联用仪进行检测；其中色谱柱为rp-18柱，流动相a相为甲酸-水溶液，流动相b相为乙酸-甲醇溶液和乙腈溶液的复配液。
6.苏丹红为脂溶性组分，选择有机溶剂作为提取剂，并配合超声和离心处理，能够有效提高苏丹红的提取效率。在标准液制备步骤中，采用固相填料的中性氧化铝柱对组分进行选择性吸附，并配合直链饱和烷烃的淋洗和二氯甲烷的洗脱，实现对样品的分离纯化和富集，可以有效去除辣椒红中本身的天然色素，同时还能减少杂质干扰，提高对样品的分离效果，改善苏丹红的回收率；与检测步骤中的流动相协同，有效降低苏丹红的检出限，提高
检测结果准确性。
7.在经过特定组分和方法处理后得到的标准液，配合特定的流动相，即选用甲酸-水溶液为流动相a相、乙酸-甲醇溶液和乙腈溶液的复配液为流动相b相，有助于苏丹红分子结构中的偶氮基(—n＝n—)与邻位的羟基(—oh)形成分子内氢键，内氢键具有良好的稳定性，从而增强苏丹红的响应值，以使得色谱分离效果好，基线平稳，出峰峰形佳，苏丹红的检出限低，能够显著改善苏丹红的检测结果准确性。本技术的流动相配制简单，能够长效使用且对色谱柱柱效影响小，有效延长色谱柱的使用时间，降低企业成本。
8.优选的，所述混合液中甲酸-甲醇溶液的质量浓度为0.07-0.2％。
9.优选的，所述混合液中甲酸-甲醇溶液和乙腈溶液的体积比为(1-2.5):(6-9)。
10.通过采用上述技术方案，选用合适质量浓度的甲酸-甲醇溶液，并优化甲酸-甲醇溶液和乙腈溶液的体积比，改善对样品溶解液的分离效果，不仅能够有效去除辣椒红中本身的天然色素，提高苏丹红的回收率，降低苏丹红的检出限，还能协助减少杂质的干扰，以使得检测结果的基线平稳，出峰峰形佳，协助改善苏丹红的检测结果准确性。
11.优选的，所述复配液中乙酸-甲醇溶液和乙腈溶液的体积比为(1-3):(7-10)。
12.通常甲酸-水溶液的质量浓度为0.1-0.2％，再优化流动相b相的组分配比，选取更为合适的流动相组成，有助于苏丹红分子结构中的偶氮基(—n＝n—)与邻位的羟基(—oh)形成分子内氢键，增强苏丹红的响应值，以使得色谱分离效果好，基线平稳，出峰峰形佳，苏丹红的检出限低，能够显著改善苏丹红的检测结果准确性。
13.优选的，所述有机溶剂为乙腈或正己烷。
14.通过采用上述技术方案，正己烷、乙腈作为有机溶剂对辣椒红进行提取处理，配合超声提取和离心处理，上述两种有机溶剂的提取效率均可达到60％以上，正己烷在提取苏丹红目标物的同时，易提取到样品中其他杂质，故选择乙腈进行提取得到的样品溶解液更佳，有利于减少杂质的干扰，改善出峰峰形，提高检测结果准确性。
15.优选的，所述直链饱和烷烃为正己烷、正戊烷、正辛烷中的一种。
16.通过采用上述技术方案，正己烷、正戊烷、正辛烷均可作为溶剂使用，采用正己烷对其进行淋洗和复淋，能够与二氯甲烷协配，提高对样品溶解液的处理效果，降低苏丹红的检出限，减少标准液中的杂质干扰，更利于后期的检测，提高对苏丹红的检测结果准确性。
17.优选的，所述标准液制备步骤中，所述惰性气体为氮气，吹干温度为35-44℃。
18.通过采用上述技术方案，氮气来源广泛，廉价易得，能够在一定程度上节省企业成本，在合适温度下吹干，减少标准液中的杂质干扰，提高对苏丹红的检测结果准确性。
19.优选的，所述标准液制备步骤中，采用亲水ptfe微孔滤膜对复溶溶液进行过滤。
20.通过采用上述技术方案，亲水ptfe微孔滤膜具有良好的过滤效果，阻力低，截留率高，一般采用0.22μm或0.45μm的ptfe微孔滤膜进行过滤，有效降低标准液中的杂质干扰，提高检测结果准确性。
21.优选的，所述样品溶解液制备步骤中，在18-25℃的温度下超声提取18-26min，在7700-8500r/min的条件下离心4-8min。
22.通过采用上述技术方案，在适宜的温度条件下进行超声溶解，并优化离心的转速条件和时间，能够促进苏丹红的溶解提取，提高对样品的处理效果。
23.综上所述，本技术具有以下有益效果：
1.在标准液制备步骤中，采用固相填料的中性氧化铝柱对组分进行选择性吸附，并配合直链饱和烷烃的淋洗和二氯甲烷的洗脱，实现对样品的分离纯化和富集，可以有效去除辣椒红中本身的天然色素，同时还能减少杂质干扰，提高对样品的分离效果，改善苏丹红的回收率。
24.2.在经过特定组分和方法处理后得到的标准液，配合特定的流动相，即选用甲酸-水溶液为流动相a相、乙酸-甲醇溶液和乙腈溶液的复配液为流动相b相，有助于苏丹红分子结构中的偶氮基(—n＝n—)与邻位的羟基(—oh)形成分子内氢键，内氢键具有良好的稳定性，从而增强苏丹红的响应值，以使得色谱分离效果好，基线平稳，出峰峰形佳，苏丹红的检出限低，能够显著改善苏丹红的检测结果准确性。
附图说明
25.图1为实施例1的苏丹红i、苏丹红ii、苏丹红iii和苏丹红iv的总离子流图；图2为实施例1的苏丹红i线性关系曲线图；图3为实施例1的苏丹红ii线性关系标准曲线；图4为实施例1的苏丹红iii线性关系标准曲线；图5为实施例1的苏丹红iv线性关系标准曲线。
具体实施方式
26.以下结合实施例对本技术作进一步详细说明。
27.本技术所用原料均为普通市售原料，rp-18色谱柱规格为内径50mm*2.1mm，粒度为1.8μm。实施例
28.实施例1一种检测辣椒红中的苏丹红含量的检测方法，包括以下步骤：样品溶解液制备步骤：称取0.5g样品于50ml塑料离心管中，加入5ml乙腈，盖上离心管盖，涡旋混匀1min后，20℃超声提取20min，8000r/min离心5min，吸取上清液转移至另一离心管中，再次加入5ml乙腈，盖上离心管盖，涡旋混匀1min后，20℃超声提取20min，8000r/min离心5min，将两次取得的上清液混合得到样品溶解液；标准液制备步骤：称取1g中性氧化铝至5ml注射器管中均匀填充形成中性氧化铝柱，在中性氧化铝柱中铺设一层1cm厚的脱脂棉，先采用5ml正己烷淋洗中性氧化铝柱，随后将样品溶解液过中性氧化铝柱，再采用5ml正己烷复淋，弃去淋洗液；用5ml二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，将洗脱液在40℃的条件下，采用氮气保护吹干，采用甲酸-甲醇溶液和乙腈溶液的混合液进行复溶，混合液用量为1ml，甲酸-甲醇溶液的质量浓度为0.1％，甲酸-甲醇溶液的体积比为2:8，超声处理10min后制得复溶溶液，将复溶溶液采用0.22μm的亲水ptfe微孔滤膜过滤后制得标准液；检测步骤：采用液相色谱-质谱联用仪进行检测；液相色谱条件：(1)色谱柱为rp-18柱，色谱柱规格为内径50mm*2.1mm，粒度为1.8μm；(2)流动相a相为质量浓度为0.1％的甲酸-水溶液，流动相b相为乙酸-甲醇溶液和
乙腈溶液的复配液，其中乙酸-甲醇溶液的质量浓度为0.1％，乙酸-甲醇溶液和乙腈溶液的体积比为1:9；流动相梯度条件见表1；(3)流速：0.2ml/min；(4)柱温：40℃；(5)进样量：2μl；(6)检测波长：苏丹红ⅰ478nm；苏丹红ⅱ、苏丹红ⅲ、苏丹红ⅳ520nm；表1流动相及其梯度条件(va+vb))质谱条件：(1)离子源类型：电喷雾离子源；(2)扫描方式：正源扫描；(3)电喷雾电压：正源4000v，负源-4000v；(4)离子源温度：350℃；(5)雾化气：50psi；(6)辅助加热气：50psi；(7)气帘气：35psi；(8)监测离子参数情况见表2。
29.表2苏丹红特征离子质谱条件
实施例2与实施例1的区别在于，样品溶解液制备步骤：称取0.5g样品(精确至0.01g)于50ml塑料离心管中，加入5ml正己烷，盖上离心管盖，涡旋混匀1min后，18℃超声提取26min，7700r/min离心8min，吸取上清液转移至另一离心管中；再次加入5ml正己烷，盖上离心管盖，涡旋混匀1min后，18℃超声提取26min，7700r/min离心8min，吸取上清液转移至另一离心管中；再加入5ml正己烷，盖上离心管盖，涡旋混匀1min后，18℃超声提取26min，7700r/min离心8min，将三次取得的上清液混合得到样品溶解液；其余均与实施例1相同。
30.实施例3与实施例1的区别在于，样品溶解液制备步骤：称取0.5g样品于100ml塑料离心管中，加入10ml正己烷，盖上离心管盖，涡旋混匀1min后，25℃超声提取18min，8500r/min离心4min，吸取上清液得到样品溶解液；其余均与实施例1相同。
31.实施例4与实施例1的区别在于，标准液制备步骤：称取1g中性氧化铝至5ml注射器管中均匀填充形成中性氧化铝柱，在中性氧化铝柱中铺设一层1cm厚的脱脂棉，先采用5ml正戊烷淋洗中性氧化铝柱，随后将样品溶解液过中性氧化铝柱，再采用5ml正戊烷复淋，弃去淋洗液；用5ml二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，将洗脱液在35℃的条件下，采用氮气保护吹干，采用甲酸-甲醇溶液和乙腈溶液的混合液进行复溶，混合液用量为1ml，甲酸-甲醇溶液的质量浓度为0.1％，甲酸-甲醇溶液的体积比为2:8，超声处理10min后制得复溶溶液，将复溶溶液采用0.45μm的亲水ptfe微孔滤膜过滤后制得标准液；实施例5与实施例1的区别在于，标准液制备步骤：称取1g中性氧化铝至5ml注射器管中均匀填充形成中性氧化铝柱，在中性氧化铝柱中铺设一层1cm厚的脱脂棉，先采用5ml正辛烷淋洗中性氧化铝柱，随后将样品溶解液过中性氧化铝柱，再采用5ml正辛烷复淋，弃去淋洗液；用5ml二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，将洗脱液在44℃的条件下，采用氮气保护吹干，采用甲酸-甲醇溶液和乙腈溶液的混合液进行复溶，混合液用量为1ml，甲酸-甲醇溶液的质量浓度为0.1％，甲酸-甲醇溶液的体积比为2:8，超声处理10min后制得复溶溶液，将复溶溶液采用0.45μm的亲水ptfe微孔滤膜过滤后制得标准液；实施例6与实施例1的区别在于，标准液制备步骤中，采用甲酸-甲醇溶液和乙腈溶液的混合液进行复溶，混合液用量为1ml，甲酸-甲醇溶液的质量浓度为0.07％，甲酸-甲醇溶液的体积比为2.5:9，超声处理10min后制得复溶溶液；其余均与实施例1相同。
32.实施例7与实施例1的区别在于，标准液制备步骤中，采用甲酸-甲醇溶液和乙腈溶液的混合液进行复溶，混合液用量为1ml，甲酸-甲醇溶液的质量浓度为0.2％，甲酸-甲醇溶液的体积比为1:6，超声处理10min后制得复溶溶液；其余均与实施例1相同。
33.实施例8与实施例1的区别在于，检测步骤中，流动相a相为质量浓度为0.2％的甲酸-水溶
液，流动相b相为乙酸-甲醇溶液和乙腈溶液的复配液，其中乙酸-甲醇溶液的质量浓度为0.3％，乙酸-甲醇溶液和乙腈溶液的体积比为1:7；其余均与实施例1相同。
34.实施例9与实施例1的区别在于，检测步骤中，流动相a相为质量浓度为0.2％的甲酸-水溶液，流动相b相为乙酸-甲醇溶液和乙腈溶液的复配液，其中乙酸-甲醇溶液的质量浓度为0.2％，乙酸-甲醇溶液和乙腈溶液的体积比为2:5；其余均与实施例1相同。
35.对比例对比例1与实施例1的区别在于，标准液制备步骤：称取1g中性氧化铝至5ml注射器管中均匀填充形成中性氧化铝柱，在中性氧化铝柱中铺设一层1cm厚的脱脂棉，先采用5ml质量浓度为1％的氯化钠溶液淋洗中性氧化铝柱，随后将样品溶解液过中性氧化铝柱，再采用5ml质量浓度为1％的氯化钠溶液复淋，弃去淋洗液；用5ml二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，将洗脱液在40℃的条件下，采用氮气保护吹干，采用甲酸-乙腈溶液进行复溶，混合液用量为1ml，甲酸-乙腈溶液的质量浓度为0.1％，超声处理10min后制得复溶溶液，将复溶溶液采用0.22μm的亲水ptfe微孔滤膜过滤后制得标准液；其余均与实施例1相同。
36.对比例2与实施例1的区别在于，检测步骤中，流动相a为乙腈溶液，流动相b为质量浓度为0.1％的甲酸溶液，其余均与实施例1相同。
37.对比例3检测辣椒红中的苏丹红含量的检测方法，包括样品前处理步骤和检测步骤；样品前处理步骤具体为：称取0.5g样品(精确至0.01g)于50ml塑料离心管中，加入5ml乙腈溶液，涡旋混匀1min后，20℃超声提取20min，8000r/min离心5min，取上清液在40℃的条件下，采用氮气保护吹干，然后采用乙腈溶液复溶，超声处理10min后制得复溶溶液，将复溶溶液采用0.22μm的亲水ptfe微孔滤膜过滤后制得标准液；检测步骤与实施例1相同。
38.性能检测试验定量定性分析在相同实验条件下进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致，并且目标化合物的质谱定量和定性离子均出现，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的定性离子和定量离子的相对丰度比与质量浓度相当的基质标准溶液相比，其允许偏差不超过表3规定的范围，则可判断样品中存在目标物质。
39.表3定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度＞50％＞20％至50％＞10％至20％≤10％允许相对偏差
±
20％
±
25％
±
30％
±
50％采用实施例1的检测方法并将测定的总离子流图记录在图1；记录实施例1中目标苏丹红色谱峰的保留时间，结果参见表4。
40.表4
采用实施例1的检测方法，逐级用空白基质溶液释成质量浓度为10ng/l、20ng/l、30ng/l、50ng/l、100ng/l、200ng/l、300ng/l和500ng/l的标准溶液进行进样检测，以苏丹红定量离子峰面积为纵坐标，苏丹红标准溶液质量浓度为横坐标，绘制线性曲线图，见图2-图5，并按照标准检测方法进行校正，记录标线的相关系数r2，相关系数r2的结果记录在表5。
41.表5根据gb/t 19681-2005《食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法》测定实施例1-9和对比例1-3的苏丹红的检出限(ug/kg)，结果见表6；表6表6通过实施例1并结合表4和表6可以看到，采用本技术的检测方法，能够有效降低苏丹红的检出限，检测出苏丹红的含量，且苏丹红ⅰ、苏丹红ⅱ、苏丹红ⅲ和苏丹红ⅳ之间保留时间间隔佳，其分离效果好，再结合图1-图5可以看到，检测得到的苏丹红ⅰ、苏丹红ⅱ、苏丹红ⅲ和苏丹红ⅳ的基线平稳，出峰峰形佳，苏丹红的检测准确性高。
42.通过实施例1-9并结合表6可以看到，采用本技术的检测方法，苏丹红ⅰ、苏丹红ⅱ、
苏丹红ⅲ和苏丹红ⅳ的检出限低，且苏丹红ⅰ、苏丹红ⅱ、苏丹红ⅲ和苏丹红ⅳ的回收率得到有效提升。
43.通过实施例1与对比例1-3并结合表6可以看到，对比例1在标准液制备步骤中，采用氯化钠溶液进行淋洗和复淋，同时采用甲酸-乙腈溶液进行复溶，即标准液的步骤不同；对比例2在检测步骤中，将乙腈溶液作为流动相a，质量浓度为0.1％的甲酸溶液作为流动相b，即替换检测步骤中使用的流动相，对比例3则是对样品进行简单的溶液和处理，对比例1-3得到的苏丹红ⅰ、苏丹红ⅱ、苏丹红ⅲ和苏丹红ⅳ的检出限均明显升高，且其回收率明显下降，这是由于固相填料的中性氧化铝柱配合直链饱和烷烃的淋洗和二氯甲烷的洗脱，能够对组分进行选择性吸附，实现对样品的分离纯化和富集，可以有效去除辣椒红中本身的天然色素，同时还能减少杂质干扰，而经过特定组分和方法处理后得到的标准液，配合特定的流动相，即选用甲酸-水溶液为流动相a相、乙酸-甲醇溶液和乙腈溶液的复配液为流动相b相，有助于苏丹红分子结构中的偶氮基(—n＝n—)与邻位的羟基(—oh)形成分子内氢键，内氢键具有良好的稳定性，从而增强苏丹红的响应值，以使得色谱分离效果好，基线平稳，出峰峰形佳，苏丹红的检出限低，能够显著改善苏丹红的检测结果准确性。由此可见本技术的检测方法，对应的步骤与所用组分相辅相成，互相协同，共同改善对苏丹红的检测效果。
44.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。