一种结核病的免疫标志物及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种结核病的免疫标志物及其应用。


背景技术：

2.结核病(tuberculosis，tb)是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，mtb)及其复合菌群感染引起的传染性疾病。目前结核病的治疗主要依赖化学类药物，由于结核分枝杆菌生长缓慢以及体内免疫微环境等因素的影响，导致该病原菌在治疗过程中极易产生耐药性。目前，所有临床化学药物都已经发现了对其具有耐药性的临床分离菌株。
3.近些年，耐药结核病尤其是耐多药结核病的出现和流行，导致结核病的防控形势非常严峻。耐多药结核病对现有最有效的一线临床药物异烟肼和利福平都产生了耐药性，由此耐多药结核病的治疗非常困难，甚至无药可用。因此急需开发新型的治疗策略。
4.结核病的发生、发展及转归与人体免疫状态密切相关。增强人体免疫功能的免疫辅助治疗，在耐多药结核病的治疗过程中发挥重要作用。
5.现有技术：nk细胞受体与nectin/necl家族配体相互作用的分子机制研究(2014.5.1，张永军等)记载了：...而crtam与necl-2的识别一方面会促进nk细胞对肿瘤细胞的杀伤,另一方面会抑制肿瘤细胞自身的粘附、聚集和向组织的转移...综上所述,我们的研究阐明了nk细胞上crtam、cd96和dnam-1等受体与其配体的相互作用分子基础,为nk细胞免疫识别的机制以及可能得后续的基于结构的药物设计打下了基础。
6.中国专利申请：cn105247075a公开了一种用于诊断肺病的生物标记物及其使用方法，提供了用于诊断间质性肺疾病(ild)的方法。提供了区别诊断(differential diagonsis)特发性肺纤维化与其它ild的方法。还提供了可用于执行主题方法的组合物和试剂盒。间质性肺疾病(ild)，也被称作弥漫性实质性肺病(dpld)，代表了多种病症，其可导致对正常肺组织的弥漫性重塑(diffuse remodeling)、结构损伤(architectural damage)和可导致肺功能进行性丧失的炎症。在ild中，除了经常在肺实质中见到的炎症和纤维化之外，气管和脉管也会受到显著的影响，并在申请文件中提到了crtam表达量与间质性肺疾病(ild)的关系。
7.但是上述文献，无论是现有技术(nk细胞受体与nectin/necl家族配体相互作用的分子机制研究(2014.5.1，张永军等))还是专利文献(cn105247075a)中虽然都涉及到了crtam与免疫的关系，但是本领域技术人员同时还知晓，免疫治疗的两大支柱，一是强化免疫细胞的攻击力，二是解除癌细胞对免疫的抑制力。治疗方法：一种是提高免疫细胞的攻击力，另一种是通过解除癌细胞对免疫的抑制，使免疫细胞恢复对癌的攻击状态(各种免疫检查点抑制剂)，所以何种情况下提高身体机体的免疫力从而实现治疗疾病的目的，何种情况下抑制身体机体的免疫力，使免疫细胞恢复对癌的攻击状态，这并非显而易见。
8.而本发明中，发明人首次发现cd355，即class i-restricted t cell-associated molecule(crtam)是调节宿主保护性免疫的重要靶点，可作为结核免疫标志物，为耐多药结核病的治疗提供了新的思路。关于本发明一种结核病的免疫标志物及其应用目前还未见有
文献报道。


技术实现要素：

9.本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种结核病的免疫标志物及其应用。
10.为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
11.第一方面，本发明提供了一种结核病的免疫标志物，所述免疫标志物是：cd355表达量。
12.第二方面，本发明提供了如上所述的免疫标志物在制备结核病鉴别诊断和/或疗效预后检测试剂盒中的应用。
13.进一步地，本发明提供了如上所述的免疫标志物在制备耐多药结核病鉴别诊断和/或疗效预后监测试剂盒中的应用。
14.优选地，所述的试剂盒的唯一有效成分为：检测cd355表达量的试剂。
15.优选地，所述的试剂盒用来疗效预后监测的指标为：外周血中cd355表达量显著升高，说明药物起疗效、预后复发风险低。
16.第三方面，本发明提供了一种耐多药结核鉴别诊断和/或疗效预后监测试剂盒，所述试剂盒包括：检测试剂盒和说明书，其中所述检测试剂包括检测cd355表达量的物质，所述说明书记载了鉴别耐多药结核病和疗效预后监测的流程和指标。
17.第四方面，本发明提供了cd355促进剂在制备治疗结核病的药物中的应用。
18.进一步地，本发明提供了cd355促进剂在制备治疗耐多药结核病的药物中的应用。
19.更进一步地，本发明提供了necl2促进剂在制备治疗耐多药结核病的药物中的应用。
20.优选地，所述的促进剂是促进cd355和/或necl2表达量的物质，所述的促进剂选自小分子化合物或生物大分子。
21.本发明优点在于：
22.本发明首次证实cd355(又称class i-restricted t cell-associated molecule，简称crtam)是宿主在抗结核免疫应答中重要的保护性细胞因子。cd355编码基因在人体和小鼠体内都存在，发挥类似功能。在人体外周淋巴细胞中，提高cd355的表达量能够增强淋巴细胞对胞内感染结核分枝杆菌的杀菌作用效果，抑制cd355的表达则显著降低了淋巴细胞对胞内感染结核分枝杆菌的杀菌作用效果。而且，cd355编码基因缺失的小鼠在结核分枝杆菌感染后，肺部的菌落数目显著高于对照野生型小鼠，也就是说cd355编码基因缺失的小鼠对结核分枝杆菌的感染更加敏感。因此，cd355是宿主靶向免疫辅助治疗结核病的新型作用靶点。本发明为耐多药结核病的治疗提供了新的思路，有很强的实用性。
附图说明
23.附图1是crtam及其配体necl2的表达量。a.在健康人(hc)和结核病患者(tb)pbmc中，利用定量pcr检测的crtam和necl2的表达量。b.pbmc中加入ppd/hmbpp刺激后，crtam以及necl2的表达量。c.在bcg感染刺激前、后，thp-1细胞中necl2的表达量。
24.附图2是cd355阳性细胞对胞内感染结核分枝杆菌生长的影响。结核感染抗性人群pbmc分选cd355+cd3+细胞(黑色柱)以及cd355-cd3+细胞(灰色柱)与结核杆菌感染的hmdm
细胞共培养3天后的菌落计数结果。
25.附图3是cd355表达量改变对人源pbmc细胞抑制胞内结核分枝杆菌生长的影响。a.将过量表达cd355的编码基因的慢病毒(lenti-cd355)和空载体病毒作为对照(lenti-control)转染人源pbmc细胞后，与感染了结核分枝杆菌标准株h37rv的巨噬细胞共同孵育，细胞裂解液稀释后涂板计数h37rv菌落数目(cfu)。b.将靶向cd355编码基因的shrna片段连入载体制备慢病毒(sh-cd355)和空载体对照病毒(sh-nc)转染人源pbmc，如a所述，检测计数h37rv菌落数目(cfu)。
26.附图4是结核分枝杆菌h37rv感染小鼠后不同时间点检测小鼠肺部的菌落数目。cd355编码基因缺失小鼠(ko)在感染的1周(1w，a)和2周(2w，b)后，其肺部的菌落数目都显著高于野生型对照小鼠(wt)。
具体实施方式
27.下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
28.实施例1
29.1实验方法
30.1.1实验人群的招募
31.第一组结核感染抗性人群：从痰菌阳性的肺结核患者配偶中招募密切接触者，选择与发病后的患者持续密切接触超过2周的配偶，检测其血清针对esat6和cfp10蛋白的特异性抗体，抗体检测是阳性的个体，再通过tb.spot和ppd皮试筛选，结果为双阴性的在6个月后再测试一次，连续为双阴性的个体入选。
32.第二组痰菌阳性的结核病患者：由上海市肺科医院确诊的结核病患者中招募。
33.第三组未感染结核的健康人：选择没有结核病密切接触史的健康人群。
34.招募的人员无其它传染性疾病、无慢性阻塞性肺病、无吸烟史等。
35.受试者抽取外周血，按照我们已经建立的技术体系，采用ficoll离心方法从外周血中分离pbmc。
36.pbmc细胞采用ppd和hmbpp刺激，用cd3、cd107a、crtam(cd355)、cxcr3等荧光抗体进行细胞表面染色。染色后的细胞，利用流式细胞仪进行分析或分选。
37.分选目的细胞亚群后，送往公司进行转录组测序分析。或者按照我们已经建立的技术体系，抽取细胞mrna，检测特定基因的表达量。
38.1.2利用慢病毒载体转染人源pbmc细胞，检测pbmc体外杀菌作用效果按照我们已经建立的技术体系，改变cd355在淋巴细胞中的表达量。
39.增加cd355表达量的方法：构建表达cd355编码基因的慢病毒，转染pbmc以增加细胞内crtam表达量。
40.降低cd355表达量的方法：构建慢病毒载体表达靶向cd355的shrna，转入人源pbmc降低cd355的表达量。
41.采用上述方法改变cd355表达量之后，用ppd和hmbpp刺激。同时，将巨噬细胞thp-1
用结核分枝杆菌h37rv按moi＝10进行感染。按照我们已经建立的技术体系，将两类细胞混合培养3天，裂解细胞，稀释细胞裂解液涂布到7h10平板，置于37℃培养4周，统计菌落数目。
42.1.3小鼠用结核分枝杆菌h37rv攻毒，解剖小鼠检测肺部的菌落数目
43.购买cd355编码基因缺失小鼠(ko)和正常野生型小鼠。采用滴鼻方式每只小鼠感染结核杆菌1x105 cfu。分别在饲养1、2周后，解剖小鼠，分离小鼠肺，进行破碎匀浆，匀浆液稀释涂板，37℃培养4周后，统计菌落数目。
44.2结果
45.2.1 cd355在结核感染抗性人群体内向肺部趋化迁移的细胞中高水平表达
46.为了寻找人体针对结核杆菌感染的有效免疫保护应答，本发明以能够快速清除结核感染的结核感染抗性人群作为目标人群，分析了该类人群体内能够快速向肺部趋化迁移的细胞毒效应细胞，即cxcr3+cd107a+的免疫学特征。抽取外周血分离淋巴细胞，分选cxcr3+cd107a+细胞和cxcr3-cd107a-细胞，进行转录组分析。结核病患者来源的相同类型细胞也进行了转录组分析。结果表明在结核感染抗性人群中，cd355在cxcr3+cd107a+细胞的表达量显著高于cxcr3-cd107a-细胞(表1)。cd355在结核病患者cxcr3+cd107a+细胞表达量非常低，显著低于结核感染抗性人群(表2)。结果说明cd355能够在向肺迁移的细胞毒活性细胞中高水平表达，cd355可能在机体抗结核免疫应答中发挥重要功能。
47.表1 cd355在结核感染抗性人群的双阳性细胞中的表达量
[0048][0049]
注：(cxcr3+cd107a+,double positive,简称dp)和(cxcr3-cd107a-,double negative,简称dn)
[0050]
表2 cd355在结核感染抗性人群的细胞中的表达量
[0051]
基因名称dp-r中表达量dp-tb中表达量log2(改变倍数)p值q值cd355581.5377.14369-6.34710.000050.00322
[0052]
注：(cxcr3+cd107a+，double positive resister,简称dp-r和结核病患者的(cxcr3+cd107a+，doublepositive tuberculosis,简称dp-tb)
[0053]
2.2 cd355及其配体necl2编码基因的表达量在结核病患者体内显著下降
[0054]
在没有结核抗原刺激时，在健康人的pbmc中cd355和其配体necl2编码基因的表达量都显著高于结核病患者(图1a)。在结核抗原刺激后，健康人pbmc中cd355和necl2的表达量也都显著高于结核病患者(图1b)。结果表明在结核病患者体内cd355及其配体necl2的表达量都显著下降。
[0055]
在体外采用结核分枝杆菌感染人源巨噬细胞thp-1，然后通过定量pcr检测了necl2的表达量。结果表明在感染48小时后，细胞中necl2表达量显著降低(图1c)。
[0056]
上述结果说明，结核分枝杆菌感染抑制了cd355及其配体necl2的表达。
[0057]
2.3结核抗原反应性cd355阳性细胞能够显著抑制胞内感染结核分枝杆菌的生长
[0058]
为了探究cd355阳性细胞的抗结核效应功能，发明人检测了cd355+cd3+细胞对胞
内感染结核分枝杆菌生长的影响。结核感染抗性人群(resister)的pbmc用ppd/hmbpp刺激后分选cd355+cd3+细胞、cd355-cd3+细胞。分选同一个体的cd14+细胞诱导成hmdm，用结核分枝杆菌感染。然后将两类细胞共培养后，涂板计数。结果表明cd355+cd3+处理组(黑色柱)的细菌数目显著低于cd355-cd3+处理组(灰色柱)(图2)。
[0059]
2.4 cd355能够调控人源淋巴细胞的杀菌功能
[0060]
为了探究cd355对淋巴细胞抗结核效应功能的影响，发明人改变cd355的表达量，然后验证淋巴细胞对胞内感染结核分枝杆菌的杀菌作用效果。首先，利用过量表达cd355的慢病毒载体，转染人源淋巴细胞，增加cd355的表达量。然后将pbmc细胞与感染了结核分枝杆菌标准株的h37rv共同孵育3天，裂解细胞后，统计h37rv的菌落数目(cfu)。研究结果表明，与对照病毒转染组(lenti-control)相比，cd355过量表达的慢病毒(lenti-cd355)处理组的菌落数目显著低于对照组(图3a)。同样，本发明利用表达靶向cd355编码基因的shrna的慢病毒载体转染人源pbmc以降低cd355的表达量，然后检测pbmc细胞对胞内感染h37rv的杀菌效果，发现cd355编码基因被抑制的处理组(sh-cd355)的菌落数目与对照相比显著升高(图3b)。上述研究结果表明，cd355表达量的变化将影响人源淋巴细胞的体外杀菌作用效果，即cd355能够调控人源淋巴细胞的抗结核免疫功能。
[0061]
2.5 cd355编码基因缺失小鼠对结核杆菌的感染更加敏感
[0062]
为了验证cd355编码基因在宿主抗结核感染过程中的作用，本发明构建了cd355编码基因缺失的小鼠(ko)，然后用结核分枝杆菌感染，检测小鼠肺部的菌落数目。研究结果发现，与野生型小鼠(wt)相比，cd355编码基因缺失的小鼠(ko)在结核分枝杆菌h37rv感染后，1周(图4a)和2周(图4b)的菌落计数结果，都显著增高。上述结果说明，cd355编码基因缺失的小鼠对结核分枝杆菌感染时的抗性减弱，即cd355在宿主抗结核分枝杆菌感染过程中具有重要的保护作用。
[0063]
3结论
[0064]
本发明首次证实cd355(又称class i-restricted t cell-associated molecule，简称crtam)是宿主在抗结核免疫应答中重要的保护性细胞因子。cd355编码基因在人体和小鼠体内都存在，发挥类似功能。在人体外周淋巴细胞中，提高cd355的表达量能够增强淋巴细胞对胞内感染结核分枝杆菌的杀菌作用效果，抑制cd355的表达则显著降低了淋巴细胞对胞内感染结核分枝杆菌的杀菌作用效果。而且，cd355编码基因缺失的小鼠在结核分枝杆菌感染后，肺部的菌落数目显著高于对照野生型小鼠，也就是说cd355编码基因缺失的小鼠对结核分枝杆菌的感染更加敏感。因此，cd355是宿主靶向免疫辅助治疗结核病的新型作用靶点。
[0065]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。