一种天然低共熔溶剂超声提取结合超高效液相色谱法检测决明子中7种蒽醌类化合物的方法

1.本发明涉及一种基于天然低共熔溶剂超声提取结合超高效液相色谱法同时检测决明子中7种蒽醌类化合物（橙黄决明素、大黄酚、决明素、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素和大黄酸）的分析方法，属于分析技术领域。
2.

背景技术：

3.决明子是中国卫生健康委员会正式公布的一种食药两用植物。决明子的提取物具有抗高血压、保肝、调节血脂、抗氧化、抗菌、抗诱变和抗血小板聚集等功效，其生物活性成分主要为蒽醌类化合物，蒽醌类化合物成分橙黄决明素和大黄酚的含量是决明子药材及相关产品质量的重要指标。
4.在中国和韩国，决明的种植相当普遍，而且常将决明子用来泡茶。决明子中除了橙黄决明素和大黄酚外，还含有多种其他蒽醌类化合物，如决明素、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素等，而据文献报道，蒽醌类化合物及其衍生物有明显的毒性。因此，建立准确、快速、可靠的决明子中多种蒽醌类化合物的同时分析方法对决明子的质量控制及安全评估有重要意义。
5.目前中草药中蒽醌类化合物的提取主要采用有机溶剂浸渍提取、热回流提取、索氏提取、超声波辅助提取等方法。但通常使用有毒的有机溶剂，对操作人员的身体健康及环境都有明显的危害。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种简单、方便、灵敏的天然低共熔溶剂超声提取结合超高效液相色谱-二极管阵列法以同时检测决明子中7种蒽醌类化合物（橙黄决明素、大黄酚、决明素、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素和大黄酸）。
7.本发明的技术方案：一种基于天然低共熔溶剂超声提取，结合超高效液相色谱-二极管阵列法实现决明子中7种蒽醌类化合物（橙黄决明素、大黄酚、决明素、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素和大黄酸）的分析方法。决明子中7种蒽醌类内源性物质用8%的盐酸，在98℃水浴锅中水解，水解完成后，冷却至室温，加入nades，涡旋振荡后超声提取，离心后收集上清液，过膜后供uhplc-pda分析。
8.本发明主要包括以下几个步骤：天然低共熔溶剂的制备；超高效液相色谱条件；7种蒽醌类物质的同时检测；样品的前处理；样品的检测。
9.一种基于天然低共熔溶剂超声提取结合超高效液相色谱法同时检测决明子中7种蒽醌类化合物的分析方法，其特征在于：主要包括以下几个步骤：（1）天然低共熔溶剂的制备采用加热搅拌的方式制备nades。分别称取d-葡萄糖、乳酸和水，按1:5:4的摩尔比
混合，置于油浴锅中，在80～100℃温度下，磁力搅拌加热30～60 min，直至形成均匀透明的液体。将制备好的nadess储存在玻璃瓶中并密封，置于硅胶干燥器皿中，直至恒重。
10.（2）超高效液相色谱条件本发明中所使用的仪器是acquity uplc h-class plus超高效液相色谱仪（美国waters公司），配有acquity四元梯度泵、acquity ftn自动进样器、acquity柱温箱和acquity fda二极管阵列检测器。色谱条件： acquity uplc
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beh c18 色谱柱（2.1 mm
×
100 mm，1.8 μm，waters，usa）；柱温：25 ℃；流动相：a相为0.1% (v/v) 甲酸水溶液，b相为乙腈；梯度洗脱程序：0~1 min，30% b；3~6 min，45% b；9~12 min，80% b；12.1~14 min，30% b；流速：0.3 ml/min；进样量：5 μl；芦荟大黄素、大黄酸和大黄酚的检测波长为254 nm，决明素、橙黄决明素、大黄素和大黄素甲醚的检测波长为284 nm。
11.（3）7种蒽醌类化合物的同时检测配制一系列质量浓度的7种蒽醌类化合物混合标准溶液，在上述液相色谱条件下进行测定，以各组分峰面积y对质量浓度x进行线性回归，得到线性回归方程。橙黄决明素与大黄酚在0.08 ~ 60 mg/l范围内，芦荟大黄素、大黄酸与大黄素甲醚0.08 ~10 mg/l内，决明素和大黄素在0.08 ~ 20 mg/ l时呈现良好的线性关系（r2≥0.9943）。7种目标分析物的检出限（lod）和定量限（loq）分别在1.00~7.26 μg/l和3.29~24.22 μg/l范围内。
12.（4）样品前处理称取0.2 g（精确至0.001g）决明子样品粉末于50 ml聚丙烯离心管中，加入5.0 ml 8%的盐酸，在98℃水浴锅中水浴水解1 h。水解完成后，冷却至室温，在离心管中加入20 ml nades，涡旋振荡1 min，使nades与水解液充分混匀，以100 w的功率，60 ℃超声提取20 min，10000 rpm离心10 min，收集上清液，经0.22 μm有机过滤膜过滤，供uhplc分析。
13.（5）样品检测取0.2 g样品，分别添加高、中、低三个不同水平的蒽醌类化合物混合标准溶液，按上述样品前处理方法对样品进行处理后，进行uhplc分析，计算样品加标回收率。
14.本发明的有益效果：本发明设计了一种基于天然低共熔溶剂超声提取结合超高效液相色谱法同时检测决明子中7种蒽醌类化合物的方法，可简便、快速、灵敏、准确地检测决明子中7种蒽醌类化合物，为决明子的质量控制及安全评估提供技术手段。
附图说明
15.图1 a)为七种蒽醌标准混合溶液的色谱图； b) 决明子样品色谱图； c) 决明子加标样品色谱图1：橙黄决明素；2：芦荟大黄素；3：大黄酸；4：决明素；5：大黄素；6：大黄酚；7：大黄素甲醚。
具体实施方式
16.实施例1：天然低共熔溶剂的制备：分别称取d-葡萄糖39.69 g、乳酸90.08 g和水14.40 g，其摩尔比为1:5:4，置于油浴锅中混合均匀，在80～100℃温度下，磁力搅拌加热30～60 min，直至形成均匀透明的液体。将制备好的nades储存在玻璃瓶中并密封，置于硅胶干燥器
皿中，直至恒重。
17.实施例2：采用acquity uplc h-class plus超高效液相色谱仪（美国waters公司），配有acquity四元梯度泵、acquity ftn自动进样器、acquity柱温箱和acquity fda二极管阵列检测器。色谱条件： acquity uplc
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beh c18 色谱柱（2.1 mm
×
100 mm，1.8 μm，waters，usa）；柱温：25 ℃；流动相：a相为0.1% (v/v) 甲酸水溶液，b相为乙腈，梯度洗脱程序如表 1 所示；流速：0.3 ml/min；进样量：5 μl；芦荟大黄素、大黄酸和大黄酚的检测波长为254 nm，决明素、橙黄决明素、大黄素和大黄素甲醚的检测波长为284 nm。
18.实施例3：配制一系列质量浓度的7种蒽醌类化合物混合标准溶液，在优化好的色谱条件下进行测定，以各组分峰面积y对质量浓度x绘制标准曲线（见表2），7种目标化合物在线性范围内呈良好的线性关系（r2≥0.9943），检出限（lod）和定量限（loq）分别在1.00~7.26μg/l和3.29~24.22 μg/l范围内。
19.实施例4：样品的前处理：称取0.2 g（精确至0.001g）决明子样品粉末于50 ml聚丙烯离心管
中，加入5.0 ml 8%的盐酸，在98℃水浴锅中水浴水解1 h。水解完成后，冷却至室温，在离心管中加入20 ml nades，涡旋振荡1 min，使nades与水解液充分混匀，以100 w的功率，60 ℃超声提取20 min，10000 rpm离心10 min，收集上清液，经0.22 μm有机过滤膜过滤，供uhplc-pda分析。
20.实施例5：取0.2 g样品，分别添加高、中、低三个不同水平的蒽醌类化合物混合标准溶液，按上述样品前处理方法对样品进行处理后，进行uhplc-pda分析，计算样品加标回收率和精密度，结果见表3。
21.以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本领域的普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案和发明构思，作出相应改变和替代，而且性能或用途相同，都应当视为本发明的保护范围。