苹果酸酶2在制备矽肺病或肺纤维化相关疾病诊断试剂或治疗药物中的应用

1.本发明属于医疗和医药技术领域，尤其涉及苹果酸酶2在制备矽肺病或肺纤维化相关疾病诊断试剂或治疗药物中的应用。


背景技术：

2.尘肺(pneumoconiosis)是在长期吸入不同致病性的粉尘引起的以弥漫性肺纤维化为主的一组肺部疾病的统称，是全球主要职业病。尘肺病后期可导致严重的肺功能障碍，根据吸入粉尘种类的不同，尘肺可分为煤工尘肺、石棉肺、矽肺以及其他种类。矽肺(silicosis)是尘肺中最常见的一种亚型，是由于长期吸入游离的二氧化硅结晶并在肺内潴留导致的肺部纤维化疾病，其主要病理特征为弥漫性间质纤维化以及硅结节的形成。生产性粉尘中二氧化硅诱导肺纤维化的能力最强，二氧化硅刺激诱导的矽肺病也是尘肺病中病情最严重的。近年来由于新兴行业中对二氧化硅的引入认识不足且疏于控制，全球尘肺病尤其矽肺病发病率呈现逐年上升趋势。
3.矽肺病的发生发展会经历慢性炎症反应和纤维化进展两个阶段。二氧化硅粉尘的吸入和潴留会促进肺组织的炎性相关细胞发生炎性反应，释放多种细胞因子，进而促进了成纤维细胞的增生，产生了肺部的纤维化。其中，肺组织中的巨噬细胞起到了主导性作用。二氧化硅进入肺部以后首先会被肺泡巨噬细胞表面受体(清道夫受体，scavengerreceptor)识别并将其吞噬，被吞噬的二氧化硅晶体与胞内溶酶体融合形成吞噬小体。二氧化硅晶体无法被消化，会引起肺泡巨噬细胞的自噬溶酶体系统异常，进而促进了慢性炎性反应和纤维化进程。肺组织中性粒细胞和淋巴细胞的招募可能加重了炎性反应并促进了后续的纤维化进程。白细胞介素6(il-6)、白细胞介素1β(il-1β)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)和转化生长因子β(tgf-β)等细胞因子，也参与了炎性反应和纤维化的进程。肺纤维化会严重影响病人的呼吸功能，后期可发展为肺功能障碍。现有的治疗药物尽管可以减轻肺部的炎性反应、延缓肺组织由炎性反应发展到纤维化阶段的时间，但无法在患者中逆转肺纤维化。因此仍然急需筛选有效改善肺纤维化的作用靶点用于肺纤维化的治疗。
4.越来越多的研究表明，代谢重编程可以影响纤维化等非肿瘤性疾病(如特发性肺纤维化，ipf)，而肺部纤维化和癌症之间有相当大部分的机制重叠，其中就包括一些共有的代谢特征，如糖酵解速率升高、糖酵解相关酶高表达、丝氨酸-甘氨酸的从头合成增强等。此外，代谢重编程可以影响巨噬细胞的功能，进而影响炎性反应，如三羧酸循环的中间代谢产物琥珀酸能够响应lps刺激而增加并促进巨噬细胞向m1型极化。三羧酸循环的重要代谢产物α-kg可抑制m2型巨噬细胞中的hif-1α和il-1β。
5.苹果酸酶(malic enzyme，me)是三羧酸循环过程中调控苹果酸代谢的关键酶，催化苹果酸氧化脱羧为丙酮酸并伴随烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，nadph)产生的可逆反应。目前哺乳动物中已鉴定出三种亚型的苹果酸酶，它们分别由三个同源基因编码，根据其在细胞内分布和辅酶特异性分别命名为：
胞质nadp依赖的me(me1)，线粒体nad(p)依赖的me(me2)和线粒体nadp依赖的me(me3)，其中，me1和me2是主要的亚型。nad(+)依赖的线粒体苹果酸酶2(me2)可以催化苹果酸生成丙酮酸和co2，同时将nad(+)还原成nadh，可以调节氧化还原平衡反应、细胞能量代谢和分子的生物合成。me2在多种癌症中显著高表达，多项研究表明，其可以作为癌症诊断的新型生物标记物和治疗的药物靶点，靶向me2可显著抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。实验表明，me2在矽肺病导致的纤维化肺组织中显著高表达，但是me2在肺纤维化中的功能仍不清楚。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提供苹果酸酶2在制备矽肺病或肺纤维化相关疾病诊断试剂或治疗药物中的应用，为探寻肺纤维化相关疾病肺部炎性反应和肺纤维化靶点药物提供支持。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
8.苹果酸酶2在制备矽肺病或肺纤维化诊断试剂或治疗药物中的应用。
9.优选的是，所述苹果酸酶2作为筛查矽肺病或肺纤维化相关疾病的生物标志物，应用到制备诊断或治疗矽肺病或肺纤维化相关疾病的相关产品中。
10.优选的是，所述矽肺病或肺纤维化相关疾病包括矽肺病肺部炎性反应和肺纤维化。
11.优选的是，通过检测肺组织苹果酸酶2的表达水平进行肺部炎性反应和纤维化的诊断。
12.更优选的是，所述检测包括苹果酸酶2的mrna和/或蛋白水平。
13.优选的是，敲除巨噬细胞中苹果酸酶2基因，降低肺部炎性因子水平。
14.优选的是，敲除巨噬细胞中苹果酸酶2基因，降低肺组织中的羟脯氨酸含量，降低肺纤维化程度。
15.相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
16.本发明提供了苹果酸酶2在制备矽肺病或肺纤维化相关疾病诊断试剂或治疗药物中的应用。本发明研究结果表明苹果酸酶2敲除明显减轻了矽肺病小鼠的炎性反应和纤维化病变。基于以上研究结果，本发明提出了苹果酸酶2在治疗矽肺病或肺纤维化相关疾病肺部炎性反应和肺纤维化病变中的应用。通过抑制苹果酸酶2的表达，从而减轻矽肺病或肺纤维化相关疾病的炎性反应和纤维化病变，为探寻矽肺病或肺纤维化相关疾病肺部炎性反应和肺纤维化靶点药物提供支持。
附图说明
17.图1：尘肺病人肺组织me2水平实验结果示意图。a.real-time qpcr检测结果图；b.westernblot检测结果图。actin作为real-time qpcr检测和westernblot检测的内参。
18.图2：尘肺病模型小鼠肺组织me2水平实验结果示意图。a.real-time qpcr检测结果图；b.westernblot检测结果图。actin作为real-time qpcr检测和westernblot检测的内参。
19.图3：尘肺病人与尘肺病模型小鼠肺组织中me2细胞定位实验结果示意图；a图和b
图为单细胞测序结果分析图；c图为尘肺病患者肺组织切片免疫荧光染色结果图；d图为矽肺病模型小鼠肺组织切片免疫荧光染色结果图。
20.图4：尘肺病模型小鼠肺组织中炎性因子mrna表达水平实验结果示意图。a.小鼠肺组织中il-1βmrna表达水平；b.小鼠肺组织中il-6mrna表达水平；c.小鼠肺组织中tnf-αmrna表达水平。me2
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为巨噬细胞条件敲除对照小鼠，me2
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为巨噬细胞条件性敲除me2小鼠(n＝12，*，p《0.05，**，p《0.01，***，p《0.001,****,p《0.0001)。actin作为real-time qpcr检测的内参。
21.图5：尘肺病模型小鼠肺泡灌洗液中炎性因子水平实验结果示意图。a.小鼠肺泡灌洗液中il-1β表达水平；b.小鼠肺泡灌洗液中il-6表达水平；c.小鼠肺泡灌洗液tnf-α表达水平。me2
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为巨噬细胞条件敲除对照小鼠，me2
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为巨噬细胞条件性敲除me2小鼠(n＝12，*，p《0.05，**，p《0.01，***，p《0.001,****,p《0.0001)。
22.图6：尘肺病模型小鼠肺组织中炎性反应和胶原堆积实验结果图。a.he染色结果图；b.炎性反应评分结果图；c.masson染色结果图；d.纤维化评分结果图。me2
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为巨噬细胞条件敲除对照小鼠，me2
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为巨噬细胞条件性敲除me2小鼠(n＝12，*，p《0.05，**，p《0.01，***，p《0.001,****,p《0.0001)。
23.图7：尘肺病模型小鼠肺组织中纤维化标记物col1a1表达水平实验结果示意图。a.小鼠肺组织中col1a1 mrna表达结果图，actin作为real-time qpcr检测的内参照；b.小鼠肺组织中col1a1阳性面积统计图。c.小鼠肺组织中col1a1免疫组化图。me2
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为巨噬细胞条件敲除对照小鼠，me2
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为巨噬细胞条件性敲除me2小鼠(n＝12，*，p《0.05，**，p《0.01，***，p《0.001,****,p《0.0001)。
24.图8：尘肺病模型小鼠肺组织纤连蛋白fibronectin表达结果示意图。a.fibronectin mrna水平实验结果图；b.fibronectin蛋白表达水平结果图；c.fibronectin蛋白表达情况统计图。me2
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为巨噬细胞条件敲除对照小鼠，me2
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为巨噬细胞条件性敲除me2小鼠(n＝12，*，p《0.05，**，p《0.01，***，p《0.001,****,p《0.0001)。actin作为western blot检测的内参照。
25.图9：尘肺病模型小鼠肺组织羟脯氨酸检测结果示意图。me2
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为巨噬细胞条件敲除对照小鼠，me2
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为巨噬细胞条件性敲除me2小鼠(n＝12，*，p《0.05，**，p《0.01，***，p《0.001,****,p《0.0001)。
26.图10：5例尘肺病人的肺组织病理切片。
具体实施方式
27.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
28.实施例1
29.me2在尘肺病人和小鼠动物模型的肺组织中表达显著
30.本发明利用收集的5例正常人和5例尘肺病人的肺组织，提取蛋白质和rna后通过qpcr和western blot检测苹果酸酶me2的表达水平。结果发现与正常人相比，尘肺病人肺组织中me2的mrna和蛋白水平都显著上调(图1)。本发明样本来自于中日友好医院的尘肺病人肺移植样本，本研究获得中国医学科学院基础医学研究所伦理审查委员会批准(项目编号：
062-2019)，所有受试者均签署知情同意书。
31.表15例尘肺病人的肺组织病理切片
32.患者性别病历病理切片1男尘肺，间质性肺病，胃食管反流图10a2男尘肺，肺结核史图10b3男矽肺病图10c4男间质性肺病。既往十年接触煤炭史图10d5男间质性肺疾病，肺结核史，煤矿工作十余年图10e
33.为了进一步明确me2在尘肺病中的表达改变，我们采用600mg/kg剂量的silica对小鼠进行单次气管滴注造模，6周后造模结束收取小鼠肺组织，利用qpcr和western blot检测小鼠肺组织中me2的mrna和蛋白的表达水平。结果显示，与对照组(pbs)相比，矽肺病模型小鼠肺组织中me2的mrna和蛋白水平均上调(图2)。这一结果与上述尘肺患者的肺组织中me2表达改变趋势相一致。
34.实施例2
35.me2主要表达在肺组织的巨噬细胞
36.肺是由多种类型细胞有序构成的异质性器官，为了进一步探索me2发挥功能的效应细胞，本发明利用矽肺病模型小鼠的肺组织单细胞转录组数据分析发现，silica刺激后me2的表达量显著升高，并且me2主要在巨噬细胞中(图3a和图3b)。随后又利用免疫荧光共定位技术进行验证。结果发现，me2在尘肺病患者和模型小鼠肺组织中的巨噬细胞均高表达(图3c和图3d)。巨噬细胞是已知的矽肺病发生发展过程中最重要的效应细胞，其对粉尘的吞噬和溶酶体的破损以及细胞代谢水平的改变等生物学过程可能激活了下游的免疫炎性反应以及纤维化通路。在矽肺病进展过程中me2的上调可能通过改变巨噬细胞功能促进疾病进展。
37.实施例3
38.巨噬细胞条件性敲除me2显著缓解尘肺病模型小鼠肺组织炎性因子的分泌和炎性细胞浸润。
39.为了进一步明确巨噬细胞中高表达的me2在尘肺病的功能，本发明利用巨噬细胞条件性敲除me2小鼠构建了尘肺疾病模型，收集正常小鼠和模型小鼠的肺组织和肺泡灌洗液，利用real-time qpcr检测小鼠肺组织中炎性因子il-1β、il-6和tnf-α的mrna表达水平(图4)，同时利用elisa检测肺泡灌洗液中这三个炎性因子的表达水平(图5)。此外还利用he染色检测肺组织中炎性细胞浸润(图6a和图6b)。综合以上三个结果发现，与对照组相比，巨噬细胞条件性敲除me2小鼠的肺组织中炎性因子il-1β、il-6和tnf-αmrna和分泌水平显著降低，肺组织中炎性细胞浸润程度明显改善。因此得出结论，敲除巨噬细胞中高表达的me2可以减低尘肺病肺组织中炎性因子的分泌，缓解肺部炎性反应。
40.实施例4
41.巨噬细胞条件性敲除me2显著降低尘肺病模型小鼠肺组织的纤维化水平。
42.为了确定巨噬细胞条件性敲除me2对肺纤维化的影响，本发明对尘肺模型小鼠的肺组织石蜡切片进行了masson染色，结果显示(图6c和图6d)巨噬细胞条件性敲除me2后小鼠肺组织的纤维化程度明显降低。同时，本发明个利用real-time qpcr、免疫组化和
western blot检测了上述尘肺模型小鼠肺组织的肺部纤维化标志蛋白collagen i(col1a1)和fibronectin(fn-1)的mrna和蛋白表达水平。发现与对照组相比，巨噬细胞条件性敲除me2后尘肺模型小鼠肺组织中col1a1和fn-1的mrna和蛋白水平均出现显著性的降低(图7和图8)。此外，我们检测了小鼠肺组织中的羟脯氨酸(hyp)含量，直接检测肺组织中的胶原沉积，判断肺纤维化程度。结果显示，巨噬细胞条件性敲除me2后，尘肺小鼠肺组织中的hyp含量降低约20％(图9，p《0.05)。以上结果证明巨噬细胞条件性敲除me2能够显著降低尘肺病模型小鼠肺组织的纤维化水平。
43.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。