一种基于磁微粒化学发光法检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的试剂、试剂盒和方法与流程

是lc-ms-ms法需要多次重复提取,具有操作繁琐、复杂、费时费力、通量低等的缺点，满 足不了临床高通量、快速准确的检测需求。如申请号为cn201910630169.8的专利文献公开了 一种检测血液中阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的方法，该方法是基于液质联用法测定血液中阿立 哌唑和脱氢阿立哌唑，且需要对血液样本进行前处理。如申请号为cn201910671626.8的专利 文献公开了一种血液中阿立哌唑药物浓度监测试剂盒及其检测方法，该检测方法是基于多维 在线固相萃取液相色谱分析技术开发的。
6.如申请号为cn201380054988.3的专利文献公开了一种阿立哌唑半抗原的抗体及其用 途，其制备的抗体可以同时识别阿立哌唑和脱氢阿立哌唑；但是，该专利文献并没有披露该 抗体测试临床样本的特异性、以及对阿立哌唑无活性代谢物(hydroxylation和n-dealkylation 阿立哌唑)的交叉反应性。同时，申请号为cn201911043578.4的专利文献公开了一种阿立哌 唑人工抗原及其制备方法，其利用该人工抗原制备的抗体可以用于检测阿立哌唑含量，但是 该专利文献也没有披露该的抗体对阿立哌唑代谢物的特异性。
7.因此，获得高质量阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的抗体，以建立特异性强、灵敏度高的阿 立哌唑和脱氢阿立哌唑的免疫学检测方法，对制定阿立哌唑个体化剂量方案，评价其临床疗 效及安全性，有十分重要的意义。


技术实现要素：

8.为了提高同时检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的特异性、灵敏度，本技术提供一种基于 磁微粒化学发光法检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的试剂、试剂盒和方法。
9.第一方面，本技术提供的一种基于磁微粒化学发光法检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓 度的试剂，采用如下技术方案：一种基于磁微粒化学发光法检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的试剂，所述试剂包括：酶标工作液：包含由半抗原和酶标记物通过偶联法偶联得到的半抗原-酶标记物偶联物；磁标工作液：包含由抗体和磁性标记物通过偶联法偶联得到的抗体-磁性标记物偶联物；指示剂溶液：包含用于定量检测酶标记物浓度的指示剂；其中，所述半抗原的结构式如式(i)所示：所述半抗原和载体蛋白通过偶联法得到抗原；所述抗体是响应于所述抗原而生成的。
10.在一些实施方式中，在半抗原-酶标记物偶联物中，所述酶标记物为碱性磷酸酶，所述 指示剂为用于定量检测碱性磷酸酶含量的发光底物。
11.在一些实施方式中，在半抗原-酶标记物偶联物中，所述半抗原和酶标记物的重量比为 1:(1.5～2.5)，例如1:2。
12.在一些实施方式中，在半抗原-酶标记物偶联物中，所述半抗原和酶标记物通过偶联剂 偶联得到所述半抗原-酶标记物偶联物。其中，所述半抗原和所述偶联剂的重量比为1:(1.5～ 2.5)，例如1:2。所述偶联剂为碳化二亚胺类偶联剂。所述碳化二亚胺类偶联剂包括但不限于 n,n'-二环己基碳二亚胺(简称dcc，cas号538-75-0)、n,n'-二异丙基碳二亚胺(简称dic， cas号693-13-0)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(简称edc，cas号 25952-53-8)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(简称edci，cas号7084-11-9)。
13.在一些实施方式中，所述半抗原-酶标记物偶联物在所述酶标工作液中的浓度为(0.5～ 5)ug/ml，例如1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml。
14.在一些实施方式中，所述半抗原-酶标记物的制备方法包括以下步骤：s4-1、将酶标记物溶解在pbs缓冲液中，得酶标记物溶液；s4-2、将上述半抗原溶解在二甲基亚砜中，得到半抗原溶液；s4-3、将步骤s1-1得到的碱性磷酸酶溶液和步骤s1-2得到的半抗原溶液混合均匀，加入偶 联剂，室温混匀(1～3)h；之后，透析到pbs缓冲液中得到所述半抗原-酶标记物偶联物。
15.在一些实施方式中，所述酶标工作液的制备方法，包括以下步骤：用50mmol/l mes 0.9％nacl 5mg/ml bsa 1mm mgcl
2 ph＝6.7将所述半抗原-酶标记物偶联物 稀释，得到酶标工作液。
16.在一些实施方式中，步骤s4-1中，所述酶标记物在所述酶标记物溶液中的浓度为(0.1～ 2)mg/ml，例如1mg/ml。所述缓冲液可以为pbs缓冲液。
17.在一些实施方式中，在步骤s4-2中，所述半抗原在所述半抗原溶液中的浓度为(4～ 6)mg/ml。
18.在一些实施方式中，在所述抗原中，所述半抗原和所述载体蛋白的摩尔比为1:(0.010～ 0.020)，例如1:0.014。
19.在一些实施方式中，在所述抗原中，所述半抗原和所述载体蛋白通过偶联剂偶联得到 所述抗原。所述半抗原和所述偶联剂的摩尔比为1:(2～3)，例如1:2.43。其中，所述偶联剂为 碳化二亚胺类偶联剂。所述碳化二亚胺类偶联剂包括但不限于n,n'-二环己基碳二亚胺(简称 dcc，cas号538-75-0)、n,n'-二异丙基碳二亚胺(简称dic，cas号693-13-0)、1-乙基-(3
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二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(简称edc，cas号25952-53-8)和1-(3-二甲基氨基丙 基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(简称edci，cas号7084-11-9)。
20.在一些实施方式中，所述抗原的制备方法包括以下步骤：s2-1、将半抗原溶解于二甲基亚砜中得半抗原的二甲基亚砜溶液；s2-2、将偶联剂溶解于水中得偶联剂的水溶液；s2-3、将步骤s2-1得到的半抗原的二甲基亚砜溶液和步骤s2-2得到的偶联剂水溶液混合， 室温反应0.5～2小时，得半偶联反应液；s2-4、将载体蛋白溶解于缓冲液中，得载体蛋白溶液；s2-5、将步骤s2-4得到的载体蛋白溶液和步骤s2-3得到的半偶联反应液混合，室温搅拌1～ 3小时得偶联反应液；s2-6、将步骤s2-5得到的偶联反应液透析到缓冲液中，得到所述抗原。
0.1mg/ml～1mg/ml，例如0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、 0.8mg/ml、0.9mg/ml。
33.在一些实施方式中，所述磁标工作液的制备方法，包括以下步骤：s5-1、将磁性标记物50mg的dynal beads m280 tosyl磁微粒稀释于2ml的bb缓冲液 (50mmol/l，ph＝8.0)中，得到磁性标记物溶液；s5-2、向磁性标记物溶液中加入所述抗体并混匀后，在(30～40)℃(例如37℃)下震荡反应(5～ 10)h(例如8h)，得到抗体-磁性标记物偶联物溶液；s5-3、磁吸去除上清液，加入tbst缓冲液(50mmol/l tris 0.9％nacl 0.1％tw20，ph＝7.4) 并使磁微粒的浓度达到0.5mg/ml，在37℃下反应2h；s5-4、磁吸去除上清液，加入tbst缓冲液(50mm tris 0.9％nacl 0.1％tw20，ph＝7.4)并使 磁微粒的浓度达到0.4mg/ml，得到磁标工作液。
34.在一些实施方式中，步骤s5-1中，所述磁性标记物在所述磁性标记物溶液中的浓度为 (20～30)mg/ml。
35.第二方面，本技术提供的一种基于磁微粒化学发光法检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓 度的试剂盒，采用如下技术方案：一种基于磁微粒化学发光法检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的试剂盒，所述试剂盒包括所述试 剂。
36.在一些实施方式中，所述试剂盒可以用于尿液样本或者血液样本的检测。
37.第三方面，本技术提供的一种基于磁微粒化学发光法检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的 方法，采用如下技术方案：一种基于磁微粒化学发光法检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的方法，所述方法基于所述剂； 所述方法包括以下步骤：s10、标准曲线的建立以阿立哌唑和/或脱氢阿立哌唑的标准品作为标准品，配制标准品溶液；将标准品溶液、磁微粒液工作液和酶标工作液混合均匀，并经过孵育反应、清洗后，加入指 示剂溶液显色并采集400～550nm光信号的相对光单位；以标准品溶液的浓度作为横坐标，以标准品溶液的相对光单位作为纵坐标，绘制标准曲线， 计算得到线性回归方程；s20、检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度将待测样本、磁微粒液工作液和酶标工作液混合均匀，并经过孵育反应、清洗后，加入指示 剂溶液显色并采集400nm～550nm光信号的相对光单位；根据所述线性回归方程，计算出所述待测样本的相对光单位在标准曲线上所对应横坐标的浓 度。
38.在一些实施方式中，所述标准品溶液的浓度范围为0ng/ml～1200ng/ml。
39.在一些实施方式中，所述待测样本源自血液或尿液。
40.综上所述，本技术具有以下有益效果：由于本技术采用的抗原和抗体，具有能够同时识别阿立哌唑及其活性代谢产物脱氢阿立哌唑 的能力，同时具备优于相关技术的抗体特异性，即与阿立哌唑的无活性代谢产物 hydroxylation-阿立哌唑和n-dealkylation-阿立哌唑无交叉反应。因此，本技术基于
磁微粒化 学发光法检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的试剂、试剂盒和方法，提高了同时检测阿立哌 唑和脱氢阿立哌唑的特异性，并且具有灵敏度高、重复性好的优点。
附图说明
41.图1是本技术中半抗原的核磁共振氢谱图；图2是本技术中半抗原、牛血清白蛋白、抗原的native-page电泳鉴定结果；图3是本技术中阿立哌唑浓的标准曲线；图4是本技术中脱氢阿立哌唑的标准品溶液的标准曲线。
具体实施方式
42.以下结合附图和实施例对本技术作进一步详细说明。
43.用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的半抗原的制备半抗原的合成路线为：
44.半抗原的制备方法为：式(i)所示的阿立哌唑和式(ii)所示的烷基醇发生酰胺醇解反应生 成式(iii)所示的化合物；式(iii)所示的化合物再顺次经过水解反应和中和反应，得到式(i)所示 的半抗原。
45.在式(ii)所示的烷基醇为甲醇时，半抗原的制备方法，具体包括以下步骤：阿立哌唑的半抗原的制备方法，具体包括以下步骤：s1-1、式(iii)所示的化合物的合成：称取阿立哌唑(4.5g，10mmol)和甲醇(20ml，15.836g，494mmol)搅拌溶解，并加入到50ml 三口瓶中，控制温度在5～15℃范围内缓慢滴加浓硫酸(1.5g)，之后升温至40～45℃并在40～ 45℃下反应2小时。反应结束后加水60ml，降温至5～10℃后用液碱调ph＝8.5，
加入乙酸 乙酯40ml搅拌20分钟静置分层，得到有机层(即式(iii)所示的化合物的乙酸乙酯溶液)。
46.s1-2、式(i)所示的半抗原的合成：有机层通过减压浓缩蒸出乙酸乙酯，蒸干乙酸乙酯后加水50ml；之后，先用液碱调ph＝12， 室温水解反应30分钟；再加入乙酸乙酯30ml，并用稀硫酸调节ph＝4.5，搅拌20分钟静置 分层，得到有机层。向有机层中加入二氯甲烷100ml，降温至0～5℃搅拌结晶2小时，过滤， 滤饼干燥后，得到式(i)所示的半抗原(3.5g，收率75.2％)。
47.半抗原的表征：半抗原的核磁共振氢谱图如图1所示。由图1可以看出，式(i)所示的 阿立哌唑的半抗原制备成功。
48.用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的抗原的制备抗原的制备方法，具体包括如下步骤：s2-1、称取10mg的阿立哌唑的半抗原溶解于1ml的二甲基亚砜中得半抗原的二甲基亚砜溶 液；s2-2、称取10mg的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐溶解于100ul的水中得偶 联剂的水溶液；s2-3、将步骤(1)的半抗原的二甲基亚砜溶液和步骤(2)的偶联剂的水溶液混合，室温反应1小 时，得到半偶联反应液；s2-4、称取20mg的载体蛋白溶解于5ml的pbs缓冲液中，得载体蛋白溶液；在本具体实施 方式中载体蛋白为牛血清白蛋白；s2-5、将步骤(4)的载体蛋白溶液和步骤(3)的反应液混合，室温搅拌2小时得偶联反应液；s2-6、用pbs缓冲液对步骤(5)的偶联反应液透析四次，且每次透析时偶联反应液和pbs缓冲 液的体积比为1:500，得到抗原。
49.抗原的表征：将牛血清白蛋白(bsa)和由半抗原和牛血清白蛋白偶联后的抗原(bsa
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阿立哌唑衍生物)进行native-page电泳鉴定图如图2所示。由图2可以看出，偶联后的抗 原比单独的牛血清白蛋白在电泳上表现出更快的电泳速度，表明抗原制备成功。
50.用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的抗体的制备抗体可以为单克隆抗体和多克隆抗体。其中，单克隆抗体和多克隆抗体的制备均可以采用本 领域公知的技术，即经典的杂交瘤细胞融合技术。
51.其中，单克隆抗体的抗体的制备方法，具体包括如下步骤：s3-1、抗原的接种至宿主：采用pbs缓冲液将阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的抗原稀释到1mg/ml， 加入等体积的弗氏完全佐剂，乳化完全，小鼠按照0.1mg/只的剂量进行首次免疫；间隔四周 后，称取1mg的阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的抗原和1mg的弗式不完全佐剂混合并在搅拌速度 为2000rpm/min的条件下搅拌2小时完成乳化，经过首次免疫的小鼠按照0.1mg/只的剂量进 行加强免疫；
s3-2、将来自接种宿主的脾细胞系与sp2/0细胞融合，采用阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的抗原 包被elisa 96孔板，对融合细胞采用间接elisa法和间接竞争elisa法分别进行效价及竞 争测定，筛选得到对阿立哌唑竞争最好的3株细胞株，分别命名为45f2，1b2，21g7。
52.其中，45f12杂交瘤细胞株，于2022年05月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心(简称：cgmcc；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学 院微生物研究所；邮编100101)，保藏编号为cgmcc no.45162。
53.表1：45f2细胞株的细胞上清的间接竞争elisa结果表2：1b2细胞株的细胞上清的间接竞争elisa结果表2：1b2细胞株的细胞上清的间接竞争elisa结果表3：21g7细胞株的细胞上清的间接竞争elisa结果交叉反应率的计算公式为：
54.结合表1～3可知，45f2细胞株产生的抗体表现出对阿立哌唑及其活性代谢产物脱氢 阿立哌唑几乎一致的识别效率，并且对阿立哌唑的无活性代谢产物hydroxylation-阿立哌唑和 n-dealkylation-阿立哌唑交叉反应非常低。因此，45f2细胞株产生的抗体适合
同时检测阿立哌 唑和脱氢阿立哌唑浓度。
55.这可能是由于本技术的半抗原的衍生位点远离阿立哌唑和脱氢阿立哌唑共同的特征 结构，因此，本技术的抗体能够等效识别阿立哌唑和活性代谢物脱氢阿立哌唑。此外，本申 请的抗体对无活性代谢物hydroxylation-阿立哌唑和n-dealkylation-阿立哌唑无交叉反应。并 且，本技术的半抗原中创新性的去除掉了脱氢阿立哌唑的特征结构，且采用一个极短的连接 臂同载体蛋白偶联，因此可以同时识别阿立哌唑和脱氢阿立哌唑，这对于阿立哌唑及其活性 代谢产物脱氢阿立哌唑的测定非常有利。
56.综上所述，本技术所提供的抗原和抗体，具有能够同时识别阿立哌唑及其活性代谢产 物脱氢阿立哌唑的能力，同时具备优于相关技术的抗体特异性，即同阿立哌唑的无活性代谢 产物hydroxylation-阿立哌唑和n-dealkylation-阿立哌唑无交叉反应。因此，本技术所提供的 阿立哌唑的抗原和抗体能够建立准确监测血液和尿液中阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的免疫 学检测方法。
57.基于磁微粒化学发光法构建检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的方法基于磁微粒化学发光法检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的试剂基于磁微粒化学发光法检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的试剂包括：酶标工作液：包含由半抗原和酶标记物通过偶联法偶联得到的半抗原-酶标记物偶联物；磁标工作液：包含由抗体和磁性标记物通过偶联法偶联得到的抗体-磁性标记物偶联物；指示剂溶液：包含用于定量检测酶标记物浓度的指示剂。
58.其中，所述半抗原-酶标记物偶联物的制备方法，包括以下步骤：s4-1、将碱性磷酸酶(简称alp，1mg)溶解在pbs缓冲液(1ml)中，得酶标记物溶液；s4-2、将上述半抗原(0.5mg)溶解在二甲基亚砜(简称dmso，100ul)中，得到半抗原溶 液；s4-3、将步骤s1-1得到的碱性磷酸酶溶液和步骤s1-2得到的半抗原溶液混合均匀，加入1mg 的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称edci，cas号7084-11-9)，室温混匀 2h；之后，透析到pbs缓冲液中，得到半抗原-酶标记物偶联物。
59.酶标工作液的制备方法，包括以下步骤：再用50mmol/l mes 0.9％nacl 5mg/ml bsa 1mm mgcl
2 ph＝6.7将上述半抗原-酶标记物偶联 物稀释到1ug/ml，得到酶标工作液。
60.磁标工作液的制备方法，包括以下步骤：s5-1、将50mg的dynal beads m280 tosyl磁微粒稀释于2ml的bb缓冲液(50mm，ph＝8.0) 中得磁性标记物溶液；s5-2、向磁性标记物溶液中加入1mg的阿立哌唑抗体45f2并混匀后，在37℃下震荡反应8h， 得到磁微粒-抗体混合液；s5-3、磁吸去除上清液，加入tbst缓冲液(50mmol/l tris 0.9％nacl 0.1％tw20，ph＝7.4) 并使磁微粒的浓度达到0.5mg/ml，在37℃下反应2h；s5-4、磁吸去除上清液，加入tbst缓冲液(50mm tris 0.9％nacl 0.1％tw20，ph＝7.4)并使 磁微粒的浓度达到0.4mg/ml，得到磁标工作液。
61.指示剂溶液为：商品化的amppd发光液。
62.基于磁微粒化学发光法检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的方法 基于磁微粒化学发光法检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的方法，包括以下步骤：s10、标准曲线 的建立；s20、检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度。
63.s10、标准曲线的建立以阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的标准品作为标准品，并采用小牛血清基质配制标准品溶液，标 准品溶液的浓度分别为0ng/ml、50ng/ml、150ng/ml、300ng/ml、600ng/ml、1200ng/ml。
64.将20ul的标准品溶液、40ul的磁微粒液工作液和50ul的酶标工作液混合均匀，并37℃孵育反应5min，清洗(具体步骤包括磁吸去除上清液，加入tbst缓冲液重悬，再次磁 吸去除上清液)，加入指示剂溶液显色并用光电倍增管采集400-550nm的光信号的相对光单位 rlu，采集结果如表4所示。
65.表4阿立哌唑浓的标准品溶液和脱氢阿立哌唑的标准品溶液的采集结果以标准品溶液的浓度作为横坐标，以标准品溶液的相对光单位作为纵坐标，绘制标准品溶液 的标准曲线。
66.其中，阿立哌唑浓的标准曲线如图3所示，计算得到线性回归方程计算得到线性回归 方程为：y＝(a
ꢀ‑
d)/[1+(x/c)b]+d，a ＝103108568.924163，b＝1.07257075717918，c＝ 13.1743174321519，d＝128379.691512192，相关系数r2＝0.999999906310124。
[0067]
脱氢阿立哌唑的标准曲线如图4所示，计算得到线性回归方程为：y＝(a
ꢀ‑
d)/[1+ (x/c)b]+d，a＝102948270.120879，b＝1.07080983164846，c＝13.1814135327384，d＝ 116511.776675287，相关系数r2＝0.9999。
[0068]
分别检测低浓度阿立哌唑和高浓度阿立哌唑的重复性，结果如表5所示。
[0069]
表5低浓度阿立哌唑和高浓度阿立哌唑的重复性
检测阿立哌唑的检出限lob，结果如表6所示。
[0069]
表6阿立哌唑的检出限lob由表5～6可以看出，采用45f2细胞株产生的抗体并基于磁微粒发光法检测阿立哌唑和脱氢 阿立哌唑浓度，具有灵敏度高、重复性好的优点。
[0070]
s20、检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度将20ul待测样本、40ul磁微粒液工作液和50ul酶标工作液混合均匀，并经过孵育反应、清 洗后，加入指示剂溶液显色并采集400nm～550nm光信号的相对光单位；根据所述线性回归方程，计算出所述待测样本的相对光单位在标准曲线上所对应横坐标的浓 度。
[0071]
可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式， 然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实 质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。