一种磁性脂质体在富集四氢大麻酚中的应用及应用方法

1.本发明涉及一种富集四氢大麻酚的方法，特别涉及到一种磁性脂质体在富集四氢大麻酚中的应用及应用方法。


背景技术：

2.四氢大麻酚(thc)是一种流行的精神活性药物，属于大麻不同部位的大麻素群，口服或吸烟进入人体后主要以四氢大麻酚酸(thca)的形式存在。thca通过加热会使四氢大麻酚脱羧，进一步代谢为11-羟基-四氢大麻酚(11-oh-thc)，最后生成主要代谢物11-羧基-四氢大麻酚(thca)。大麻是毒驾最为相关的精神活性物质,血液中四氢大麻酚及其两种代谢物的浓度取决于使用方式、使用量及代谢时间。处理警察交通管制时采集的样本，其中thc和thca血药浓度分别低于20ng/ml和200ng/ml。thc和其代谢物的定量可通过气相色谱-质谱(gc-ms)、柱前衍生化和液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)等方法进行检测。前处理步骤对最终检测的结果起着至关重要的作用，目前主要通过使用固相萃取(spe)、液-液萃取(lle)等方法对样品进行前处理，以得到更快的分析时间，更低的检测限。环境及污水中四氢大麻酚及其代谢物的测定为毒品溯源和打击毒品犯罪活动提供重要依据，但thc易氧化，且易吸附于环境介质中不易被检测到，因此设计一种可以有效检测thc的方法十分重要。


技术实现要素：

3.发明目的：基于有强脂溶性以及吸附性的四氢大麻酚会吸附在具有强非极性的脂质体表面的原理进行磁固相萃取，本发明提供了一种磁性脂质体在富集四氢大麻酚中的应用，通过hplc-ms/ms检测四氢大麻酚从而实现对污水体系中的thc的检测。
4.技术方案：本发明所述的磁性脂质体在富集四氢大麻酚中的应用，其特征在于，所述磁性脂质体包括fe3o4磁珠以及包覆在所述fe3o4磁珠上的脂质体，所述脂质体包括质量比为15～20：2～5：0.5～1.5的大豆磷脂、胆固醇以及维生素e。
5.作为本发明的一种优选实施方式，所述fe3o4磁珠与所述维生素e的质量比为0.8～1：0.8～1。
6.作为本发明的一种优选实施方式，所述脂质体包括质量比为20:5:1的大豆磷脂、胆固醇以及维生素e。
7.作为本发明的一种优选实施方式，所述fe3o4磁珠与所述维生素e的质量比为1：1。
8.本发明所述的磁性脂质体在富集四氢大麻酚中的应用方法，包括以下步骤：将上述的磁性脂质体添加到含有thc的污水样品中，混匀，进行磁固相萃取，洗脱，测量洗脱液中thc的浓度，根据响应强度计算样品中thc的浓度。
9.作为本发明的一种优选实施方式，所述污水样品的ph为2～3。
10.作为本发明的一种优选实施方式，所述洗脱采用的洗脱液为质量浓度为70～80％的甲醇水溶液。
11.作为本发明的一种优选实施方式，所述洗脱的条件为在6000～8000r/min离心20
～30min。
12.作为本发明的一种优选实施方式，所述磁性脂质体在污水中的添加浓度为100～150mg/l。
13.作为本发明的一种优选实施方式，所述的污水样品的ph为2；洗脱液为质量浓度为80％的甲醇水溶液；洗脱的条件为8000r/min，离心30min。
14.作为本发明的一种优选实施方式，所述磁性脂质体在污水中的添加浓度为150mg/l。
15.作为本发明的一种优选实施方式，lip@fe3o4富集污水中四氢大麻酚的方法，包括以下步骤：
16.(1)使用水热法制备fe3o4磁珠，再使用薄膜分散法制备脂质体的水合阶段加入fe3o4磁珠获得脂质体包覆的fe3o4磁珠lip@fe3o4；
17.(2)将制备好的lip@fe3o4加入到添加不同浓度thc污水样品进行磁固相萃取，使用hplc-ms/ms进行检测，以甲氧那明作为内标物使用内标法进行计算，以thc浓度为横坐标，thc的响应强度除内标物的响应强度为纵坐标，绘制标准曲线；
18.(3)将制备好的lip@fe3o4添加到thc的污水样品，混匀，进行磁固相萃取，根据响应强度计算样品中thc的浓度。
19.有益效果：本发明lip@fe3o4可检测实际污水样品中的thc，定量下限低，方法灵敏度高，通过对实际污水样品中thc的定量检测，从而实现对区域内吸食大麻情况的鉴定。
附图说明
20.图1为lip@fe3o4制备过程及样品前处理过程；
21.图2为本发明实施例1制备的lip@fe3o4的透射电镜图，其中，a图为tem图，b图为粒径分布图；
22.图3为lip@fe3o4在不同条件下对thc的吸附率；
23.图4为lip@fe3o4在不同洗脱液及是否有离心步骤下的回收率；
24.图5为lip@fe3o4在不同浓度下的线性曲线；
25.图6为lip@fe3o4对六种不同毒品的吸附率。
具体实施方式
26.实施例1：磁性脂质体(lip@fe3o4)的制备
27.(1)fe3o4磁珠的构建
28.通过溶剂热反应进行制备fe3o4磁珠，具体步骤如下：室温下，称取4.3g fecl3·
6h2o、2.35g柠檬酸三钠和8.75g醋酸钠(naac)置于250ml干燥圆底烧瓶中，加入150ml乙二醇并通过机械搅拌使其溶解。将得到的黄色溶液转移并密封在聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中高压灭菌器中，在200℃下加热10h，然后冷却至室温。将黑色磁性产物用磁铁分离收集，分别用去离子水和乙醇清洗3次后，用磁铁吸附产物于烧杯底部，上清液倒出，之后在60℃真空干燥箱中干燥12h，密封备用。
29.(2)磁性脂质体(lip@fe3o4)的构建
30.用薄膜分散法进行制备脂质体包覆的fe3o4磁珠，具体操作方法如下：室温下，称取
100mg大豆磷脂(生物技术级，来自于麦克林cas:8002-43-5，lot#:c12061184)，
31.25mg胆固醇，5mg维生素e置于250ml烧瓶底部，加入10ml三氯甲烷并通过水浴超声使其完全溶解。在50℃的水浴加热下使用旋转蒸发仪去除三氯甲烷，最终在瓶底形成一层淡黄色均匀薄膜。室温下称取步骤(1)制备的5mg的fe3o4，将其分散于10ml pbs溶液中并通过水浴超声使其完全分散。将该溶液加入挥干后的烧瓶中，继续使用旋转蒸发仪于30℃的水浴中进行1小时的旋转水化。将黑色磁性产物用磁铁分离收集，用去离子水和pbs分别清洗3次后，将其溶解于10ml pbs溶液中，使用细胞破碎仪以10％的功率破碎8min，每开启2s暂停1s。得到的lip@fe3o4的透射电镜图(tem)如图2所示。
32.实施例2：磁性脂质体lip@fe3o4吸附thc的条件筛选
33.(1)对本发明的lip@fe3o4吸附thc的条件包括ph、材料用量以及震荡时间进行筛选，确定了最佳条件为ph＝2，材料用量为150mg/l，震荡时间为5min。同时对于洗脱过程的条件进行考察，包括洗脱液乙腈含量、甲醇含量以及离心步骤，确定了最终以80％的甲醇水作为洗脱液，8000r/min离心30min为洗脱条件。
34.(2)吸附率的测定：在100ml超纯水中，加入50μl的thc(1.0μg/ml)使其浓度为500ng/l，放置1小时后加入15mg lip@fe3o4，涡旋混匀后水浴超声30s，震荡20min后使用强磁铁将lip@fe3o4吸附到杯壁上，吸取0.8ml上清液至2ml ep管中，加入0.2ml 1μg/ml的内标物甲氧那明混匀后通过0.2μm的有机滤膜，得到样品组。将50μl的thc(1.0μg/ml)直接加到100ml超纯水中，震荡均匀后吸取0.8ml上清液至2ml ep管中，加入0.2ml 1μg/ml的内标物甲氧那明，作为对照组。
35.检测thc的方法为：
36.液相色谱条件：色谱柱：ecllpse plus c18(100mm
×
2.1mm
×
5μm)；柱温：40℃；流速：1ml/min；进样体积：5μl；流动相：a为0.1％(体积分数)甲酸缓冲水溶液，b为乙腈；梯度洗脱程序：0～5min，95％b相。
37.质谱条件：离子源：esi，正离子模式；监测模式：d-mrm模式；雾化器流速：4l/min；干燥器流速：10l/min；加热气流速：20l/min；接口电压：5000v；接口温度：300℃。
38.将制备好的样品和对照品按照检测thc的方法进行hplc-ms/ms测定，记录各组分的峰面积，经内标法计算方法得出其浓度，计算吸附率。
39.(3)对本发明的lip@fe3o4吸附thc的条件ph进行筛选，取十二份超纯水各100ml，将超纯水分为俩组，一组为样品组一组为对照组，俩组的六份超纯水通过加入hcl(1m)和naoh(1m)调节溶液的ph,使其ph分别为2，3，5，7，9，10，按吸附率的测定方法测定各ph下thc的吸附率，结果如图3中a图所示，结果表明ph为2时吸附率最高，之后的实验的ph均为2。
40.(4)对本发明的lip@fe3o4吸附thc的条件材料用量进行筛选，取七份超纯水各100ml，标为1-7号，将7号作为对照组，按吸附率的测定方法测定不同材料用量下的thc的吸附率，其中1-6号样品中分别添加2.5mg，5mg，7.5mg，10mg，15mg，22.5mg的吸附材料lip@fe3o4，结果如图3中b图所示，结果表明添加15mg的吸附材料lip@fe3o4即可将thc完全吸附，之后实验中材料用量按照150mg/l的浓度添加。
41.(5)对本发明的lip@fe3o4吸附thc的条件震荡时间进行筛选，取六份超纯水各100ml，标为1-6号，将6号作为对照组，按吸附率的测定方法测定不同材料用量下的thc的吸附率，其中1-6号样品震荡时间分别为5min，10min，15min，20min，30min，结果如图3中c图所
示，结果表明震荡时间5min即可将thc完全吸附，之后的实验中震荡时间为5min。
42.(6)回收率的测定：取100ml污水，添加hcl(1m)调整其ph为2，加入50μl的thc(1.0μg/ml)使其浓度为500ng/l，放置1小时后加入15mg lip@fe3o4，涡旋混匀后水浴超声30s，震荡5min后使用强磁铁将lip@fe3o4吸附到杯壁上，吸取所有液体后添加0.8ml洗脱液，混匀后水浴超声30s，使用强磁铁将lip@fe3o4吸附到杯壁上，吸取洗脱液至2ml ep管中，加入0.2ml 1μg/ml的内标物甲氧那明混匀后通过0.2μm的有机滤膜，得到样品组。
43.将50μl的thc(1.0μg/ml)直接加到0.8ml洗脱液中，震荡均匀后加入0.2ml 1μg/ml的内标物甲氧那明，作为对照组。
44.将制备好的样品和对照品按照检测thc的方法进行hplc-ms/ms测定，记录各组分的峰面积，经内标法计算方法得出其浓度，计算回收率。
45.(7)对本发明的lip@fe3o4吸附thc的条件洗脱液成分进行筛选，取十份污水各100ml，按回收率的测定计算各组回收率，其中洗脱液成分分别为20％甲醇水溶液，40％甲醇水溶液，60％甲醇水溶液，80％甲醇水溶液，甲醇溶液，20％乙腈水溶液，40％乙腈水溶液，60％乙腈水溶液，80％乙腈水溶液，乙腈溶液。实验发现回收率均不高，可能需要额外添加离心步骤提高回收率。
46.(8)对本发明的lip@fe3o4吸附thc的条件离心步骤进行筛选，取十份污水各100ml，按回收率的测定计算各组回收率，其中洗脱液成分分别为20％甲醇水溶液，40％甲醇水溶液，60％甲醇水溶液，80％甲醇水溶液，甲醇溶液，20％乙腈水溶液，40％乙腈水溶液，60％乙腈水溶液，80％乙腈水溶液，乙腈溶液，且在添加洗脱液后增加30min 8000rpm/min的离心步骤。结果如图4所示，图4中a图为甲醇溶液对回收率的影响结果，图4中b图为乙腈溶液对回收率的影响结果，图4中c图为甲醇溶液结合离心处理对于回收率的影响结果，图4中d图为乙腈溶液结合离心处理对于回收率的影响结果，结果表明回收率基本上随着溶剂浓度增加有显著提升，且80％甲醇水溶液回收率最高，后续实验以80％甲醇水溶液作为洗脱液，添加30min 8000rpm/min的离心步骤。
47.实施例3：hplc-ms/ms检测thc标准曲线的建立
48.取六份污水各100ml，加入不同体积的1μg/ml的thc，使thc终浓度分别为100ng/l，200ng/l，300ng/l，400ng/l，500ng/l，1000ng/l，分别加入不同体积的污水使总体积一致，放置1小时后，加入相同体积的lip@fe3o4，使lip@fe3o4的终浓度为150mg/l，调整污水的ph为2，涡旋混匀后水浴超声30s，震荡5min。使用强磁铁将lip@fe3o4吸附到杯壁上，吸取剩余液体后加入0.8ml80％甲醇水溶液将杯壁上的lip@fe3o4冲洗下来，将收集到的溶液转移至2ml的ep管中，以8000rpm/min的转速离心30min，使用磁铁将lip@fe3o4吸附到ep管的管壁上，将0.8ml的洗脱液转移至新的2ml ep管内，加入0.2ml 1μg/ml的内标物甲氧那明混匀后通过0.2μm的有机滤膜，将制备好的样品进行hplc-ms/ms检测，thc的定量离子对是314.2/193.2，内标物甲氧那明的定量离子对为181.0/121.0，以甲氧那明作为内标物使用内标法进行计算，以thc浓度为横坐标，thc的响应强度除内标物的响应强度为纵坐标，绘制标准曲线，如图5所示。绘制标准曲线后得到线性方程y＝0.09974x+3.242，r2＝0.9937。添加lip@fe3o4最佳浓度为150mg/l，检测thc的线性范围为1-1000ng/l。
49.实施例4：污水中thc的富集
50.(1)污水样品的前处理：检测前将污水样品静置，使用0.4μm的滤膜进行抽滤，取滤
液作为实验使用的基质。
51.(2)方法准确度考察：取8份100ml抽滤后的污水样品，分为2组每组4份污水样品标为1-4号样品，加入不同体积的1μg/ml的thc使其终浓度分别为含有50ng/l，100ng/l，500ng/l，1000ng/l，分别加入不同体积的污水使总体积一致，混匀后放置一小时，俩组样品分别添加lip@fe3o4使其终浓度分别为150mg/l，250mg/l，调整其ph为2，涡旋混匀后水浴超声30s，震荡5min。使用强磁铁将lip@fe吸附到杯壁上，吸取剩余液体后加入0.8ml 80％甲醇水溶液将杯壁上的lip@fe3o4冲洗下来，将收集到的溶液转移至2ml的ep管中，以8000rpm/min的转速离心30min，使用磁铁将lip@fe3o4吸附到ep管的管壁上，将0.8ml的洗脱液转移至新的2mlep管内，加入0.2ml 1μg/ml的内标物甲氧那明混匀后通过0.2μm的有机滤膜，将制备好的样品进行hplc-ms/ms检测，thc的定量离子对是314.2/193.2，内标物甲氧那明的定量离子对为181.0/121.0，与标准品进行对比，回收率在93.723％-104.012％，证明了该发明的准确性。
52.(3)方法专属性考察：取6份100ml纯水，标为1-6号样品，分别加入1μg/ml的四氢大麻酚(thc)，四氢大麻酚酸，海洛因，芬太尼，甲卡西酮，甲基苯丙胺使其终浓度为500ng/l，分别添加lip@fe3o4使其终浓度分别为150mg/l，调整其ph为2，涡旋混匀后水浴超声30s，震荡5min，使用强磁铁将lip@fe3o4吸附到杯壁上，吸取0.8ml上清液，加入0.2ml 1μg/ml的内标物甲氧那明混匀后通过0.2μm的有机滤膜，将制备好的样品进行hplc-ms/ms检测，thc的定量离子对是314.2/193.2，内标物甲氧那明的定量离子对为181.0/121.0，四氢大麻酚酸的定量离子对是357/215.1，海洛因的定量离子对是370.2/165.3，芬太尼的定量离子对是337/202.16，甲卡西酮的定量离子对是164.1/105.1，甲基苯丙胺的定量离子对是150.1/118.9，使用标准品进行对比，计算吸附率。
53.(4)检测六种毒品在水与正辛醇里的分配系数：取12个试管分为两组，每组6只标为1-6号样品，第一组加入3ml纯水和3ml正辛醇，第二组加入6ml纯水。每组的六只试管中分别加入3μl浓度为1μg/ml的四氢大麻酚(thc)、四氢大麻酚酸、海洛因、芬太尼、甲卡西酮、甲基苯丙胺使其终浓度为500ng/l，在室温水浴中培养48小时以达到两相平衡。分离有机相和水相，分别从12份样品的水相中取1.5ml溶液，按照吸附率的测定进行hplc-ms/ms检测得出其浓度，分配系数的计算公式如下：
54.kp(油水分配系数)＝(2c
2-c1)/c1，其中，c1为毒品在第一组基质中达到平衡时的水相浓度，c2为毒品在第二组基质中达到平衡时的水相浓度。
55.结果如表1所示，表1的分配系数与图6中的吸附率高低一致，与预测的吸附原理一致，说明该方法的专属性。
56.表1油水分布系数(kp)
57.四氢大麻酚四氢大麻酚酸海洛因芬太尼甲卡西酮甲基苯丙胺4.132.261.221.713.501.29
58.试验表明，本发明构建的材料可以有效吸附污水中的thc，有很好的富集效果，与hplc-ms/ms联用可实现对污水环境中的thc的检测，同时具有方便、快速的萃取程序，灵敏度高，定量下限低，灵敏度高和环境友好性等优点。