基于液相芯片技术的荧光编码磁珠的制备方法与流程

1.本发明涉及磁珠，特别涉及基于液相芯片技术的荧光编码磁珠的制备方法。


背景技术：

2.液相芯片技术突破了固相芯片稳定性和重复性差的局限，一次可检测多种指标，不仅能检测蛋白、细胞因子，也能检测核酸，因此一经问世就得到了体外诊断领域的广泛关注。液相芯片技术的核心在于用物理化学信号对聚苯乙烯磁性微球进行特异性编码，为了使荧光编码微球能够应用于高通量的多指标检测体系，这要求编码技术具有容量大、重现性好等特点。但由于编码操作要求精确度高，工艺复杂，因此一直制约了该技术的普及和发展。
3.目前人们已经发展出了多种编码方式，如化学编码、空间图案编码、电子编码、振动光谱编码、光子晶体编码、光学编码以及物理编码等。已经商业化的是luminex公司的magplex微球编码技术，利用红色和红外荧光染料对聚苯乙烯微球进行编码，两种染料分别设定10个浓度梯度，得到了100种荧光编码微球。新一代的magplex微球在此基础上增加了第三种荧光染料，并设置了5个浓度梯度，得到了500种编码微球。但由于不同染料同时进入溶胀的微球时，染料的比例可能会发生变化，合成的不同批次间的荧光强度也会存在差异，因此这种浓度编码的方式存在较高的难度，对合成工艺的操作要求也非常严格，其他的编码技术也存在类似的缺点。
4.目前的液相芯片检测平台仅配置两种激光器，因此能够检测的荧光通道有限。随着流式检测技术的发展，三激光、六激光等多激光配置的流式细胞仪被逐渐开发出来，提供了更多的荧光通道，满足了更高的研究需求。这也为多激光液相芯片检测平台的诞生提供了契机。


技术实现要素：

5.为解决上述现有技术方案中的不足，本发明提供了一种基于液相芯片技术的荧光编码磁珠的制备方法。
6.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
7.基于液相芯片技术的荧光编码磁珠的制备方法，所述基于液相芯片技术的荧光编码磁珠的制备方法包括以下步骤：
8.(a1)获得微球种子；
9.(a2)得到多孔羧基化微球；
10.(a3)将磁性纳米颗粒引入所述多孔羧基化微球的内部；
11.(a4)将不同的疏水性荧光染料进行排列组合，溶解在溶胀剂中，引入磁性纳米颗粒的多孔随机化微球在所述溶胀剂内溶胀，去除溶剂后得到荧光编码磁珠。
12.与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
13.1.编码容量大；
14.建立了一种新型的以染料种类组合为基础的编码系统，应用于三激光配置的液相芯片检测平台；随着新开发出的荧光通道越来越多，编码组合的容量也随之扩大；
15.2.工艺简单、难度低；
16.简化了生产工艺，降低了合成难度，可以推动液相芯片技术在临床、科研等领域的进一步应用发展。
附图说明
17.参照附图，本发明的公开内容将变得更易理解。本领域技术人员容易理解的是：这些附图仅仅用于举例说明本发明的技术方案，而并非意在对本发明的保护范围构成限制。图中：
18.图1是根据本发明实施例的基于液相芯片技术的荧光编码磁珠的制备方法的流程示意图。
具体实施方式
19.图1和以下说明描述了本发明的可选实施方式以教导本领域技术人员如何实施和再现本发明。为了教导本发明技术方案，已简化或省略了一些常规方面。本领域技术人员应该理解源自这些实施方式的变型或替换将在本发明的范围内。本领域技术人员应该理解下述特征能够以各种方式组合以形成本发明的多个变型。由此，本发明并不局限于下述可选实施方式，而仅由权利要求和它们的等同物限定。
20.实施例1：
21.图1给出了本发明实施例的基于液相芯片技术的荧光编码磁珠的制备方法的流程示意图，如图1所示，所述基于液相芯片技术的荧光编码磁珠的制备方法包括以下步骤：
22.(a1)利用分散聚合等方式获得微球种子，如聚苯乙烯微球种子；
23.(a2)得到多孔羧基化微球；
24.(a3)将磁性纳米颗粒如四氧化三铁磁性纳米粒子引入所述多孔羧基化微球的内部；
25.(a4)将不同的疏水性荧光染料进行排列组合，溶解在溶胀剂中，引入磁性纳米颗粒的多孔随机化微球在所述溶胀剂内溶胀，去除溶剂后得到荧光编码磁珠。
26.实施例2：
27.根据本发明实施例1的基于液相芯片技术的荧光编码磁珠的制备方法的应用例。
28.在该应用例中，如图1所示，所述基于液相芯片技术的荧光编码磁珠的制备方法包括以下步骤：
29.(a1)获得微球种子，具体方式为：
30.在100ml的四口瓶中称取适量的pvp，溶入无水乙醇与乙二醇独甲醚作为反应溶剂，氩气保护，再加入溶有aibn的苯乙烯，通入氩气除氧，10min后升温开始聚合，在45℃预引发30min，再升温至70℃，反应进行12小时，整个过程采用机械搅拌。
31.(a2)得到多孔羧基化微球，具体方式为：
32.将适量环己烷加入配制的sds溶液中超声乳化，作为溶胀剂；将一定量的ps种子微球中加入另一sds溶液，超声使其充分分散，并转移到四口瓶中；然后将溶胀剂乳液滴入四
口瓶，在30℃下溶胀6h。继续加入适量sds溶液后，再加入一定量的苯乙烯溶液(含10wt％的egdma，5wt％的maa)，在30℃下溶胀10h。加入水相阻聚剂，加入分散剂pvp，再加入100ml水，80℃下聚合12h。
33.(a3)将磁性纳米颗粒如四氧化三铁磁性纳米粒子引入所述多孔羧基化微球的内部；
34.磁性纳米粒子的制备方式为：
35.称取一定量的fecl2·
4h2o和fecl3·
6h2o超声分散于100ml的超纯水中，在80℃下充氮搅拌30min后快速加入nh3·
h2o，溶液颜色立刻转为黑色，反应30min后再加入油酸继续反应1.5h。反应结束后用超纯水磁性分离数次直至洗涤液中ph值呈中性，随后将磁性产物重新分散到氯仿中，形成稳定磁流体。
36.称量一定量的聚苯乙烯微球，溶于氯仿与异丙醇的混合溶剂(95:5，v/v)，超声20min。将含有适量四氧化三铁磁性纳米粒子的氯仿溶液加入到上述微球溶液中，并超声10min。将微球的混合液在真空烘箱中放置12h，直至混合溶液中的氯仿及异丙醇被挥发掉。将掺杂磁颗粒的微球在乙醇溶液中离心洗涤。
37.(a4)将不同的疏水性荧光染料进行排列组合，溶解在溶胀剂中，引入磁性纳米颗粒的多孔随机化微球在所述溶胀剂内溶胀，去除溶剂后得到荧光编码磁珠。
38.称取一定量的羧基聚苯乙烯微球于0.25％sds水溶液中,超声20min，使微球分散均匀。将fitc荧光染料溶于氯仿后,取适量fitc溶液加入到羧基聚苯乙烯微球中分散,超声1h后，室温下剧烈搅拌4h，旋蒸除去多余的氯仿。用去离子水多次离心洗涤，即得到得fitc荧光标记的磁珠。
39.同样的合成方法，只需要将fitc换成疏水性的apc或pe，就可得到apc标记的磁珠或pe标记的磁珠，该标记磁珠的荧光信号可在三激光液相芯片仪器上检测到。
40.实施例3：
41.根据本发明实施例1的基于液相芯片技术的荧光编码磁珠的制备方法的应用例，与实施例2不同的是：
42.在步骤(a4)中，荧光染料为fitc和疏水性apc的混合染料。即可得到fitc&apc标记的磁珠。同样的制备方法，可以将fitc&apc的组合换成apc&pe，或者fitc&apc&pe，就可得到apc&pe编码的磁珠或fitc&apc&pe编码的磁珠。该编码磁珠具有多种荧光标记，可在三激光液相芯片仪器上检测到。