反斯托克斯时间分辨荧光微球及其制备方法

1.本发明属于生物技术领域中时间分辨荧光免疫分析方法技术领域，具体涉及一种反斯托克斯时间分辨荧光微球及其制备方法。


背景技术：

2.时间分辨荧光免疫分析法是一种灵敏度高的免疫分析方法，其原理是：采用较长荧光半衰期的稀土离子作标记物，测定时通过延缓测量时间，使背景荧光充分衰减后再测定标记物的信号可有效地消除各种非特异性荧光的背景干扰，此外，荧光激发和发射波长的斯托克斯位移较大(》150nm)，也有利于消除荧光背景，获得很高的灵敏度。目前，时间分辨荧光微球通常是直接利用稀土离子的配合物吸收紫外光发射荧光，激发波长通常在360nm的紫外区，产生大的stokes位移，可降低背景噪声。它作为一种特殊的功能微球，是一种包埋有稀土离子配合物的聚苯乙烯微球，包埋的稀土离子一般有eu
3+
、tb
3+
、sm
3+
和dy
3+
，其在与β-二酮类及芳香胺类等某些配体形成配合物后，可吸收紫外光，然后发出很强的稀土离子特征荧光。然而，采用360nm紫外区的光作为光源照射样品时，溶液中的多种生物组分如蛋白质或核酸仍可能被激发产生背景荧光；此外，检测部件如侧流层析法中的硝酸纤维素膜仍会产生背景荧光。因而，通常使用长波长的光作为激发光源，能极大程度降低溶液或检测部件的背景荧光，例如，采用980nm进行激发的上转换发光(反斯托克斯荧光)纳米粒子。
3.另外，时间分辨荧光侧流层析技术是一种检测时间短、可用于现场筛查的定量检测技术，尽管其具有诸多优势，但是因受到免疫层析反应方式的制约，与化学发光、电化学发光等技术相比，灵敏度方面仍有一定的差距，如何通过提高荧光微球的荧光强度来进一步提升检测的灵敏度迫在眉睫。因此，急需开发一种灵敏度高、稳定性强的反斯托克斯新型时间分辨荧光微球，用以提高时间分辨荧光测流层析技术的检测效率。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种分散性好、稳定性强、灵敏度高的反斯托克斯时间分辨荧光微球及其制备方法。
5.为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。
6.一种反斯托克斯时间分辨荧光微球的制备方法，包括以下步骤：
7.s1、将聚苯乙烯微球分散于有机溶剂中，加入单线态氧光敏剂，在25℃～110℃下进行反应，反应后加入乙醇，经洗涤，将洗涤产物分散于水中，得到单线态氧光敏剂包覆微球；
8.s2、将步骤s1得到的单线态氧光敏剂包覆微球、铕配合物、有机物和有机溶剂混合，所述有机物为能与单线态氧光敏剂产生发光能量转移的有机物，超声，在室温下进行反应，所得产物经旋蒸、洗涤，得到反斯托克斯时间分辨荧光微球。
9.上述的反斯托克斯时间分辨荧光微球的制备方法，优选的，步骤s1中，所述单线态
氧光敏剂包括亚甲基蓝、四磺酸酞菁锌、铜酞菁-3,4',4”,4”'-四磺酸四钠盐和二羟基硅酞菁中的至少一种，所述聚苯乙烯微球为氨基化聚苯乙烯微球，所述聚苯乙烯微球中的粒子数与单线态氧光敏剂中的粒子数的比例为1∶107～10
10
，所述聚苯乙烯微球的浓度为1.5
×
10
11
粒子数/ml～4.5
×
10
11
粒子数/ml。
10.上述的反斯托克斯时间分辨荧光微球的制备方法，优选的，步骤s2中，所述有机物为4-(2-苯基-5,6-二氢-1,4-噁噻己环-3-基)-n,n-二十四烷基苯胺或二甲基噻吩衍生物，所述铕配合物、有机物和单线态氧光敏剂包覆微球的粒子数比例为107～10
10
∶107～10
10
∶1。
11.上述的反斯托克斯时间分辨荧光微球的制备方法，优选的，步骤s2中，所述混合的具体过程为：将铕配合物溶于有机溶剂，加入有机物，得到混合物，将混合物与步骤s1得到的单线态氧光敏剂包覆微球混合。
12.上述的反斯托克斯时间分辨荧光微球的制备方法，优选的，步骤s2中，所述铕配合物的制备方法包括以下步骤：
13.(1)将氯化铕溶于有机溶剂中，得到氯化铕溶液；
14.(2)将2-噻吩甲酰三氟丙酮和三苯基氧膦溶于有机溶剂中，得到混合溶液；
15.(3)将步骤(2)得到的混合溶液滴加入步骤(1)得到的氯化铕溶液中，调节ph值至6.5～6.8，进行加热反应，静置，经过滤、洗涤、干燥，得到铕配合物。
16.上述的反斯托克斯时间分辨荧光微球的制备方法，优选的，所述氯化铕、2-噻吩甲酰三氟丙酮和三苯基氧膦的摩尔比为1∶3～5∶2～4；
17.步骤(1)和步骤(2)中，所述有机溶剂为乙醇；
18.步骤(3)中，所述滴加在搅拌条件下进行，所述调节ph值采用的是氢氧化钠溶液，所述加热反应的温度为60℃～70℃，所述加热反应的时间为6h～8h。
19.上述的反斯托克斯时间分辨荧光微球的制备方法，优选的，步骤s1中，所述反应的时间为20min～12h，所述反应完成后反应体系与乙醇的体积比为1∶1。
20.上述的反斯托克斯时间分辨荧光微球的制备方法，优选的，步骤s1中，所述有机溶剂为乙二醇、苯甲醇和水的混合溶剂，所述有机溶剂中乙二醇、苯甲醇和水的体积比为6.5～8.5∶1～1.5∶1。
21.上述的反斯托克斯时间分辨荧光微球的制备方法，优选的，步骤s2中，所述反应的时间为10h～12h，所述超声的时间为20min～30min，所述旋蒸的温度为25℃～30℃，所述有机溶剂为氯仿。
22.作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的反斯托克斯时间分辨荧光微球的制备方法制得的反斯托克斯时间分辨荧光微球。
23.本发明，室温指18℃～25℃。
24.与现有技术相比，本发明的优点在于：
25.(1)本发明提供了一种反斯托克斯时间分辨荧光微球的制备方法，以聚苯乙烯微球为基础，利用溶胀原理包覆单线态氧光敏剂，而后加入能与单线态氧光敏剂产生发光能量转移的有机物以及稀土荧光染料分子铕配合物进行反应，最终得到反斯托克斯时间分辨荧光微球。本发明的制备方法具有操作简单、均相快速、实验结果重复性高等优点。
26.(2)本发明还提供了一种反斯托克斯时间分辨荧光微球，不仅同时具备时间分辨荧光免疫测定技术和发光氧通道分析技术的优点，又能消除单线态氧扩散距离的限制问
题，增大单线态氧浓度，大大提高时间分辨荧光微球的检测灵敏度。相较于普通荧光微球，本发明的反斯托克斯时间分辨荧光微球能在680nm光激发下发出强烈而稳定的615nm荧光，具有分散性好、稳定性强且灵敏度更高等优点，能成功应用于免疫分析。基于本发明的反斯托克斯时间分辨荧光微球开发的时间分辨荧光免疫分析技术，可以实现待测物质的快速、超敏的定量检测分析。
附图说明
27.图1为本发明实施例的反斯托克斯时间分辨荧光微球的制备流程图。
28.图2为本发明实施例1中反斯托克斯时间分辨荧光微球的分散效果图。
29.图3为本发明实施例1-6中单线态氧光敏剂包覆微球的单线态氧产量图。
30.图4为本发明实施例7中反斯托克斯时间分辨荧光微球的粒子数-荧光强度变化图。
31.图5为本发明实施例7中不同单线态氧光敏剂用量下单线态氧光敏剂包覆微球的单线态氧产量图。
具体实施方式
32.以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
33.实施例1：
34.一种本发明的反斯托克斯时间分辨荧光微球的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
35.(1)单线态氧光敏剂包覆微球的制备：
36.将160μl乙二醇、20μl苯甲醇和20μl去离子水震荡混合均匀，得到反应溶剂。取体积为5μl、浓度为2.1
×
10
11
粒子数/ml的聚苯乙烯微球加入上述的反应溶剂中超声震荡，其中聚苯乙烯微球为氨基化聚苯乙烯微球，形成聚苯乙烯微球分散体系。取40μl亚甲基蓝溶液加入上述的聚苯乙烯微球分散体系，该亚甲基蓝溶液的密度为1.5348g/ml、相对分子质量为319.85g/mol、质量分数为1％，常温过夜反应，即在25℃回流搅拌反应10h，反应完成后加入与反应体系体积相同的乙醇，用去离子水离心洗涤三遍，分散到200μl去离子水中，得到单线态氧光敏剂包覆微球，浓度为5.2
×
109粒子数/ml。该步骤中，亚甲基蓝的粒子数为聚苯乙烯微球的粒子数的109倍。
37.(2)荧光染料分子铕配合物eu(tta)3(tppo)2的合成：
38.将92mg六水合氯化铕溶于1ml无水乙醇，得到六水合氯化铕溶液；将0.1660g 2-噻吩甲酰三氟丙酮(tta)和0.1391g三苯基氧膦(tppo)溶于4ml无水乙醇，制成混合溶液；在磁力搅拌的条件下，将上述的混合溶液滴加入六水合氯化铕溶液中，然后，滴加氢氧化钠溶液，调节ph至6.5左右，于70℃水浴搅拌加热6h后，静置过夜后常压过滤，将沉淀产物先后用乙醇和蒸馏水洗涤三次，最后将沉淀产物放入真空干燥箱干燥30min，至恒重，得荧光染料分子铕配合物eu(tta)3(tppo)2。
39.(3)反斯托克斯时间分辨荧光微球的合成：
40.将2.9mg(2.1
×
10-6
mol，粒子数为1.2
×
10
18
)铕配合物eu(tta)
3(
tppo)2溶于氯仿，
加入1.4mg(2.1
×
10-6
mol，粒子数为1.2
×
10
18
)有机物4-(2-苯基-5,6-二氢-1,4-噁噻己环-3-基)-n,n-二十四烷基苯胺，得到混合物。将混合物加入步骤(1)得到的200μl单线态氧光敏剂包覆微球中，超声30min后，室温剧烈震荡过夜，即在室温下剧烈震荡反应10h，于30℃旋蒸除去氯仿，而后用去离子水离心洗涤三次，分散至200μl去离子水中，得到反斯托克斯时间分辨荧光微球。
41.本实施例制得的反斯托克斯时间分辨荧光微球，其粒子浓度为5.2
×
109粒子数/ml。然后，用去离子水稀释至5.2
×
107粒子数/ml，利用动态光散射法(dls)和纳米颗粒跟踪分析(nta)验证其颗粒的分散性。结果如图2所示。
42.图2为本发明实施例1中反斯托克斯时间分辨荧光微球的分散效果图。由图2可知，本发明的反斯托克斯时间分辨荧光微球(trfm)是高度分散的纳米粒子，它的平均水动力学粒径相比于聚苯乙烯微球(ps)有所增加。
43.为探究反斯托克斯新型时间分辨荧光微球的稳定性，对反斯托克斯时间分辨荧光微球进行zeta电势测定，结果如表1所示。
44.表1反斯托克斯新型时间分辨荧光微球的稳定性验证
[0045][0046][0047]
由表1可知，包裹了单线态氧光敏剂和稀土有机染料的反斯托克斯时间分辨荧光微球与聚苯乙烯微球的稳定性差距很小，且反斯托克斯时间分辨荧光微球的zeta电势绝对值大于15mv，说明其稳定性较好。
[0048]
实施例2：
[0049]
一种本发明的反斯托克斯时间分辨荧光微球的制备方法，与实施例1的制备方法基本相同，区别仅在于：步骤(1)中，反应的条件不同，即在110℃回流搅拌反应30min。该步骤中，亚甲基蓝的粒子数为聚苯乙烯微球的粒子数的109倍。
[0050]
本实施例制得的反斯托克斯时间分辨荧光微球，其粒子浓度为5.2
×
109粒子数/ml。
[0051]
实施例3：
[0052]
一种本发明的反斯托克斯时间分辨荧光微球的制备方法，与实施例1的制备方法基本相同，区别仅在于：步骤(1)中，采用铜酞菁-3,4’,4”,4
”’‑
四磺酸四钠盐溶液替换亚甲基蓝溶液，其用量为550μl。该铜酞菁-3,4’,4”,4
”’‑
四磺酸四钠盐溶液的制备方法：将10mg铜酞菁-3,4’,4”,4
”’‑
四磺酸四钠盐溶解于3ml去离子水。该步骤中，铜酞菁-3,4’,4”,4
”’‑
四磺酸四钠盐的粒子数为聚苯乙烯微球的粒子数的109倍。
[0053]
本实施例制得的反斯托克斯时间分辨荧光微球，其粒子浓度为5.2
×
109粒子数/ml。
[0054]
实施例4：
[0055]
一种本发明的反斯托克斯时间分辨荧光微球的制备方法，与实施例3的制备方法基本相同，区别仅在于：步骤(1)中，反应的条件不同，即在110℃回流搅拌反应30min。该步
骤中，铜酞菁-3,4’,4”,4
”’‑
四磺酸四钠盐的粒子数为聚苯乙烯微球的粒子数的109倍。
[0056]
本实施例制得的反斯托克斯时间分辨荧光微球，其粒子浓度为5.2
×
109粒子数/ml。
[0057]
实施例5：
[0058]
一种本发明的反斯托克斯时间分辨荧光微球的制备方法，与实施例1的制备方法基本相同，区别仅在于：步骤(1)中，采用四磺酸酞菁锌溶液替换亚甲基蓝溶液，其用量为530μl。该四磺酸酞菁锌溶液的制备方法：将10mg四磺酸酞菁锌溶解于3ml去离子水中。该步骤中，四磺酸酞菁锌的粒子数为聚苯乙烯微球的粒子数的109倍。
[0059]
本实施例制得的反斯托克斯时间分辨荧光微球，其粒子浓度为5.2
×
109粒子数/ml。
[0060]
实施例6：
[0061]
一种本发明的反斯托克斯时间分辨荧光微球的制备方法，与实施例5的制备方法基本相同，区别仅在于：步骤(1)中，反应的条件不同，即在110℃回流搅拌反应30min。该步骤中，四磺酸酞菁锌的粒子数为聚苯乙烯微球的粒子数的109倍。
[0062]
本实施例制得的反斯托克斯时间分辨荧光微球，其粒子浓度为5.2
×
109粒子数/ml。
[0063]
探究比较单线态氧光敏剂包覆微球产生单线态氧的能力，即加入单线态氧绿色荧光探针(sosg)配置六组样品进行荧光检测：分别取20μl实施例1-6中制得的单线态氧光敏剂包覆微球，加入体积为20μl、浓度为100μm的sosg溶液中，再加入体积为160μl、ph＝7.5、浓度为100mm的三羟甲基氨基甲烷溶液(tris溶液)。将以上六组样品各自震荡均匀后使用fs5荧光光谱仪进行荧光测量，fs5荧光光谱仪探测出的未激发单线态氧的探针荧光强度为背景信号强度f0，包覆光敏剂微球样品在680nm的激发光下照射5min激发出单线态氧后的荧光强度为f，结果如图3所示。
[0064]
图3为本发明实施例1-6中单线态氧光敏剂包覆微球的单线态氧产量图。图3中，亲水性酞菁铜为铜酞菁-3,4’,4”,4
”’‑
四磺酸四钠盐，亲水性酞菁锌为四磺酸酞菁锌。比较荧光信背比探究不同单线态氧光敏剂种类、反应温度对单线态氧光敏剂包覆微球的单线态氧效率的影响，由图3可知，实施例5制得的单线态氧光敏剂包覆微球产生单线态氧的效率最高，即四磺酸酞菁锌在常温过夜反应条件下包覆微球产生单线态氧效率是最高的。
[0065]
验证不同种类单线态氧光敏剂以及不同包覆条件对于微球荧光强度的影响，具体为：分别取10μl实施例1-6制得的反斯托克斯时间分辨荧光微球，然后用去离子水均稀释至浓度为5.2
×
107粒子数/ml，再加入240μl 1
×
pbs溶液震荡均匀，然后利用pe公司新一代victor nivo读板仪(酶标仪)对其进行荧光强度的测定，以探究不同种类光敏剂以及不同包覆条件对于微球荧光强度的影响。结果见表2所示，其中，普通商品荧光时间分辨荧光微球1为泰州百纳泰科新材料技术有限公司的产品，粒径为200nm。普通商品荧光时间分辨荧光微球2为bangslabs公司的产品，粒径为200nm。
[0066]
表2不同种类单线态氧光敏剂以及不同包覆条件对微球荧光强度的影响
[0067]
样品荧光强度实施例1152实施例2164
实施例3158实施例4172实施例5197实施例6147普通商品荧光时间分辨荧光微球1146普通商品荧光时间分辨荧光微球2131
[0068]
由表2可知，实施例5制得的反斯托克斯新型时间分辨荧光微球的荧光强度最强，即四磺酸酞菁锌在常温过夜条件下包覆微球，并且强于相同浓度的普通商品荧光时间分辨荧光微球1和普通时间分辨荧光商品荧光微球2。
[0069]
实施例7：
[0070]
一种本发明的反斯托克斯时间分辨荧光微球的制备方法，包括以下步骤：
[0071]
(1)单线态氧光敏剂包覆微球的制备：
[0072]
将1600μl乙二醇、200μl苯甲醇和200μl去离子水震荡混合均匀，得到反应溶剂；取体积为5μl、浓度为2.1
×
10
11
粒子数/ml的聚苯乙烯微球加入上述的反应溶剂中超声震荡，其中聚苯乙烯微球为氨基化聚苯乙烯微球，形成聚苯乙烯微球分散体系；取5.3μl四磺酸酞菁锌溶液加入上述的聚苯乙烯微球分散体系，该四磺酸酞菁锌溶液的制备方法：将10mg四磺酸酞菁锌溶解于3ml去离子水中。该步骤中，四磺酸酞菁锌的粒子数为聚苯乙烯微球的粒子数的107倍。在25℃回流搅拌反应10h，反应完成后加入与反应体系体积相同的乙醇，用去离子水离心洗涤三遍，分散到200μl去离子水中，得到单线态氧光敏剂包覆微球，浓度为5.2
×
109粒子数/ml。
[0073]
(2)荧光染料分子铕配合物eu(tta)3(tppo)2的合成：
[0074]
将92mg六水合氯化铕溶于1.0ml无水乙醇，得到六水合溶液；将0.1660g 2-噻吩甲酰三氟丙酮和0.1391g三苯基氧膦溶于4.0ml无水乙醇，制成混合溶液；在磁力搅拌的条件下，将上述的混合溶液滴加入六水合氯化铕溶液中；然后，滴加氢氧化钠溶液，调节ph至6.5左右，于70℃水浴搅拌加热6h后，静置过夜后常压过滤，将沉淀产物先后用乙醇和蒸馏水洗涤三次，最后将沉淀产物放入真空干燥箱干燥30min，至恒重，得荧光染料分子铕配合物eu(tta)3(tppo)2。
[0075]
(3)反斯托克斯时间分辨荧光微球的合成：
[0076]
将2.9mg(2.1
×
10-6
mol，粒子数为1.2
×
10
18
)铕配合物eu(tta)3(tppo)2溶于氯仿，加入1.4mg(2.1
×
10-6
mol，粒子数为1.2
×
10
18
)有机物4-(2-苯基-5,6-二氢-1,4-噁噻己环-3-基)-n,n-二十四烷基苯胺，得到混合物。将混合物加入步骤(1)得到的200μl单线态氧光敏剂包覆微球中，超声30min后，室温剧烈震荡过夜，即在室温下剧烈震荡反应10h，于30℃旋蒸除去氯仿，而后用去离子水离心洗涤三次，分散至200μl去离子水中，得到反斯托克斯时间分辨荧光微球。本实施例制得的反斯托克斯时间分辨荧光微球，其粒子浓度为5.2
×
109粒子数/ml。然后，用去离子水稀释至5.2
×
107粒子数/ml进行后续测试。
[0077]
本实施例中，还考察了不同用量四磺酸酞菁锌溶液的影响，其制备方法实施例7基本相同，区别仅在于：四磺酸酞菁锌溶液的用量分别为53μl、530μl、5.3ml，相对应该步骤中四磺酸酞菁锌的粒子数分别为聚苯乙烯微球的粒子数的108倍、109倍、10
10
倍。
[0078]
验证反斯托克斯时间分辨荧光微球的发光情况，采用本实施例中制得的反斯托克
斯时间分辨荧光微球进行验证，即四磺酸酞菁锌溶液的用量为530μl时制得的反斯托克斯时间分辨荧光微球，具体为：利用pe公司新一代victor nivo读板仪检测反斯托克斯时间分辨荧光微球在不同粒子数下的发光情况，参数设置为λ
ex
＝680nm。反应试剂组成为：250μl＝1
×
pbs+xμl反斯托克斯时间分辨荧光微球，即分别取0μl、0.5μl、1μl、5μl、10μl、50μl、100μl、200μl实施例7制得的反斯托克斯时间分辨荧光微球(c＝5.2
×
107粒子数/ml)，对应的微球粒子数分别为0、2.6
×
104、5.2
×
104、2.6
×
105、5.2
×
105、2.6
×
106、5.2
×
106、1.04
×
107，结果如图4所示。
[0079]
图4为本发明实施例7中反斯托克斯时间分辨荧光微球的粒子数-荧光强度变化图。由图4可知，当微球粒子数达到一定数目时，随着反斯托克斯时间分辨荧光微球的粒子数增加，其荧光强度也在增加，也就是说，本发明的反斯托克斯时间分辨荧光微球在680nm光激发下能成功发出615nm时间分辨荧光，表明反斯托克斯时间分辨荧光微球的成功研制。另外，与空白实验组对比可知，当粒子数为2.6
×
105时即可检测出其荧光强度，说明本发明的反斯托克斯时间分辨荧光微球灵敏度较高。
[0080]
加入sosg探究比较上述四组实验样品产生单线态氧的能力，比较荧光信背比以探究单线态氧光敏剂四磺酸酞菁锌包覆微球的饱和度，结果如图5所示。
[0081]
图5为本发明实施例7中不同单线态氧光敏剂用量下单线态氧光敏剂包覆微球的单线态氧产量图。由图5可知，当四磺酸基酞菁锌的粒子数从聚苯乙烯微球数的109倍增加至10
10
倍时，荧光信背比无明显增大，说明此时光敏剂包覆微球的能力已达到了饱和。
[0082]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。