一种纤维连接蛋白的检测试剂盒及其检测方法与流程

1.本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种纤维连接蛋白的检测试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.纤维连接蛋白(fn)是由血管平滑肌细胞、血管内皮细胞以及肝脏产生的一种功能蛋白质。相关研究显示,纤维连接蛋白属于一种二聚体糖蛋白,可以调节细胞的分化、增值和粘附,具有促进细胞内信号转导、离子交换和细胞向远处迁移的功能。还有学者研究后发现,纤维连接蛋白是机体用来完成完整性和防御性的主要物质之一,它在维持机体内环境稳定和调节网状内皮系统功能等方面具有重要作用。目前的研究认为,血清纤维连接蛋白与创伤、感染、休克、肝、肾疾病等多种疾病有关，尤其是在肝病中，与肝炎、肝硬化和纤维化的发生密切相关。
3.目前，检测纤维连接蛋白的常用方法是普通免疫比浊法和胶乳免疫比浊法，普通免疫比浊法不仅能满足临床对试剂灵敏度的需求，而且试剂制备操作简单，结果检测准确、快速。但是现有试剂往往存在抗乳糜干扰能力及血红蛋白干扰能力差的问题，从而影响试剂性能。且试剂精密度较差。同时，该项目是血清血浆同测项目，易受到edta血浆管的干扰，对测值产生较大影响。受活材效价的影响，成本较高，特异性较差。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提供一种纤维连接蛋白的检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒成本低、精密度高、抗乳糜干扰能力及血红蛋白干扰能力好，可用于广泛用于临床应用。
5.本发明提供一种纤维连接蛋白的检测试剂盒，由r1试剂和r2试剂组成；
6.所述试剂r1由ph7.0～8.0的5～50mm pb缓冲液、9g/l-30g/l的无机盐、40-80g/l促凝剂、0.5～30g/l表面活性剂和0.1-1g/l的防腐剂组成；
7.所述r2试剂由5-100mm缓冲液、9-30g/l的无机盐、100～500g/l纤维连接蛋白多抗血清、0.2-3g/l牛血清白蛋白和0.1-1g/l防腐剂组成；
8.所述r1中表面活性剂为聚氧乙烯月桂醚、聚乙二醇单异十三烷基醚、胆酸钠的一种或几种。
9.本发明试剂盒基于免疫比浊法测定纤维连接蛋白，检测原理为：
10.试剂r2和样本中纤维连接蛋白相结合发生凝集反应后，形成抗原抗体免疫复合物，并产生浊度，该浊度的高低与样本中纤维连接蛋白浓度成相关，测定此时的吸光度值，根据校准曲线计算出纤维连接蛋白的含量。
11.具体地，本发明试剂盒的使用方法包括：
12.先将试剂r1与待测fn血清样本混匀5分钟，然后加入试剂r2开始反应，其中，按体积比计，试剂r1:试剂r2:样本＝150:50:5；5分钟时比照空白测定初始吸光度a1，然后在10分钟时比照空白测定吸光度a2，计算a2与a1的差值δa，根据标准曲线获得待测fn血清样本
中fn含量。
13.一些实施方案中，所述r1试剂和r2试剂中的防腐剂为proclin 300。
14.一些实施方案中，所述r1试剂和r2试剂中的无机盐为nacl和/或kcl。
15.一些实施方案中，所述r1试剂中：
16.促凝剂为聚乙二醇6000和/或葡聚糖；
17.表面活性剂为胆酸钠和/或聚氧乙烯月桂醚和/或聚乙二醇单异十三烷基醚。
18.本发明中，r1试剂的表面活性剂能有效解决试剂抗干扰能力差的问题。一些具体实施例中，r1试剂的表面活性剂优选为胆酸钠和/或聚氧乙烯月桂醚和/或聚乙二醇单异十三烷基醚。
19.一些实施方案中，所述r2试剂中，
20.缓冲液为醋酸盐缓冲液、氯化铵缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、capso、mops或hepes缓冲液中的一种或几种；
21.无机盐为nacl和/或kcl。
22.一些实施方案中，所述纤维连接蛋白多抗血清为兔抗人的多抗血清。兔抗血清有效提高了效价，亲和力强，降低了成本。
23.本发明还提供一种纤维连接蛋白的检测方法，利用本发明所述的试剂盒检测血清样本或血浆样本。
24.一些具体实施方案中，所述检测方法包括：
25.37℃条件下，将试剂r1与fn的血清样本混匀5分钟，然后加入试剂r2反应，5分钟时比照空白测定初始吸光度a1，然后在10分钟时比照空白测定吸光度a2，计算a2与a1的差值δa。
26.进一步的，所述试剂r1、试剂r2与样本的体积比为150:50:5。
27.本发明中，r1试剂中nacl和阴离子表面活性剂复配，有效改善了edta采血管对测值的影响。edta采血管中可能存在edta残留，r1中阴离子表面活性剂自身形成囊泡促进了样本中的edta与其产生非特异性反应。通过调整nacl用量破坏了阴离子表面活性剂形成的囊泡，同时多余的na离子与edta螯合，消除了edta与阴离子表面活性剂之间的非特异性反应，从而得到正确的测值结果。
28.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
29.(1)采用本方法制备的试剂盒检测准确度能满足临床需求。
30.(2)本发明r1试剂中使用聚氧乙烯月桂醚和/或聚乙二醇单异十三烷基醚和/或胆酸钠复配(两两互配)，并将nacl和特定的阴离子表面活性剂复配，有效地提高了试剂抗乳糜和血红蛋白干扰的能力，有效地消除edta血浆管对样本测值的影响。
31.(3)本发明所用活材，效价高，亲和力高，成本低，无批间差。
32.(4)本发明试剂盒精密度好。
33.(5)采用本方法制备的试剂盒可用于全自动生化分析仪上，适合全自动测试，可大规模的开展和推广。
附图说明
34.图1示实施例3试剂盒与对照fn试剂盒相关性分析结果；
35.图2示对比例3试剂盒与对照fn试剂盒相关性分析结果。
具体实施方式
36.本发明提供了一种纤维连接蛋白的检测试剂盒及其检测方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
37.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
38.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
39.实施例1本发明试剂盒的制备
40.本发明试剂盒基于普通免疫比浊法测定fn，由试剂r1和试剂r2组成，其中，试剂r1中表面活性剂为胆酸钠、聚氧乙烯月桂醚和聚乙二醇单异十三烷基醚。试剂r2为牛血清白蛋白。
41.表1试剂r1的组分
[0042][0043]
试剂r1的配制步骤为(配制1l)：分别按照表1中实施例1～3的组分浓度，按照上述试剂r1的组分含量，使用纯化水配制pb缓冲液，调节ph，作为r1缓冲液；然后加入对应量的氯化钠、胆酸钠、聚乙二醇单异十三烷基醚、聚乙二醇6000和proclin300，混匀并用氢氧化钠/盐酸调节ph得到试剂r1。试剂r2的组分如表2所示。
[0044]
表2试剂r2的组分
[0045][0046]
试剂r2的配制步骤为(配制1l)：按照上述试剂r2的组分含量，使用纯化水配制缓冲液，调节ph，作为r2保存液；按照上述试剂r2的组分含量，将处理过的纤维连接蛋白多抗血清溶于r2保存液中，搅拌均匀，即得r2试剂。
[0047]
对比例1-3试剂盒及制备
[0048]
试剂盒可用于普通免疫比浊法测定fn，包括试剂r1和试剂r2。
[0049]
表3试剂r1的组分
[0050][0051]
试剂r1的配制步骤为(配制1l)：分别按照表1中对比例1-2的组分浓度，按照上述试剂r1的组分含量，使用纯化水配制pb缓冲液，调节ph，作为r1缓冲液；然后加入对应量的氯化钠、吐温20、聚乙二醇单异十三烷基醚、聚乙二醇6000和proclin300，混匀并用氢氧化钠/盐酸调节ph得到试剂r1。
[0052]
试剂r2的组分如表4所示
[0053]
表4试剂r2的组分
[0054][0055]
试剂r2的配制步骤为(配制1l)：按照上述试剂r2的组分含量，使用纯化水配制缓冲液，调节ph，作为r2保存液；按照上述试剂r2的组分含量，将处理过的纤维连接蛋白多抗血清溶于r2保存液中，搅拌均匀，即得r2试剂。
[0056]
效果测试例1
[0057]
效果测试试剂盒：实施例1～3的试剂盒、对照fn试剂盒(普通免疫比浊法)-北京九强生物技术股份有限公司、对比例1～3试剂盒。
[0058]
仪器：东芝120生化分析仪。
[0059]
测试波长：主波长340nm，副波长800nm。
[0060]
测试方法：终点法，递增性反应。37℃条件下，首先试剂r1与fn的血清样本混匀5分钟，然后加入试剂r2开始反应，其中体积比试剂r1:试剂r2:样本＝150:50:5；5分钟时比照空白测定初始吸光度a1，然后在10分钟时比照空白测定吸光度a2，计算a2与a1的差值δa。
[0061]
1、标准曲线的测定
[0062]
以实施例1～3试剂盒、对照fn试剂盒分别逐一测定标准浓度为0～1000mg/l的一系列标准浓度的fn的标准血清样本的δa值，部分浓度检测结果如表5所示。而根据一系列
fn的浓度和测得的δa值可分别拟合出各试剂盒的标准曲线，实施例1-3标准曲线为spline函数。
[0063]
fn的浓度与测得的δa值的对应的散点图如表5所示，由表5可知，实施例1～3相比于对照，在相同的条件下，吸光度变化更加明显，灵敏度更高。
[0064]
表5标准血清样本的δa值测试结果
[0065][0066]
从表5可看出，本发明所用活材效价高，亲和力好，仅10％的添加比例，反应度和灵敏度即能达到成品水平，有效降低试剂成本。
[0067]
2、根据说明书要求，配制乳糜干扰样本及血红蛋白干扰样本，利用实施例1～3试剂盒、对照fn试剂盒以及对比例1～2的试剂盒进行检测，待测样本中干扰物质的干扰浓度及检测结果见表6。
[0068]
表6干扰样本测定结果(实施例)
[0069][0070][0071]
表7干扰样本测定结果(对比例1-2)
[0072][0073]
由表6，7可见，实施例1-3在抗乳糜干扰和血红蛋白干扰中，表现优于对照fn试剂
盒，与0干扰样本相比，测值偏差均在10％以内。比对例1-2在抗乳糜干扰和血红蛋白干扰中，表现较差。其中，乳糜干扰与0干扰样本相比，偏差已超过20％。
[0074]
本发明实施例与对比例2的区别在于：
[0075]
①
本发明实施例r1使用聚氧乙烯月桂醚和/或聚乙二醇单异十三烷基醚和/或胆酸钠复配，而对比例2采用的是聚乙二醇单异十三烷基醚和/或吐温20复配。测试结果表明，使用聚氧乙烯月桂醚、聚乙二醇单异十三烷基醚和胆酸钠复配对抗干扰性能有利。
[0076]
3、采用实施例3和对比例3对三种不同类型血浆管样本及血清样本(三种不同类型血浆管：edta血浆管、柠檬酸钠血浆管、肝素血浆管)进行测定(数据参见表8)，所得纤维连接蛋白的测定值与对照fn试剂盒(普通免疫比浊)测定值进行比较(参见图1-2，并进行回归分析)；实施例3获得相关性r2＝0.9957(y＝0.9937x-6.2614)；显示出实施例3与对照fn试剂盒(普通免疫比浊法)具有良好的相关性，而对比例3由于edta样本测值偏差较大，整体相关性r2＝0.5816(y＝0.7266x+24.919)。
[0077]
由此可知，本发明实施例3和对比例3采用不同浓度的nacl和表面活性剂配方，实施例3与对照试剂相比测值相关性较好，而对比例3测edta血浆样本整体测值偏低。说明本发明试剂盒能有效消除不同类型血浆管之间的测值差异。
[0078]
表8对比例3和实施例3测临床病人样本测定结果
[0079]
[0080]
[0081][0082]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。