一种乳铁蛋白检测设备可靠性验证方法与流程

1.本发明涉及乳制品检测领域，特别是一种乳铁蛋白检测设备可靠性验证方法。


背景技术：

2.乳铁蛋白又称为乳转铁蛋白或红蛋白，是一种红色糖蛋白，在泪液、汗液、精液、胆汁、乳汁及血液中性粒细胞中广泛存在，尤其在初乳中含量最高，可达7g/l。乳铁蛋白结构与血清转转蛋白相似，牛和人乳铁蛋白分别由689、691个氨基酸组成，其中谷氨酸、天冬氨酸及丙氨酸含量较高，半胱氨酸含量较少，基本不含硫氨酸。乳铁蛋白与铁的亲和力明显高于血清转铁蛋白，每个乳铁蛋白可结合两分子三价铁及两分子hco3-或co32-。
3.近年来，随着乳铁蛋白相关研究发布，科学家确定了其对人体的具有多个功能，包括：提高肠道对铁离子的吸收、广谱抗菌和抑菌、抗病毒、抗氧化、抗癌、调节免疫等。
4.由于乳铁蛋白具有上述多种生理功能，因此，其在贫血及骨质疏松等疾病的诊治中均有着重要的作用。乳铁蛋白被公认是一种天然、安全的功能性蛋白，在保健食品及药品中均有着广泛的应用前景，也受到有关生厂商的格外重视。gb2760文件中明确将乳铁蛋白作为乳制品添加剂，可将其应用于婴儿配方奶粉、幼儿奶粉及学生奶粉中，使用量为30-100mg/100g。因此，对乳铁蛋白灵敏快速的检测，对于市售乳制品的质量监督具有重大意义。
5.目前市面上存在各种检测手段用于乳铁蛋白的检测，其中以专业的实验室检测为主，但是实验室检测需要用到专业的检测仪器并具有与之相相匹配的能力，而人们日常生活或者一般企业均不具备相对应的检测条件或检测能力，为此人们通常只能将其送往具备检测条件的检测机构检测，非常不方便。
6.为了满足市场需求，解决日常检测使用的需要，市面上开始逐渐出现能方便、快速检测乳铁蛋白含量的简易检测设备，这些简易检测设备通常为试剂盒。
7.但是，这些简易检测设备因为并没有很好的约束，其检测能力是否真实可靠并不清楚，且目前也没有一个统一、切实有效的验证方法来验证这些简易检测设备的可靠性。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于，提供一种乳铁蛋白检测设备可靠性验证方法。本发明提出一种统一且切实有效的用于检验乳铁蛋白检测设备检测能力的验证方法，具有能规范市场、确保检测设备检测能力真实可靠的优点。
9.本发明的技术方案：一种乳铁蛋白检测设备可靠性验证方法，包括如下流程：
10.a、标准品制备：根据标准物质添加量，按比例稀释阴性质控样品，制得不同比例的标准品；所述标准物质为乳铁蛋白；所述阴性质控样品为不含乳铁蛋白的脱脂奶粉；所述标准品为乳铁蛋白标准品；
11.b、溶液制备：将酶标板微孔分为标准品孔和样品孔；向标准品孔中加入不同比例的100μl标准品，然后在样品孔中加入100μl稀释后的样品溶液，于室温条件下进行孵育
60min；所述样品溶液由脱脂奶粉制备而成，其浓度在标准品覆盖范围之内；
12.c、重复洗涤：除去温育后酶标板微孔中的液体，并向每个微孔加入250μl稀释后的洗涤液，放置10s后倒掉液体；重复4次后1吸水纸上拍打酶标板；
13.d、酶标记抗体孵育：向每个酶标板微孔中加入100μl酶标记抗体，与室温下孵育60min；所述酶标记抗体为一种结合物，能与目标物结合用于标记；
14.e、重复洗涤：除去温育后酶标板微孔中的液体，并向每个微孔加入250μl稀释后的洗涤液，放置10s后倒掉液体；重复4次后1吸水纸上拍打酶标板；
15.f、底物显色反应：在每个酶标板微孔中加入100μl底物试剂，室温避光下反应15min；底物试剂类似于催化剂，用于加速目标物与结合物反应；
16.g、测定od值：显色反应结束后向每个酶标板微孔加入50μl终止液，用酶标仪在450nm波长下在5min内测定所有标准品和样品的od值；所述终止液为高浓度硫酸，用于破坏组分从而终止反应；
17.h、结果计算：利用od值或％od值与乳铁蛋白标准品的浓度构建剂量反应曲线，读取样品中乳铁蛋白浓度；
18.i、检测设备准确度和精密度检测：以回收率为准确度评价指标，以重复测定某一浓度样品的检测结果变异系数为精密度评价指标，对检测设备进行检测；
19.j、检测设备灵敏度检测：以检测限为灵敏度评价指标，对检测设备进行检测；
20.k、第三方检验对比：将检测设备检验结果与第三方检验机构的检验结果进行对比，验证检测设备性能。
21.前述的乳铁蛋白检测设备可靠性验证方法中，步骤a所述的不同比例的标准品，至少包括0、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250和500ng/ml。
22.前述的乳铁蛋白检测设备可靠性验证方法中，步骤h所述的结果计算，其具体内容如下：
23.所述剂量反应曲线以od值或％0d值为纵坐标，标准品中乳铁蛋白的浓度为横坐标；
24.所述％od值为所获得的标准品或样品的od值与第一个标准品的od值的百分比；所述第一个标准品指乳铁蛋白含量为0的标准，为100％；所述％od值公式为
[0025][0026]
所述样品中乳铁蛋白浓度为剂量反应曲线读取结果乘以稀释倍数。
[0027]
前述的乳铁蛋白检测设备可靠性验证方法中，步骤i所述的检测设备准确度和精密度检测，其具体步骤如下：
[0028]
i1、试验样品制备：按步骤a-f制备多份不同浓度的试验样品，每份试验样品分成多份由多人进行实验；
[0029]
i2、试验样品检测：利用检测设备对实验样品进行检测并记录测定数据；
[0030]
i3、检测结果对比：计算并将检测设备检测结果与实验样品浓度进行对比。
[0031]
前述的乳铁蛋白检测设备可靠性验证方法中，所述回收率的计算公式为，回收率(％)＝实际测定量/真实值
×
100％，其中真实值为模拟样品的添加浓度；
[0032]
所述变异系数计算公式为，cv％＝sd/x
×
100％，其中cv％为变异系数，sd为测定
数据的标准偏差，x为测定数据的平均值。
[0033]
前述的乳铁蛋白检测设备可靠性验证方法中，步骤j所述的检测设备灵敏度检测，其具体步骤如下：
[0034]
j1、试验样品制备：按步骤a-f制备乳铁蛋白空白的奶粉样品多个；
[0035]
j2、试验样品测定：每个试验样品取多份进行检测，并记录检测数据；
[0036]
j3、检测结果计算：检测限计算公式为lod＝x+3
×
sd，其中lod为检测限，sd为重复测定试验样品的标准偏差，x为重复测定试验样品的平均值。
[0037]
与现有技术相比，本发明通过提供一种乳铁蛋白检测设备可靠性验证方法，先制备不同乳铁蛋白浓度的标准品，然后利用该标准品从准确度、精密度和灵敏度三方面对待检测的乳铁蛋白检测设备进行检测对比，最后还利用第三方检验机构进行检测对比，从而能有效检测该乳铁蛋白检测设备的可靠性，确保其检测能力真实有效，防止因检测设备检测能力异常导致乳制品等检测结果出现问题，降低经济损失；
[0038]
所以，本发明具有能规范市场、确保检测设备检测能力真实可靠的优点。
附图说明
[0039]
图1是本发明验证方法的流程图。
具体实施方式
[0040]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
[0041]
实施例。一种乳铁蛋白检测设备可靠性验证方法，如图1所示，包括如下流程：
[0042]
a、标准品制备：根据标准物质添加量，按比例稀释阴性质控样品，制得不同比例的标准品；所述标准物质为上海安谱实验科技股份有限公司制备的纯度95％的乳铁蛋白；所述阴性质控样品为经过hplc-ms/ms确证不含任何乳铁蛋白的脱脂奶粉；所述标准品为乳铁蛋白标准品；
[0043]
b、溶液制备：将酶标板微孔分为标准品孔和样品孔；向标准品孔中加入不同比例的100μl标准品，然后在样品孔中加入100μl稀释后的样品溶液，于室温条件下进行孵育60min；
[0044]
c、重复洗涤：除去温育后酶标板微孔中的液体，并向每个微孔加入250μl稀释后的洗涤液，放置10s后倒掉液体；重复4次后1吸水纸上拍打酶标板；
[0045]
d、酶标记抗体孵育：向每个酶标板微孔中加入100μl酶标记抗体，与室温下孵育60min；所述酶标记抗体为一种结合物，能与目标物结合用于标记；
[0046]
e、重复洗涤：除去温育后酶标板微孔中的液体，并向每个微孔加入250μl稀释后的洗涤液，放置10s后倒掉液体；重复4次后1吸水纸上拍打酶标板；
[0047]
f、底物显色反应：在每个酶标板微孔中加入100μl底物试剂，室温避光下反应15min；底物试剂类似于催化剂，用于加速目标物与结合物反应；
[0048]
g、测定od值：显色反应结束后向每个微孔加入50μl终止液，用酶标仪在450nm波长下在5min内测定所有标准品和样品的od值；
[0049]
h、结果计算：利用od值或％od值与乳铁蛋白标准品的浓度构建剂量反应曲线，读
取样品中乳铁蛋白浓度；
[0050]
i、检测设备准确度和精密度检测：以回收率为准确度评价指标，以重复测定某一浓度样品的检测结果变异系数为精密度评价指标，对检测设备进行检测；
[0051]
j、检测设备灵敏度检测：以检测限为灵敏度评价指标，对检测设备进行检测；
[0052]
k、第三方检验对比：将检测设备检验结果与第三方检验机构的检验结果进行对比，验证检测设备性能。
[0053]
所述待检测的检测设备为由北京某公司生产的乳铁蛋白检测用试剂盒。
[0054]
步骤a所述的不同比例的标准品，其比例为：0、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250和500ng/ml。
[0055]
步骤h所述的结果计算，其具体内容如下：
[0056]
所述剂量反应曲线以％0d值为纵坐标，标准品中乳铁蛋白的浓度[ppb]为横坐标；
[0057]
所述％od值为所获得的标准品或样品的od值与第一个标准品的od值的百分比；所述第一个标准品指乳铁蛋白含量为0的标准，为100％；所述％od值公式为
[0058][0059]
所述样品中乳铁蛋白浓度为剂量反应曲线读取结果乘以稀释倍数。
[0060]
步骤i所述的检测设备准确度和精密度检测，其具体步骤如下：
[0061]
i1、试验样品制备：按步骤a-f制备两份不同浓度的试验样品，每份试验样品分成3份由2位实验员进行实验；
[0062]
i2、试验样品检测：利用检测设备对实验样品进行检测并记录测定数据；
[0063]
i3、检测结果对比：计算并将检测设备检测结果与实验样品浓度进行对比。
[0064]
所述回收率的计算公式为，回收率(％)＝实际测定量/真实值
×
100％，其中真实值为模拟样品的添加浓度；所述真实值就是添加值，在样品中添加已知的标准品
[0065]
所述变异系数计算公式为，cv％＝sd/x
×
100％，其中cv％为变异系数，sd为测定数据的标准偏差，x为测定数据的平均值。
[0066]
每份试验样品重复测定5次，测定结果为：
[0067][0068]
步骤j所述的检测设备灵敏度检测，其具体步骤如下：
[0069]
j1、试验样品制备：按步骤a-f制备乳铁蛋白空白的奶粉样品8个；
[0070]
j2、试验样品测定：每个试验样品取3份进行检测，并记录检测数据；
[0071]
j3、检测结果计算：检测限计算公式为lod＝x+3
×
sd，其中lod为检测限，sd为重复测定试验样品的标准偏差，x为重复测定试验样品的平均值。
[0072]
检测结果为：
[0073]
[0074][0075]
步骤k所述的第三方检验对比，其具体内容如下：
[0076]
根据gb/t 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检验》的要求，当被测组分的含量在10～1000mg/kg范围内时，测定含量的平均值与真值偏差范围应小于15％，根据本方法对2017.2.16生产的北欧莎能1段婴儿配方羊奶粉、北欧莎能2段较大婴儿配方羊奶粉、北欧莎能3段幼儿配方羊奶粉进行了检验，检验结果与山东省食品药品检验研究院进行了比对，比对检验结果如下表：
[0077][0078]
可见，比对结果的偏差均小于15％，符合要求。
[0079]
验证结论：
[0080]
上述多个检测结果验证结果表明，该乳铁蛋白检测用试剂盒对奶粉样品中乳铁蛋白的检测限达到4.42mg/100g，变异系数小于10，回收率处于80％至110％之间，与第三方比对结果偏差符合要求，因此，其灵敏度、准确度、精密度等各项检测性能指标均达到elisa检测技术要求，检测低限满足国内外相关检测要求，其检测能力是可靠的。