一种基于胶体银梯度聚集效应的拉曼光谱检测方法

1.本发明属于拉曼光谱技术检测领域，具体涉及一种基于胶体银梯度聚集效应的拉曼光谱检测方法。


背景技术：

2.芳香染料分子如结晶紫、罗丹明6g、亚甲基蓝、孔雀石绿等是环境中存在的一类有机污染物。他们具有相当广泛的应用，可以作为染料用于纺织品中，此外还由于具有杀菌抑菌的作用在养殖业中备受青睐。然而当这类染料进入生物体内，会产生具有危害性的隐性染料分子，如隐性结晶紫、隐性孔雀石绿等，是水体中的严重污染物，具有高残留、高致癌、高毒性等危害。另外，为了满足农业生产需求，在生产活动使用了大量的农药，给环境和人类带来严重危害。实现对农残、染料、药物等不同分子的快速实时高灵敏度检测对于环境污染监测、水产品食物安全、人类健康等非常重要。
3.表面增强拉曼光谱技术(sers)作为一种分子检测技术，具有无损检测，便捷，指纹识别等优异特点，利用金、银纳米粒子胶体作为增强基底，对分子进行拉曼检测是一种便捷快速的方法。然而在实际检测中，很难实现高灵敏的sers检测。目前利用聚沉法进行拉曼检测主要是将增强基底、待测液与聚沉剂加入样品池中，混匀后进行检测。聚沉剂的种类选择以及加入量会对检测结果产生很大影响。过量的聚沉剂加入会使纳米颗粒发生大量聚集，不仅会对待测分子产生竞争吸附，还会因过度聚集减少分子吸附位点，从而不能获得很好的检测灵敏度。因此，在最优的聚集条件下对待测分子进行检测对获得最佳的信号至关重要。在溶胶法进行拉曼检测的体系中开发新的检测方法，对提高分子的检测能力具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种在银纳米颗粒溶胶中加入聚沉剂，不经过混匀，使银颗粒随聚沉剂的分布产生梯度聚集，银颗粒发生自然聚沉后使溶液产生分层，通过在分层界面处进行检测，获得高灵敏度的基于胶体银梯度聚集效应的拉曼光谱检测方法。
5.在银纳米颗粒和待测液的混合溶液中加入聚沉剂，使银颗粒部分聚集分层，在分层界面处对待测分子进行检测的方法。
6.为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
7.步骤1，制备银纳米颗粒溶胶
8.在锥形瓶中加入75ml的超纯水和10～30ml质量分数为1～2％的柠檬酸钠，搅拌加热到70℃，再加入1.5～2.5ml质量分数为1％的硝酸银和2ml质量分数为0.1～1％的硼氢化钠，继续搅拌均匀得到银纳米颗粒的种子溶液；
9.银纳米颗粒的第二步生长：取2ml质量分数1～2％的柠檬酸钠加入到75ml超纯水中，搅拌加热到110℃，再加入10～20ml种子溶液和1.5～2.5ml质量分数为1％的硝酸银，充分搅拌均匀后再加入2ml质量分数为1～2％柠檬酸钠和1.5～2.5ml质量分数为1％硝酸银
溶液继续反应30分钟，得到第二步生长的银纳米颗粒；
10.将2ml质量分数1～2％的柠檬酸钠加入到80ml超纯水中，搅拌加热到110℃，再加入10～20ml第二步生长的银纳米颗粒和1.5～2.5ml质量分数1％的硝酸银，继续反应30分钟，得到银纳米颗粒溶胶；
11.步骤2，配制不同浓度的待测分子标准溶液作为待测液：
12.取250～500ul银纳米粒子溶胶和1～2ml待测分子标准溶液加入检测池中混匀，然后加入25～100ul浓度为1～1.5mol/l的聚沉剂溶液，保持样品池静置避免聚沉剂在溶液中混匀，使溶胶下层自然地发生团聚而上层仍保持分散状态，样品呈现分层的现象，产生明显的界面，利用便携式拉曼光谱仪，在样品的分层界面处进行检测得到最终检测结果。
13.所述聚沉剂为氯化钠、溴化钠、碘化钠或硫酸镁、氯化钾、溴化钾、碘化钾、氯化镁、溴化镁、碘化镁、氯化钙、溴化钙、硫酸铝。
14.所述步骤2中银纳米粒子溶胶的加入量为500ul。
15.所述步骤2中待测分子标准溶液加入量为2ml。
16.所述步骤2中聚沉剂的加入量为100ul。
17.所述步骤2中聚沉剂的浓度为1.5mol/l。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
19.本发明先在样品池中加入银纳米颗粒溶胶和待测分子标准溶液混匀，接着加入少量的聚沉剂后，保持样品池静置，避免聚沉剂与银胶体和待测液混匀。聚沉剂在样品池中自然地沉向底部，使靠下的银颗粒发生聚集，颜色变深；而靠上的部分银颗粒仍保持分散状态，呈现原本的浅黄色。因此样品池中的银颗粒产生了部分聚集，靠下的聚集区域和靠上的未聚集区域因为颜色不同而呈现出明显的界面。利用便携式拉曼检测仪对样品进行检测，在样品检测池的不同位置处获得强度不同的检测信号，当激光对准在溶胶分层的界面处时，可以获得最佳的检测信号。相比于加入大量聚沉剂使溶液发生整体聚沉，增加了分子的检测灵敏度。所产生的明显界面有利于定位最佳的检测位置进行检测。该方法工艺简单，成本低，耗时短，重复性高，极大的提高了分子检测的灵敏度。
附图说明
20.图1为银纳米颗粒溶胶和待测分子的混合溶液中加入不同量的聚沉剂使银溶胶发生聚沉的光学照片；
21.图2a为银纳米颗粒溶胶和待测分子的混合溶液中加入100ul氯化钠时拉曼检测的示意图；
22.图2b为银纳米颗粒溶胶和结晶紫的混合溶液中加入100ul氯化钠时，激光聚焦在溶液不同位置处检测的拉曼光谱；
23.图3为银纳米颗粒溶胶和结晶紫分子的混合溶液中在加入不同体积氯化钠时检测的拉曼光谱；
24.图4为银纳米颗粒溶胶和不同浓度结晶紫的混合溶液中在加入100ul氯化钠时检测的拉曼光谱；
25.图5为银纳米颗粒溶胶和不同浓度结晶紫的混合溶液中在加入100ul碘化钠时检测的拉曼光谱；
26.图6为银纳米颗粒溶胶和不同浓度结晶紫的混合溶液中在加入100ul溴化钠时检测的拉曼光谱；
27.图7为银纳米颗粒溶胶和不同浓度结晶紫的混合溶液中在加入100ul硫酸镁时检测的拉曼光谱；
28.图8为银纳米颗粒溶胶和不同浓度罗丹明6g的混合溶液中在加入100ul氯化钠时检测的拉曼光谱；
29.图9为银纳米颗粒溶胶和不同浓度亚甲基蓝的混合溶液中在加入100ul氯化钠时检测的拉曼光谱；
30.图10为银纳米颗粒溶胶和不同浓度孔雀石绿的混合溶液中在加入100ul氯化钠时检测的拉曼光谱。
31.图11为银纳米颗粒溶胶和不同浓度敌草快的混合溶液中在加入100ul氯化钠时检测的拉曼光谱。
32.图12为银纳米颗粒溶胶和不同浓度噻菌唑的混合溶液中在加入100ul氯化钠时检测的拉曼光谱。
具体实施方式
33.下面结合附图及实施例对本发明做进一步详细描述。
34.制备银纳米颗粒溶胶
35.在锥形瓶中加入75ml的超纯水和10～30ml质量分数为1～2％的柠檬酸钠，搅拌加热到70℃，再加入1.5～2.5ml质量分数为1％的硝酸银和2ml质量分数为0.1～1％的硼氢化钠，继续搅拌均匀得到银纳米颗粒的种子溶液；
36.银纳米颗粒的第二步生长：取2ml质量分数1～2％的柠檬酸钠加入到75ml超纯水中，搅拌加热到110℃，再加入10～20ml种子溶液和1.5～2.5ml质量分数为1％的硝酸银，充分搅拌均匀后再加入2ml质量分数为1～2％柠檬酸钠和1.5～2.5ml质量分数为1％硝酸银溶液继续反应30分钟，得到第二步生长的银纳米颗粒；
37.将2ml质量分数1～2％的柠檬酸钠加入到80ml超纯水中，搅拌加热到110℃，再加入10～20ml第二步生长的银纳米颗粒和1.5～2.5ml质量分数1％的硝酸银，继续反应30分钟，得到银纳米颗粒溶胶。
38.图1为不同体积聚沉剂诱导样品池中的银纳米颗粒溶胶产生聚集后的光学照片。样品池中加入银纳米颗粒溶胶和待测样品混匀后，加入聚沉剂后，保持溶液静置，使聚沉剂不与待测液混匀，自然地发生聚沉现象。当聚沉剂的加入量超过100ul时，样品池中的溶胶全部发生聚集，溶胶颜色整体变深。聚沉剂加入量不超过100ul时，溶胶只有靠下的部分发生聚集。聚集的部分颜色变深，与未聚集的部分产生明显的界面。
39.图2a为向银纳米颗粒溶胶和待测液的混合溶液中加入100ul聚沉剂后进行拉曼检测的示意图。激光对准分层界面处进行检测。
40.实施例1：
41.步骤1，制备银纳米颗粒溶胶
42.在锥形瓶中加入75ml的超纯水和20ml质量分数为1％的柠檬酸钠，搅拌加热到70℃，再加入1.7ml质量分数为1％的硝酸银和2ml质量分数为1％的硼氢化钠，继续搅拌均匀
得到银纳米颗粒的种子溶液；
43.银纳米颗粒的第二步生长：取2ml质量分数1％的柠檬酸钠加入到75ml超纯水中，搅拌加热到110℃，再加入10ml种子溶液和1.7ml质量分数为1％的硝酸银，充分搅拌均匀后再加入2ml质量分数为1％柠檬酸钠和1.7ml质量分数为1％硝酸银溶液继续反应30分钟，得到第二步生长的银纳米颗粒；
44.将2ml质量分数1％的柠檬酸钠加入到80ml超纯水中，搅拌加热到110℃，再加入10ml第二步生长的银纳米颗粒和1.7ml质量分数1％的硝酸银，继续反应30分钟，得到银纳米颗粒溶胶；
45.步骤2，配制不同浓度的待测分子标准溶液作为待测液：
46.配制0.01mol/l的结晶紫标准溶液，将该溶液稀释得到10-8
mol/l的标准待测液。取500ul银纳米粒子溶胶和2ml标准待测液加入检测池中混匀，然后加入100ul浓度为1.5mol/l的聚沉剂氯化钠，不混匀样品，保持样品池静置使溶胶自然地发生聚集，溶胶靠下的部分发生聚集，与上层未聚集的部分产生了明显的界面。激光聚焦在溶液的不同位置，从底部开始向上，每隔1mm位置进行检测。拉曼光谱仪功率为300mw，激光波长785nm，积分时间20s。
47.实施例1中，样品在加入100ul体积氯化钠产生分层现象后，在溶液不同位置处检测的拉曼光谱如图2b所示，当激光聚焦的位置在界面处时，获得最优的检测信号。
48.实施例2
49.步骤1，制备银纳米颗粒溶胶
50.在锥形瓶中加入75ml的超纯水和10ml质量分数为2％的柠檬酸钠，搅拌加热到70℃，再加入1.5ml质量分数为1％的硝酸银和2ml质量分数为0.5％的硼氢化钠，继续搅拌均匀得到银纳米颗粒的种子溶液；
51.银纳米颗粒的第二步生长：取2ml质量分数2％的柠檬酸钠加入到75ml超纯水中，搅拌加热到110℃，再加入15ml种子溶液和1.5ml质量分数为1％的硝酸银，充分搅拌均匀后再加入2ml质量分数为2％柠檬酸钠和1.5ml质量分数为1％硝酸银溶液继续反应30分钟，得到第二步生长的银纳米颗粒；
52.将2ml质量分数2％的柠檬酸钠加入到80ml超纯水中，搅拌加热到110℃，再加入15ml第二步生长的银纳米颗粒和1.5ml质量分数1％的硝酸银，继续反应30分钟，得到银纳米颗粒溶胶；
53.步骤2，配制不同浓度的待测分子标准溶液作为待测液：
54.配制0.01mol/l的结晶紫标准溶液，将该溶液依次稀释得到10-7
mol/l-10-16
mol/l的标准待测液。取500ul银纳米粒子胶体放入样品检测池中，加入2ml浓度为10-8
mol/l的结晶紫待测液混匀。接着分别加入500ul、400ul、300ul、200ul、100ul、75ul、50ul、25ul浓度为1.5mol/l的氯化钠溶液，不混匀样品，使溶胶自然地发生聚集。当氯化钠体积超过100ul时，银纳米颗粒整体发生聚集，颜色变为深灰色，利用便携式拉曼光谱仪对溶液进行检测；当氯化钠体积没有超过100ul时，溶胶靠下的部分发生聚集，与上层未聚集的部分产生了明显的界面，激光聚焦在界面处进行检测。拉曼光谱仪功率为300mw,激光波长785nm，积分时间20s。
55.实施例2中，样品在加入不同体积氯化钠时检测的拉曼光谱如图3所示，当聚沉剂的体积为100ul时，获得最优的检测信号。
56.实施例3
57.步骤1，制备银纳米颗粒溶胶
58.在锥形瓶中加入75ml的超纯水和15ml质量分数为1.5％的柠檬酸钠，搅拌加热到70℃，再加入2.3ml质量分数为1％的硝酸银和2ml质量分数为0.8％的硼氢化钠，继续搅拌均匀得到银纳米颗粒的种子溶液；
59.银纳米颗粒的第二步生长：取2ml质量分数1.5％的柠檬酸钠加入到75ml超纯水中，搅拌加热到110℃，再加入13ml种子溶液和2.3ml质量分数为1％的硝酸银，充分搅拌均匀后再加入2ml质量分数为1.5％柠檬酸钠和2.3ml质量分数为1％硝酸银溶液继续反应30分钟，得到第二步生长的银纳米颗粒；
60.将2ml质量分数1.5％的柠檬酸钠加入到80ml超纯水中，搅拌加热到110℃，再加入13ml第二步生长的银纳米颗粒和2.3ml质量分数1％的硝酸银，继续反应30分钟，得到银纳米颗粒溶胶；
61.步骤2，配制不同浓度的待测分子标准溶液作为待测液：
62.配制0.01mol/l的结晶紫标准溶液，将该溶液依次稀释得到10-8
mol/l-10-16
mol/l的标准待测液。取500ul银纳米粒子溶胶放入样品检测池中，分别加入2ml不同浓度的结晶紫待测液混匀。接着加入100ul浓度为1.5mol/l的聚沉剂氯化钠溶液。溶胶靠下的部分发生聚集，与上层未聚集的部分产生了明显的界面。激光聚焦在分层的界面处进行检测。拉曼光谱仪功率为300mw，激光波长785nm，积分时间20s。
63.实施例3中不同浓度的待测样品在加入100ul氯化钠后，在溶胶发生分层的界面处检测的拉曼光谱如图4所示，在该实施例中，可以检测到10-15
mol/l的结晶紫信号。
64.实施例4
65.步骤1，制备银纳米颗粒溶胶
66.在锥形瓶中加入75ml的超纯水和25ml质量分数为1.8％的柠檬酸钠，搅拌加热70℃，再加入2.5ml质量分数为1％的硝酸银和2ml质量分数为0.6％的硼氢化钠，继续搅拌均匀得到银纳米颗粒的种子溶液；
67.银纳米颗粒的第二步生长：取2ml质量分数1.8％的柠檬酸钠加入到75ml超纯水中，搅拌加热到110℃，再加入18ml种子溶液和2.5ml质量分数为1％的硝酸银，充分搅拌均匀后再加入2ml质量分数为1.8％柠檬酸钠和2.5ml质量分数为1％硝酸银溶液继续反应30分钟，得到第二步生长的银纳米颗粒；
68.将2ml质量分数1.8％的柠檬酸钠加入到80ml超纯水中，搅拌加热到110℃，再加入18ml第二步生长的银纳米颗粒和2.5ml质量分数1％的硝酸银，继续反应30分钟，得到银纳米颗粒溶胶；
69.步骤2，配制不同浓度的待测分子标准溶液作为待测液：
70.配制0.01mol/l的结晶紫标准溶液，将该溶液依次稀释得到10-8
mol/l-10-16
mol/l的标准待测液。取500ul银纳米粒子溶胶放入样品检测池中，分别加入2ml不同浓度的结晶紫待测液混匀。接着加入100ul浓度为1.5mol/l的聚沉剂碘化钠溶液。溶胶靠下的部分发生聚集，与上层未聚集的部分产生了明显的界面。激光聚焦在分层的界面处进行检测。拉曼光谱仪功率为300mw，激光波长785nm，积分时间20s。
71.实施例4中不同浓度的待测样品在加入100ul碘化钠后，在溶胶发生分层的界面处
检测的拉曼光谱如图5所示，在该实施例中，可以检测到10-13
mol/l的结晶紫信号。
72.实施例5：
73.步骤1，制备银纳米颗粒溶胶
74.在锥形瓶中加入75ml的超纯水和30ml质量分数为1.3％的柠檬酸钠，搅拌加热到70℃，再加入2ml质量分数为1％的硝酸银和2ml质量分数为0.1％的硼氢化钠，继续搅拌均匀得到银纳米颗粒的种子溶液；
75.银纳米颗粒的第二步生长：取2ml质量分数1.3％的柠檬酸钠加入到75ml超纯水中，搅拌加热到110℃，再加入20ml种子溶液和2ml质量分数为1％的硝酸银，充分搅拌均匀后再加入2ml质量分数为1.3％柠檬酸钠和2ml质量分数为1％硝酸银溶液继续反应30分钟，得到第二步生长的银纳米颗粒；
76.将2ml质量分数1.3％的柠檬酸钠加入到80ml超纯水中，搅拌加热到110℃，再加入20ml第二步生长的银纳米颗粒和2ml质量分数1％的硝酸银，继续反应30分钟，得到银纳米颗粒溶胶；
77.配制0.01mol/l的结晶紫标准溶液，将该溶液依次稀释得到10-8
mol/l-10-16
mol/l的标准待测液。取400ul银纳米粒子溶胶放入样品检测池中，分别加入1.8ml不同浓度的结晶紫待测液混匀。接着加入100ul浓度为1mol/l的聚沉剂溴化钠溶液。溶胶靠下的部分发生聚集，与上层未聚集的部分产生了明显的界面。激光聚焦在分层的界面处进行检测。拉曼光谱仪功率为300mw,激光波长785nm，积分时间20s。
78.实施例5中不同浓度的待测样品在加入100ul溴化钠后，在溶胶发生分层的界面处检测的拉曼光谱如图6所示，在该实施例中，可以检测到10-15
mol/l的结晶紫信号。
79.实施例6
80.步骤1，制备银纳米颗粒溶胶，同实施例1；
81.配制0.01mol/l的结晶紫标准溶液，将该溶液依次稀释得到10-8
mol/l-10-16
mol/l的标准待测液。取500ul银纳米粒子溶胶放入样品检测池中分别加入2ml不同浓度的结晶紫待测液混匀。接着加入100ul浓度为1.5mol/l的聚沉剂硫酸镁溶液。溶胶靠下的部分发生聚集，与上层未聚集的部分产生了明显的界面。激光聚焦在分层的界面处进行检测。拉曼光谱仪功率为300mw，激光波长785nm，积分时间20s。
82.实施例6中不同浓度的待测样品在加入100ul硫酸镁后，在溶胶发生分层的界面处检测的拉曼光谱如图7所示，在该实施例中，可以检测到10-15
mol/l的结晶紫信号。
83.实施例7
84.步骤1，制备银纳米颗粒溶胶，同实施例1；
85.配制0.01mol/l的罗丹明6g标准溶液，将该溶液依次稀释得到10-8
mol/l-10-16
mol/l的标准待测液。取500ul银纳米粒子溶胶放入样品检测池中，分别加入2ml不同浓度的罗丹明6g待测液混匀。接着加入100ul浓度为1.5mol/l的聚沉剂氯化钠溶液。溶胶靠下的部分发生聚集，与上层未聚集的部分产生了明显的界面。激光聚焦在分层的界面处进行检测。拉曼光谱仪功率为300mw，激光波长785nm，积分时间20s。
86.实施例7中不同浓度的待测样品在加入100ul氯化钠后，在溶胶发生分层的界面处检测的拉曼光谱如图8所示，在该实施例中，可以检测到10-14
mol/l的罗丹明6g信号。
87.实施例8
88.步骤1，制备银纳米颗粒溶胶，同实施例1；
89.配制0.01mol/l的亚甲基蓝标准溶液，将该溶液依次稀释得到10-8
mol/l-10-16
mol/l的标准待测液。取500ul银纳米粒子溶胶放入样品检测池中，分别加入2ml不同浓度的亚甲基蓝待测液混匀。接着加入100ul浓度为1.5mol/l的聚沉剂氯化钠溶液。溶胶靠下的部分发生聚集，与上层未聚集的部分产生了明显的界面。激光聚焦在分层的界面处进行检测。拉曼光谱仪功率为300mw，激光波长785nm，积分时间20s。
90.实施例8中不同浓度的待测样品在加入100ul氯化钠后，在溶胶发生分层的界面处检测的拉曼光谱如图9所示，在该实施例中，可以检测到10-15
mol/l的亚甲基蓝信号。
91.实施例9
92.步骤1，制备银纳米颗粒溶胶，同实施例1；
93.配制0.01mol/l的孔雀石绿标准溶液，将该溶液依次稀释得到10-8
mol/l-10-16
mol/l的标准待测液。取500ul银纳米粒子溶胶放入样品检测池中，分别加入2ml不同浓度的孔雀石绿待测液混匀。接着加入100ul浓度为1.5mol/l的聚沉剂氯化钠溶液。溶胶靠下的部分发生聚集，与上层未聚集的部分产生了明显的界面。激光聚焦在分层的界面处进行检测。拉曼光谱仪功率为300mw，激光波长785nm，积分时间20s。
94.实施例9中不同浓度的待测样品在加入100ul氯化钠后，在溶胶发生分层的界面处检测的拉曼光谱如图10所示，在该实施例中，可以检测到10-14
mol/l的孔雀石绿信号。
95.实施例10
96.步骤1，制备银纳米颗粒溶胶，同实施例1；
97.配制0.01mol/l的敌草快标准溶液，将该溶液依次稀释得到10-8
mol/l-10-13
mol/l的标准待测液。取500ul银纳米粒子溶胶放入样品检测池中，分别加入2ml不同浓度的敌草快待测液混匀。接着加入100ul浓度为1.5mol/l的聚沉剂氯化钠溶液。溶胶靠下的部分发生聚集，与上层未聚集的部分产生了明显的界面。激光聚焦在分层的界面处进行检测。拉曼光谱仪功率为300mw，激光波长785nm，积分时间20s。
98.实施例10中不同浓度的待测样品在加入100ul氯化钠后，在溶胶发生分层的界面处检测的拉曼光谱如图11所示，在该实施例中，可以检测到10-12
mol/l的敌草快信号。
99.实施例11
100.步骤1，制备银纳米颗粒溶胶，同实施例1；
101.配制0.01mol/l的噻菌唑标准溶液，将该溶液依次稀释得到10-8
mol/l-10-12
mol/l的标准待测液。取500ul银纳米粒子溶胶放入样品检测池中，分别加入2ml不同浓度的噻菌唑待测液混匀。接着加入100ul浓度为1.5mol/l的聚沉剂氯化钠溶液。溶胶靠下的部分发生聚集，与上层未聚集的部分产生了明显的界面。激光聚焦在分层的界面处进行检测。拉曼光谱仪功率为300mw，激光波长785nm，积分时间20s。
102.实施例11中不同浓度的待测样品在加入100ul氯化钠后，在溶胶发生分层的界面处检测的拉曼光谱如图12所示，在该实施例中，可以检测到10-11
mol/l的噻菌唑信号。