一种PSEP胶体金试纸，试剂盒及其制备方法和应用与流程

一种psep胶体金试纸，试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于慢性前列腺炎诊断试剂领域，具体公开了一种psep胶体金试纸，试剂盒及其制备方法和应用。


背景技术：

2.慢性前列腺炎(chronic prostatitis，cp)是泌尿外科中青年男性最常见的疾病之一。说明潜在的慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛(cpps)患者众多，同时，由化学品、物理因素或生物制剂引起的炎症过程还是人类癌症的发病机制中重要因子。在前列腺癌中，炎症的存在及细胞上皮组织损伤后再生被认为是恶性转化的关键因素。前列腺组织受到炎性细胞的浸润，从而释放出各种活性物质，这些物质的释放还与细菌及病毒感染、尿酸增高及食用前列腺致癌物有关。在过去 10年中，炎症和癌症之间的联系，以及前列腺炎作为前列腺癌高危因素的假说已经在流行病学、临床、形态学、病原学、细胞和分子水平上进行充分的研究并得到证实。事实上，文献中指出，大约12％以上前列腺炎症，如不及时治疗可转化为前列腺癌。所以前列腺炎严重影响男性健康。
3.前列腺炎临床表现因患者个体差异而缺乏特异性，因此在临床上治疗效果一直不满意。根据1997年美国国立卫生研究院(nih)对前列腺炎的分类，即nih 分类法，包括ⅰ型:急性细菌性前列腺炎(abp)；ⅱ型:慢性细菌性前列腺炎 (cbp)；ⅲ型:又分为ⅲa，慢性非细菌性前列腺炎(cap)和ⅲb，慢性骨盆疼痛综合征(cpps)；ⅳ型:无症状的炎症性前列腺炎(aip)。临床实践中，通常以ⅲ型慢性前列腺炎多见，约占90％左右，所以慢性前列腺炎主要指的是ⅲ型慢性前列腺炎。在临床实际工作中，泌尿男科医师对首诊的cap和cpps患者选择的检查方法(多选)前3位是尿常规(80.3％)、前列腺按摩液检查 (71.0％)、体检(包括直肠指检)(63.2％)。前列腺按摩液检查和直肠指检对患者有一定侵入性，而大多数诊断却仍然依赖于临床表征和医生经验。因此非常需要简便无侵入性，同时准确可靠的诊断方法。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明公开了一种psep胶体金试纸，试剂盒及其制备方法和应用，psep为人前列腺小体外泄蛋白的缩写，下同。
5.本发明的技术方案如下：
6.一种psep胶体金试纸，所述psep胶体金试纸基于胶体金免疫层析双抗体夹心法制成，用于定性检测尿液标本中的psep含量；所述试纸依次包括样品垫、免疫胶体金垫、检测区t和质控区c所在的酸纤维素膜、吸水垫；在试剂条的免疫胶体金垫内包被有psep抗体一号，检测区包被有psep抗体二号，质控区包被有羊抗兔igg抗体；所述psep抗体一号为鼠抗人psep，所述psep抗体二号为兔抗人psep。将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通
过肉眼观察到显色结果。本法方便快捷，普通人即可操作。
7.进一步的，上述一种psep胶体金试纸，胶体金试纸条的样品垫为玻璃纤维素膜，吸水垫为吸水纸，试纸条的宽度为2-4mm；t线和c线的各相邻线的间隔为3-7mm；样品垫与免疫胶体金垫之间重叠2-4mm；免疫胶体金垫与检测区t、质控区c所在的硝酸纤维素膜之间重叠1-3mm；硝酸纤维素膜与吸水垫之间重叠 2-4mm。经过多次实验，发现t线和c线的各相邻线的间隔为3-7mm，进一步的，为5mm时，分辨率最高。
8.进一步的，上述一种psep胶体金试纸的制备方法，包括以下步骤：
9.(1)将氯金酸溶液均匀分散于纯化水中，配置成浓度0.005-0.02％的氯金酸溶液；
10.(2)将250-1000ml氯金酸溶液转入烧瓶中，加热至沸腾；
11.(3)向沸腾溶液中加入5-15ml，1-3％的柠檬酸钠溶液后，继续加热反,5-15min，将烧瓶中制备完成的胶体金倒出冷却至室温备用；
12.(4)取制备的胶体金，向其中加入pb溶液调整ph至6-7后，加入psep 抗体一号，终浓度1-3mg/1000ml，搅拌混匀，室温条件下反应15-45min；
13.(5)向上一步反应完成的液体中加入封闭缓冲液，搅拌混匀，室温条件下反应15-45min；
14.(6)取反应完成的液体，放入离心机中，4000-6000g离心10-30min，弃去上清，加入封闭缓冲液重悬，浓缩5-15倍作为金标浓缩液备用；
15.(7)取步骤(6)中的金标浓缩液，用喷金机喷涂到处理好的玻璃纤维素膜上，烘干48-96h制成免疫胶体金垫；
16.(8)取羊抗兔igg抗体作为c线抗体，和psep抗体二号作为t线抗体，用包被稀释液稀释成终浓度均为0.5-2mg/ml，使用划膜仪将c、t线稀释抗体包被至硝酸纤维素膜上，30-40℃烘干48-96h备用；
17.(9)将烘干完成的玻璃纤维膜和硝酸纤维素膜黏贴于pvc底板上，斩切成 2-4mm宽的试纸条。
18.上述制备方法流程短，条件温和，对设备要求低，制备效率高，可大规模工业化应用。
19.进一步的，上述一种psep胶体金试纸的制备方法，所述步骤(4)中的封闭缓冲液的制备步骤为：60ml纯化水中加入2.5g bsa、4.25g蔗糖、6.35g peg4000、 30ml 0.5m硼砂缓冲液、500ul tritonx-100；
20.上述缓冲液封闭效果好，制备简单，成本低。
21.所述步骤(7)中的玻璃纤维素膜处理液的制备步骤为：95ml纯化水中加入 1g peg20000、1.5g bsa、5ml 10％tween-20、10ul 10％nan3；每张a4纸大小的玻璃纤维素膜使用50ml处理液浸泡后，37℃烘干24h备用；
22.上述玻璃纤维素膜处理液不含有害成分，制备简单，处理效果佳。
23.所述步骤(8)中的包被稀释液的制备步骤为：89.5ml纯化水中加入10ml 0.5m pb、0.25g海藻糖、0.02g胆酸钠、200ul tween-20。
24.上述包被稀释液是否适合本发明所述的抗体进行包被，包被效率高。
25.进一步的，上述一种psep胶体金试纸的制备方法，包括以下步骤：
26.(1)将氯金酸溶液均匀分散于纯化水中，配置成浓度0.01％的氯金酸溶液；
27.(2)将500ml氯金酸溶液转入烧瓶中，加热至沸腾；
28.(3)向沸腾溶液中加入10ml 2％的柠檬酸钠溶液后，继续加热反应10min，将烧瓶中制备完成的胶体金倒出冷却至室温备用；
29.(4)取制备的胶体金，向其中加入pb溶液调整ph至6-7后，加入psep 结合抗体一号，终浓度2mg/1000ml，搅拌混匀，室温条件下反应30min；
30.(5)向上一步反应完成的液体中加入封闭缓冲液，搅拌混匀，室温条件下反应30min；
31.封闭缓冲液制备：60ml纯化水中加入2.5g bsa、4.25g蔗糖、6.35g peg4000、 30ml 0.5m硼砂缓冲液、500ul tritonx-100；
32.(6)取反应完成的液体，放入离心机中，5000g离心20min，弃去上清，加入封闭缓冲液重悬，浓缩十倍作为金标浓缩液备用；
33.(7)取步骤(6)中的金标浓缩液，用喷金机喷涂到处理好的玻璃纤维素膜上，烘干72h制成免疫胶体金垫；
34.其中玻璃纤维素膜处理液制备：95ml纯化水中加入1g peg20000、1.5g bsa、 5ml 10％tween-20、10ul 10％nan3；
35.每张a4纸大小的玻璃纤维素膜使用50ml处理液浸泡后，37℃烘干24h备用；
36.(8)取羊抗兔igg抗体作为c线抗体，和psep抗体二号作为t线抗体，用包被稀释液稀释，终浓度均为1mg/ml，使用划膜仪将c、t线稀释抗体包被至硝酸纤维素膜上，37℃烘干72h备用；
37.其中包被稀释液制备：89.5ml纯化水中加入10ml 0.5m pb、0.25g海藻糖、 0.02g胆酸钠、200ul tween-20；
38.(9)将烘干完成的玻璃纤维膜和硝酸纤维素膜黏贴于pvc底板上，斩切成 3mm宽的试纸条。
39.上述制备方法流程短，条件温和，对设备要求低，制备效率高，可大规模工业化应用。
40.进一步的，上述psep胶体金试纸在制备用于检测慢性前列腺炎的psep胶体金试剂盒中的应用。本发明检测限低，当检测样品溶液中前列腺小体外泄蛋白的含量≥1.2ng/ml时，试纸条能正常检测判读，检出率为100％。
41.进一步的，上述应用，包括以下步骤：
42.检测时，滴入样品垫的尿液标本中的psep与试剂条中事先包被在胶体金颗粒表面的抗psep抗体一号结合成结合物，该结合物随着膜的毛细管作用向上迁移到达检测区，与膜上的抗psep抗体二号起反应，出现一条红色条带；无论标本中是否存在psep，当液面继续迁移至固定有羊抗兔igg抗体区带时，质控区必定会出现一条红色条带；
43.检测区t出现红色条带时，则提示阳性结果，提示被测者有罹患慢性前列腺炎的可能；检测区t无明显红色条带时，则提示阴性结果，表明被测者未有慢性前列腺炎。具体试剂盒检测结果示意图如附图1所示。本试纸条的使用方法简便可靠，整个检测过程只需要5-10分钟。
44.进一步的，上述应用，检测尿液中前列腺小体外泄蛋白的检测限为1.2ng/ml。
45.进一步的，一种检测慢性前列腺炎的psep胶体金试剂盒，包括上述psep 胶体金试
纸。
46.本发明具有如下有益效果:
47.本胶体金试试纸提供一种金标记的双抗夹心法方法，检测尿液中前列腺小体外泄蛋白，作为前列腺炎辅助诊断。此检测的检测限低，当检测样品溶液中前列腺小体外泄蛋白的含量≥1.2ng/ml时，试纸条能正常检测判读，检出率为100％；并且本试纸条的使用方法简便可靠，整个检测过程只需要5-10分钟。适用于各类检测机构定性或半定量筛查或家庭检测。本试纸条为目前慢性前列腺炎诊断提供一种新颖的非侵入性的无痛快速检验方法，具有重要的临床应用价值。
附图说明
48.附图1本发明所述试剂盒检测结果示意图。
具体实施方式
49.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
50.本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
51.实施例1
52.psep胶体金试纸的制备
53.一种psep胶体金试纸，所述psep胶体金试纸基于胶体金免疫层析双抗体夹心法制成，用于定性检测尿液标本中的psep含量；所述试纸依次包括样品垫、免疫胶体金垫、检测区t和质控区c所在的硝酸纤维素膜、吸水垫；在试剂条的免疫胶体金垫内包被有psep抗体一号，检测区包被有psep抗体二号，质控区包被有羊抗兔igg抗体；所述psep抗体一号为鼠抗人psep，所述psep抗体二号为兔抗人psep，抗体供应商：美国elionco公司，(抗体一号也可根据cn201910932461.5杂交瘤细胞lcz8a3及其分泌的单克隆抗体和应用中的制备)
54.所述胶体金试纸条的样品垫为玻璃纤维素膜，吸水垫为吸水纸，试纸条的宽度为2mm；t线和c线的间隔为3mm；样品垫与免疫胶体金垫之间重叠2mm；免疫胶体金垫与检测区t、质控区c所在的硝酸纤维素膜之间重叠1mm；硝酸纤维素膜与吸水垫之间重叠2mm；
55.上述psep胶体金试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
56.(1)将氯金酸溶液均匀分散于纯化水中，配置成浓度0.005％的氯金酸溶液；
57.(2)将250ml氯金酸溶液转入烧瓶中，加热至沸腾；
58.(3)向沸腾溶液中加入5ml，1％的柠檬酸钠溶液后，继续加热反,5min，将烧瓶中制备完成的胶体金倒出冷却至室温备用；
59.(4)取制备的胶体金，向其中加入pb溶液调整ph至6-7后，加入psep 抗体一号，终浓度1mg/1000ml，搅拌混匀，室温条件下反应15min；
60.(5)向上一步反应完成的液体中加入封闭缓冲液，搅拌混匀，室温条件下反应15min；
61.(6)取反应完成的液体，放入离心机中，40000g离心10min，弃去上清，加入封闭缓
冲液重悬，浓缩5倍作为金标浓缩液备用；
62.(7)取步骤(6)中的金标浓缩液，用喷金机喷涂到处理好的玻璃纤维素膜上，烘干48h制成免疫胶体金垫；
63.(8)取羊抗兔igg抗体作为c线抗体，和psep抗体二号作为t线抗体，用包被稀释液稀释成终浓度均为0.5mg/ml，使用划膜仪将c、t线稀释抗体包被至硝酸纤维素膜上，30℃烘干48h备用；
64.(9)将烘干完成的玻璃纤维膜和硝酸纤维素膜黏贴于pvc底板上，斩切成 2mm宽的试纸条。
65.所述步骤(4)中的封闭缓冲液的制备步骤为：60ml纯化水中加入2.5g bsa、 4.25g蔗糖、6.35g peg4000、30ml 0.5m硼砂缓冲液、500ul tritonx-100；
66.所述步骤(7)中的玻璃纤维素膜处理液的制备步骤为：95ml纯化水中加入 1g peg20000、1.5g bsa、5ml 10％tween-20、10ul 10％nan3；每张a4纸大小的玻璃纤维素膜使用50ml处理液浸泡后，37℃烘干24h备用；
67.所述步骤(8)中的包被稀释液的制备步骤为：89.5ml纯化水中加入10ml 0.5m pb、0.25g海藻糖、0.02g胆酸钠、200ul tween-20。
68.实施例2
69.psep胶体金试纸的制备
70.一种psep胶体金试纸，所述psep胶体金试纸基于胶体金免疫层析双抗体夹心法制成，用于定性检测尿液标本中的psep含量；所述试纸依次包括样品垫、免疫胶体金垫、检测区t和质控区c所在的硝酸纤维素膜、吸水垫；在试剂条的免疫胶体金垫内包被有psep抗体一号，检测区包被有psep抗体二号，质控区包被有羊抗兔igg抗体；所述psep抗体一号为鼠抗人psep，所述psep抗体二号为兔抗人psep。抗体供应商：美国elionco公司，(抗体一号也可根据 cn201910932461.5杂交瘤细胞lcz8a3及其分泌的单克隆抗体和应用中的制备)
71.所述胶体金试纸条的样品垫为玻璃纤维素膜，吸水垫为吸水纸，试纸条的宽度为3mm；t线和c线的间隔为5mm；样品垫与免疫胶体金垫之间重叠3mm；免疫胶体金垫与检测区t、质控区c所在的硝酸纤维素膜之间重叠2mm；硝酸纤维素膜与吸水垫之间重叠3mm；
72.上述psep胶体金试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
73.(1)将氯金酸溶液均匀分散于纯化水中，配置成浓度0.01％的氯金酸溶液；
74.(2)将500ml氯金酸溶液转入烧瓶中，加热至沸腾；
75.(3)向沸腾溶液中加入10ml，2％的柠檬酸钠溶液后，继续加热反,10min，将烧瓶中制备完成的胶体金倒出冷却至室温备用；
76.(4)取制备的胶体金，向其中加入pb溶液调整ph至6-7后，加入psep抗体一号，终浓度2mg/1000ml，搅拌混匀，室温条件下反应30min；
77.(5)向上一步反应完成的液体中加入封闭缓冲液，搅拌混匀，室温条件下反应30min；
78.(6)取反应完成的液体，放入离心机中，5000g离心20min，弃去上清，加入封闭缓冲液重悬，浓缩10倍作为金标浓缩液备用；
79.(7)取步骤(6)中的金标浓缩液，用喷金机喷涂到处理好的玻璃纤维素膜上，烘干72h制成免疫胶体金垫；
80.(8)取羊抗兔igg抗体作为c线抗体，和psep抗体二号作为t线抗体，用包被稀释液稀释成终浓度均为1mg/ml，使用划膜仪将c、t线稀释抗体包被至硝酸纤维素膜上，37℃烘干72h备用；
81.(9)将烘干完成的玻璃纤维膜和硝酸纤维素膜黏贴于pvc底板上，斩切成3mm 宽的试纸条。
82.所述步骤(4)中的封闭缓冲液的制备步骤为：60ml纯化水中加入2.5g bsa、 4.25g蔗糖、6.35g peg4000、30ml 0.5m硼砂缓冲液、500ul tritonx-100；
83.所述步骤(7)中的玻璃纤维素膜处理液的制备步骤为：95ml纯化水中加入1g peg20000、1.5g bsa、5ml 10％tween-20、10ul 10％nan3；每张a4纸大小的玻璃纤维素膜使用50ml处理液浸泡后，37℃烘干24h备用；
84.所述步骤(8)中的包被稀释液的制备步骤为：89.5ml纯化水中加入10ml 0.5m pb、0.25g海藻糖、0.02g胆酸钠、200ul tween-20。
85.实施例3
86.psep胶体金试纸的制备
87.一种psep胶体金试纸，所述psep胶体金试纸基于胶体金免疫层析双抗体夹心法制成，用于定性检测尿液标本中的psep含量；所述试纸依次包括样品垫、免疫胶体金垫、检测区t和质控区c所在的硝酸纤维素膜、吸水垫；在试剂条的免疫胶体金垫内包被有psep抗体一号，检测区包被有psep抗体二号，质控区包被有羊抗兔igg抗体；所述psep抗体一号为鼠抗人psep，所述psep抗体二号为兔抗人psep。抗体供应商：美国elionco公司，或者(抗体一号也可根据 cn201910932461.5杂交瘤细胞lcz8a3及其分泌的单克隆抗体和应用中的制备)。
88.所述胶体金试纸条的样品垫为玻璃纤维素膜，吸水垫为吸水纸，试纸条的宽度为4mm；t线和c线的间隔为7mm；样品垫与免疫胶体金垫之间重叠4mm；免疫胶体金垫与检测区t、质控区c所在的硝酸纤维素膜之间重叠3mm；硝酸纤维素膜与吸水垫之间重叠4mm；
89.上述psep胶体金试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
90.(1)将氯金酸溶液均匀分散于纯化水中，配置成浓度0.02％的氯金酸溶液；
91.(2)将1000ml氯金酸溶液转入烧瓶中，加热至沸腾；
92.(3)向沸腾溶液中加入15ml，3％的柠檬酸钠溶液后，继续加热反,15min，将烧瓶中制备完成的胶体金倒出冷却至室温备用；
93.(4)取制备的胶体金，向其中加入pb溶液调整ph至6-7后，加入psep 抗体一号，终浓度3mg/1000ml，搅拌混匀，室温条件下反应45min；
94.(5)向上一步反应完成的液体中加入封闭缓冲液，搅拌混匀，室温条件下反应45min；
95.(6)取反应完成的液体，放入离心机中，6000g离心30min，弃去上清，加入封闭缓冲液重悬，浓缩15倍作为金标浓缩液备用；
96.(7)取步骤(6)中的金标浓缩液，用喷金机喷涂到处理好的玻璃纤维素膜上，烘干96h制成免疫胶体金垫；
97.(8)取羊抗兔igg抗体作为c线抗体，和psep抗体二号作为t线抗体，用包被稀释液稀释成终浓度均为2mg/ml，使用划膜仪将c、t线稀释抗体包被至硝酸纤维素膜上，40℃烘干
96h备用；
98.(9)将烘干完成的玻璃纤维膜和硝酸纤维素膜黏贴于pvc底板上，斩切成 4mm宽的试纸条。
99.所述步骤(4)中的封闭缓冲液的制备步骤为：60ml纯化水中加入2.5g bsa、 4.25g蔗糖、6.35g peg4000、30ml 0.5m硼砂缓冲液、500ul tritonx-100；
100.所述步骤(7)中的玻璃纤维素膜处理液的制备步骤为：95ml纯化水中加入 1g peg20000、1.5g bsa、5ml 10％tween-20、10ul 10％nan3；每张a4纸大小的玻璃纤维素膜使用50ml处理液浸泡后，37℃烘干24h备用；
101.所述步骤(8)中的包被稀释液的制备步骤为：89.5ml纯化水中加入10ml 0.5m pb、0.25g海藻糖、0.02g胆酸钠、200ul tween-20。
102.实施例4
103.试纸条灵敏度分析
104.灵敏度分析：取步骤(9)中最终制备的前列腺小体外泄蛋白(胶体金法) 试纸条45条。取前列腺小体外泄蛋白质控品qc1、qc2、qc3、qc4、qc5、qc6、 qc7、qc8、qc9，浓度分别为20ng/ml,15ng/ml,10ng/ml,5ng/ ml,2.4ng/ml,1.2ng/ml，1.0ng/ml，0.8ng/ml，0.5ng/ml，每个样品浓度测试 5条，测试时间为15分钟。表1所示为目测判读结果。
105.表1灵敏度检测结果
106.抗原浓度12345qc1+++++qc2+++++qc3+++++qc4+++++qc5+++++qc6+++++qc7
‑‑‑‑‑
qc8
‑‑‑‑‑
qc9
‑‑‑‑‑
107.结果显示，当检测样品溶液中前列腺小体外泄蛋白的含量＜1.2ng/ml时，本发明试纸条不显色。当检测样品溶液中前列腺小体外泄蛋白的含量≥1.2ng/ml 时，试纸条能正常检测判读，检出率为100％。结果表明，本发明提供的前列腺小体外泄蛋白胶体金试纸大大提高了检测的方便性，且准确率高，具有重要的临床应用价值。
108.实施例5
109.临床符合性分析
110.以试纸条测试结果与列腺小体外泄蛋白通过酶联免疫法定量检测(参照在先专利cn104897900b-一种前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体与应用)的检测结果比较，判断检测结果的一致性。选取临床样本40例，其中20例阳性尿样(编号 p)，20例p为阴性尿样(编号n)。表2所示为测试结果。
111.表2临床样本符合性
112.113.[0114][0115]
根据对上述临床样本的测试，可见前列腺小体外泄蛋白胶体金试纸检测结果与列腺小体外泄蛋白通过酶联免疫法定量检测的测试结果阴阳性符合率均为 100％，具有很强的实用性。
[0116]
综合以上实施例可以看出，本胶体金试试纸提供一种金标记的双抗夹心法方法，检测尿液中前列腺小体外泄蛋白，作为前列腺炎辅助诊断。此检测方法简便可靠，整个检测过程只需要5-10分钟。适用于各类检测机构定性或半定量筛查或家庭检测。本试纸条为目前前列腺炎诊断提供一种新颖的非侵入性的无痛快速检验方法。
[0117]
以上所述实施例仅表达了本发明的有限几种优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。