一种高效液相色谱仪中的正相硅胶柱再生活化方法与流程

1.本发明涉及一种高效液相色谱仪中的正相填料色谱柱，尤其是涉及一种高效液相色谱仪中的正相硅胶柱再生活化方法。


背景技术：

2.高效液相色谱法（hplc）是一种分离和分析化学混合品的色谱方法，与其他分离方法相比，其设备、耗材可选取材范围很广，可根据应用目标需灵活取材，几乎是通用的分离方法。同时，它还具有出色的分析精度，大多数情况下为
±
0.5%甚至更精确。
3.高效液相色谱法（hplc）有正相色谱和反相色谱之分。反相色谱一般适用于分离非极性或弱极性化合物，极性大的组分先流出，其在现代液相色谱中应用最广泛，70%以上的分离与分析是在反相色谱中进行的。相反，正相色谱系统中，极性化合物更容易被固定相所保留，一般用于分离极性化合物。
4.正相色谱是采用极性固定相（如带有二醇基、氨基和氰基的固定相及硅胶、三氧化二铝等）、非极性流动相（如正己烷等）的分离方法，主要适用于非极性至中等极性的中小分子化合物的分离，在生化分析中主要应用于脂溶性维生素、甾体激素、医药等的分离分析，在农药、石油化工、精细化工、环境分析等方面也有广泛的应用。
5.硅胶是一种常用的正相色谱柱填料，影响其应用效果的重要参数是表面活性。表面活性主要依赖于表面羟基的类型、分布及其反应性，完全羟基化的表面具有最大的反应性，表面吸附的水或其他极性化合物，即使是极少量也会明显的降低表面活性。因此正相色谱的使用过程中，应避免水进入系统中。
6.随着色谱柱的使用，进入色谱柱中的杂质不断累积，使正相色谱柱分离效果逐步降低，最终无法满足日常使用需求。常用的色谱柱维护方案为，用100%异丙醇对色谱柱进行清洗。同时，因含有少量水会降低其表面活性，有专家提出，使用含2.5%冰醋酸和2.5%2,2-二甲氧基丙烷的正己烷溶液，对色谱柱进行冲洗维护，以除去正相色谱柱中的残留水，恢复其表面活性，再用100%异丙醇冲洗除去该正己烷溶液，色谱柱即可恢复使用性能。经上述方法处理后，若正相色谱柱的使用性能依旧无法恢复，厂家建议更换新色谱柱使用。而这对某些分离和分析领域而言，色谱柱性能下降较快，若直接更换色谱柱，将会极大的增加其运营成本。
7.因此，建立一种正相硅胶柱活化再生的方法，使色谱柱获得额外的使用寿命，可有效降低相关企业、机构运营成本。


技术实现要素：

8.本发明是为了提供一种操作简便，能恢复正相硅胶柱性能，有效延长正相硅胶柱使用寿命的高效液相色谱仪中的正相硅胶柱再生活化方法。
9.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明的一种高效液相色谱仪中的正相硅胶柱再生活化方法，包括以下步骤：
（1）将性能下降且无法满足使用需求的正相硅胶柱安装于高效液相色谱仪中，并设置柱温。
10.（2）用异丙醇冲洗。
11.（3）用极性溶剂冲洗。
12.（4）用体积百分比为0~2%有机酸的水溶液冲洗。
13.（5）用纯化水冲洗。
14.（6）用异丙醇冲洗。
15.（7）用体积百分比为2.5%的冰醋酸与体积百分比2.5% 的2,2-二甲氧基丙烷的正己烷溶液冲洗。
16.（8）用异丙醇冲洗，保存待用。
17.作为优选，步骤（1）中，柱温设置在28~80℃。
18.作为优选，步骤（2）中，异丙醇冲洗流速为0.1~2ml/min，冲洗10~40倍柱体积。
19.作为优选，步骤（3）中，所述极性溶剂为甲醇或乙腈，极性溶剂冲洗流速为0.1~2ml/min，冲洗10~40倍柱体积。
20.作为优选，步骤（4）中，；所述有机酸为三氟乙酸，体积百分比为0~2%有机酸的水溶液冲洗流速为0.1~2ml/min，冲洗10~40倍柱体积。
21.作为优选，步骤（5）中，纯化水的冲洗流速0.1~2ml/min，冲洗10~40倍柱体积。
22.作为优选，步骤（6）中，异丙醇冲洗流速为0.1~2ml/min，冲洗10~40倍柱体积。
23.作为优选，步骤（7）中，体积百分比为2.5%的冰醋酸与体积百分比2.5% 的2,2-二甲氧基丙烷的正己烷溶液冲洗流速为0.1~2ml/min，冲洗10~40倍柱体积。
24.作为优选，步骤（8）中，异丙醇冲洗流速为0.1~2ml/min，冲洗10~40倍柱体积。
25.因此，本发明具有如下有益效果：提供了一种高效液相色谱仪中的正相硅胶柱再生活化方法，利用高效液相色谱仪，通过特定溶剂及冲洗流程对正相硅胶柱进行再生活化，操作简便，能使性能下降、失去活性的正相色谱柱恢复其使用性能，有效延长正相硅胶柱使用寿命（可有效延长色谱柱使用寿命2~8倍）。
附图说明
26.图1是对照例1中正常正相硅胶柱的色谱图。
27.图2是实施例1中性能下降且无法满足使用需求的正相硅胶柱的色谱图。
28.图3是实施例1中经再生活化后正相硅胶柱的色谱图。
29.图4是对比例1中经再生活化后正相硅胶柱的色谱图。
30.图5是对比例2中经再生活化后正相硅胶柱的色谱图。
31.图6是对比例3中经再生活化后正相硅胶柱的色谱图。
32.图7是对照例2中正常正相硅胶柱的色谱图。
33.图8是实施例2中性能下降且无法满足使用需求的正相硅胶柱的色谱图。
34.图9是实施例2中经再生活化后正相硅胶柱的色谱图。
35.图10是对照例3中正常正相硅胶柱的色谱图。
36.图11是实施例3中性能下降且无法满足使用需求的正相硅胶柱的色谱图。
37.图12是实施例3中经再生活化后正相硅胶柱的色谱图。
具体实施方式
38.下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的描述。
39.以下实施例均以维生素d3咀嚼片ⅱ中的维生素d3检测标准中的系统适用性为例。
40.对照例1将正常的正相硅胶柱（supelcosil lc-si，4.6mm*250mm*5μm） 装入高效液相色谱仪中，用于检测维生素d3咀嚼片ⅱ中维生素d3，色谱条件为：正己烷：正戊醇=997：3，流速1.0ml/min，柱温28℃，检测波长254nm，得到的色谱图如图1所示。
41.实施例1（1）取性能下降且无法满足使用需求的正相硅胶柱（柱规格同对照例1），该性能下降且无法满足使用需求的正相硅胶柱用于检测维生素d3咀嚼片ⅱ中维生素d3的色谱图如图2所示（色谱条件同对照例1）；将该性能下降且无法满足使用需求的正相硅胶柱安装于高效液相色谱仪中，并设置柱温，柱温设置在50℃。。
42.（2）用异丙醇以流速0.5ml/min冲洗20倍柱体积。
43.（3）用极性溶剂（甲醇）以流速1ml/min冲洗30倍柱体积。
44.（4）用纯化水以流速0.5ml/min冲洗20倍柱体积。
45.（5）用纯化水以流速0.5ml/min冲洗20倍柱体积。
46.（6）用异丙醇以流速0.5ml/min冲洗40倍柱体积。
47.（7）用体积百分比为2.5%的冰醋酸与体积百分比2.5% 的2,2-二甲氧基丙烷的正己烷溶液以流速为0.22ml/min冲洗40倍柱体积。
48.（8）用异丙醇以流速0.5ml/min冲洗40倍柱体积，保存待用。
49.将再生活化后的正向硅胶柱装于高效液相色谱仪中，用于检测维生素d3咀嚼片ⅱ中的维生素d3，色谱条件同对照例1，得到的色谱图如图3所示。
50.对比例1将性能下降且无法满足使用需求的正相硅胶柱（柱规格同对照例1）安装于高效液相色谱仪中，并设置柱温，柱温设置在50℃，再生活化方法为：用异丙醇以流速0.5ml/min冲洗30倍柱体积，保存待用。
51.将再生活化后的正向硅胶柱装于高效液相色谱仪中，用于检测维生素d3咀嚼片ⅱ中的维生素d3（色谱条件同对照例1），得到的色谱图如图4所示。
52.对比例2将性能下降且无法满足使用需求的正相硅胶柱（柱规格同对照例1）安装于高效液相色谱仪中，并设置柱温，柱温设置在50℃，再生活化方法为：（1）用异丙醇以流速0.5ml/min冲洗20倍柱体积；（2）用甲醇以流速0.5ml/min冲洗40倍柱体积；（3）用异丙醇以流速0.5ml/min冲洗30倍柱体积，保存待用。
53.将再生活化后的正向硅胶柱装于高效液相色谱仪中，用于检测维生素d3咀嚼片ⅱ中维生素d3（色谱条件同对照例1），得到的色谱图如图5所示。
54.对比例3将性能下降且无法满足使用需求的正相硅胶柱（柱规格同对照例1）安装于高效液相色谱仪中，并设置柱温，柱温设置在50℃，再生活化方法为：
（1）用异丙醇以流速0.5ml/min冲洗20倍柱体积；（2）用体积百分比为2.5%的冰醋酸与体积百分比2.5% 的2,2-二甲氧基丙烷的正己烷溶液以流速为0.22ml/min冲洗40倍柱体积；（3）用异丙醇以流速0.5ml/min冲洗30倍柱体积，保存待用。
55.将再生活化后的正向硅胶柱装于高效液相色谱仪中，用于检测维生素d3咀嚼片ⅱ中的维生素d3（色谱条件同对照例1），得到的色谱图如图6所示。
56.通过比较图1~图6可知：当色谱柱失效，分离度显著降低时，常规的再生方法无法修复，但用本发明的方法，可显著修复色谱柱分离度，使其满足原有应用需要。
57.对照例2将正常的正相硅胶柱（nano chrom core silica，4.6mm*250mm*5μm） 装入高效液相色谱仪中，用于测定检测维生素d3咀嚼片ⅱ中的维生素d3，色谱条件为：正己烷：正戊醇=997：3，流速1.0ml/min，柱温28℃，检测波长254nm，得到的色谱图如图7所示。
58.实施例2（1）取性能下降且无法满足使用需求的正相硅胶柱（柱规格同对照例2），该性能下降且无法满足使用需求的正相硅胶柱用于检测维生素d3咀嚼片ⅱ中维生素d3的色谱图如图8所示（色谱条件同对照例2）；将该性能下降且无法满足使用需求的正相硅胶柱安装于高效液相色谱仪中，并设置柱温，柱温设置在28℃。
59.（2）用异丙醇以流速0.5ml/min冲洗30倍柱体积。
60.（3）用甲醇以流速0.5ml/min冲洗30倍柱体积。
61.（4）用体积百分比为1%三氟乙酸的水溶液以流速0.5ml/min冲洗30倍柱体积。
62.（5）用纯化水以流速0.5ml/min冲洗30倍柱体积。
63.（6）用异丙醇以流速0.5ml/min冲洗30倍柱体积。
64.（7）用体积百分比为2.5%的冰醋酸与体积百分比2.5% 的2,2-二甲氧基丙烷的正己烷溶液以流速为0.5ml/min冲洗30倍柱体积。
65.（8）用异丙醇以流速0.5ml/min冲洗30倍柱体积，保存待用。
66.将再生活化后的正向硅胶柱装于高效液相色谱仪中，用于检测维生素d3咀嚼片ⅱ中维生素d3（色谱条件同对照例2），得到的色谱图如图9所示。
67.由图3、图7、图8与图9比较可知，不同规格的色谱柱，图谱保留时间、分离度存在稍许差异，但用本发明的方法对色谱柱柱效的修复，结果保持不变，具有普遍适用性。
68.对照例3将正常的正相硅胶柱（welch ultimate sio2，4.6mm*250mm*5μm） 装入高效液相色谱仪中，用于测定检测维生素d3咀嚼片ⅱ中维生素d3，色谱条件为：正己烷：正戊醇=997：3，流速1.0ml/min，柱温28℃，检测波长254nm，得到的色谱图如图10所示。
69.实施例3（1）取性能下降且无法满足使用需求的正相硅胶柱（柱规格同对照例3），该性能下降且无法满足使用需求的正相硅胶柱用于检测维生素d3咀嚼片ⅱ中维生素d3的色谱图如图11所示（色谱条件同对照例3）；将该性能下降且无法满足使用需求的正相硅胶柱安装于高效液相色谱仪中，并设置柱温，柱温设置在30℃。
70.（2）用异丙醇以流速1ml/min冲洗30倍柱体积。
71.（3）用甲醇以流速1ml/min冲洗30倍柱体积。
72.（4）用体积百分比为1%三氟乙酸的水溶液冲洗以流速1ml/min冲洗30倍柱体积。
73.（5）用纯化水以流速1ml/min冲洗30倍柱体积。
74.（6）用异丙醇以流速1ml/min冲洗30倍柱体积。
75.（7）用体积百分比为2.5%的冰醋酸与体积百分比2.5% 的2,2-二甲氧基丙烷的正己烷溶液以流速为1ml/min冲洗30倍柱体积。
76.（8）用异丙醇以流速1ml/min冲洗30倍柱体积，保存待用。
77.将再生活化后的正向硅胶柱装于高效液相色谱仪中，用于检测维生素d3咀嚼片ⅱ中维生素d3（色谱条件同对照例3），得到的色谱图如图12所示。
78.由图3、图10、图11与图12比较可知，不同规格的色谱柱，图谱保留时间、分离度存在稍许差异，但用本发明的方法对色谱柱柱效的修复，结果保持不变，具有普遍适用性。
79.以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。