一种基于核酸适配体特异性识别的SARS-CoV-2表面抗原SERS检测方法

链霉亲和素之间的特异性作用修饰在已经修饰了链霉亲和素的磁珠上，以形成免疫磁珠捕获纳米粒子；
10.s2：制备金属纳米粒子；
11.s3：制备免疫金属信号纳米粒子：将步骤s2制备的金属纳米粒子与拉曼信号分子和巯基修饰的新冠病毒抗原的核酸适配体组合进行混合；并封闭活性位点，获得免疫金属信号纳米粒子；
12.s4：三明治结构的制备：将步骤s1制备得到的免疫磁珠捕获纳米粒子、待测样本混合和步骤s3的免疫金属信号纳米粒子一起进行混合孵育一定时间后进行磁吸分离，最终获得三明治结构；
13.s5：sars-cov-2病毒的检测：将获得的三明治夹心结构通过拉曼光谱仪进行拉曼检测，得到新冠病毒抗原的拉曼光谱结果。
14.新冠病毒sars-cov-2抗原免疫磁珠捕获纳米粒子具有磁性并修饰能特异性识别新冠病毒sars-cov-2抗原的适配体或适配体组合，免疫金信号纳米粒子具备拉曼信号表达和sars-cov-2抗原的适配体组合修饰。
15.在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸适配体为新冠病毒表面刺突蛋白的核酸适配体。
16.在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤s1具体包括：取100-1000ul浓度为1-10ug/ul的修饰了链霉亲和素的磁珠，加入b&w洗涤缓冲液，涡旋混匀使磁珠充分悬浮，磁吸弃去上清液；将上述磁珠在b&w洗涤缓冲液重悬至最终浓度的一半，加入10-200ul 100um生物素化适配体，在室温下孵育5-30min，磁吸弃去上清液，并用洗涤缓冲液洗涤，重悬于pbs溶液中，然后加入100-3000ul封闭剂，室温下反应1-5h封闭磁珠表面的剩余结合位点，磁分离，并用pbs溶液洗涤，最后重新分散在pbs溶液(super block blocking buffer溶液)中，制得所述的免疫磁珠捕获纳米粒子。
17.在本发明的一个优选实施方案中，所述洗涤缓冲液为b&w，其组成包括ph 4-8的1-50mm tris(三羟甲基氨基甲烷)-hcl、1-10mm edta和2-10mm nacl，所述封闭剂为质量分数为1％-25％的bsa溶液。
18.在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤s1中磁珠的粒径为1-5μm，更优选为1-2微米。
19.在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤s1中将磁珠与生物素化适配体混合，室温下孵育5-30min。
20.在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸适配体生物素标记为末端修饰生物素标记。
21.在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤s1中的核酸适配体为
22.5-biotin-atccagagtgacgcagcatttcatcgggtccaaaaggggctgctcgggattgcggatatggacacgt-3、
23.5-biotin-cagcaccgaccttgtgctttgggagtgctggtccaagggcgttaatggaca-3、
24.5-biotin-cgcagcacccaagaacaaggactgcttaggattgcgataggttcgg-3中的至少一种。
25.在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤s2中金属纳米粒子包括金纳米粒子或
银纳米粒子。
26.在本发明的一个优选实施方案中，所述金属纳米粒子的粒径为30-35nm，紫外吸收波长为526nm。
27.在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤s2中金属纳米粒子(包括金纳米粒子或银纳米粒子)通过以下方法制得：
28.(1)金纳米粒子：取200ml质量分数为0.01％的氯金酸溶液在磁力搅拌下加热至沸腾；然后取2-4ml质量分数为1％柠檬酸钠溶液，加入沸腾的氯金酸溶液中，待沸腾20-30min反应结束，冷却至室温，制成金纳米粒子。
29.(2)银纳米粒子：将200ml摩尔浓度为1mm的agno3水溶液加热至沸腾，加入3-6ml质量分数为1％柠檬酸钠水溶液，溶液颜色从先前的无色透明逐渐变成乳白色，并略带绿色，继续保持微沸2.5-3.5h,停止反应,水浴冷却，即得到银纳米粒子，避光保存。
30.在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤s3包括将金纳米粒子与拉曼信号分子混合，室温孵育1-30min，离心，弃去上层清液，重新分散在洗涤液中，再与巯基修饰的适配体组合混合后，在-100℃
‑‑
60℃下冷冻1-10h，再解冻，用洗涤液洗涤后，加入100-5000ul封闭剂，反应1-5h封闭剩余活性位点，离心，用洗涤液洗涤，最后弃去上层清液，重新分散在在100-1000ul洗涤液中，获得免疫金信号纳米粒子。
31.在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤s3中金纳米粒子与拉曼信号分子溶液的体积比为50-500:1-30，拉曼信号分子溶液浓度为40-60um；所述洗涤液为pbs-t，pbs-t为pbs溶液中加入质量分数为0.01％-1％的吐温-20而制得；所述封闭剂为质量分数25％-100％的tbs溶液。
32.在本发明的一个优选实施方案中，所述拉曼信号分子为ir808，亦可是其他拉曼信号分子。
33.在本发明的一个优选实施方案中，在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤s3巯基修饰的适配体为
34.5-sh-cagcaccgaccttgtgctttgggagtgctggtccaagggcgttaatggaca-3、
35.5-sh-cagcaccgaccttgtgctttgggagtgctggtccaagggcgttaatggaca-3、
36.5-sh-cgcagcacccaagaacaaggactgcttaggattgcgataggttcgg-3中的至少一种。
37.在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤s5中磁分离后将沉淀取出1-5ul液滴滴于镀有金膜的硅片上进行sers检测。
38.在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤s5中便携式拉曼光谱仪或其他类型拉曼光谱仪，激发波长优选为785nm。
39.本发明的优选方法为：
40.(1)免疫磁珠捕获纳米粒子的制备：取100-1000ul浓度为1-10ug/ul的修饰了链霉亲和素的磁性微球，加入b&w洗涤缓冲液，涡旋混匀使磁珠充分悬浮，磁吸弃去上清液；将上述磁珠在b&w洗涤缓冲液重悬至最终浓度的一半，加入10-200ul 100um生物素化适配体，在室温下孵育5-30min，磁吸弃去上清液，并用b&w洗涤缓冲液洗涤，重悬于pbs溶液中，然后加入100-3000ul质量分数为1％-25％的bsa溶液，室温下反应1-5h封闭磁珠表面的剩余结合位点，磁分离，并用pbs溶液洗涤，最后重新分散在pbs溶液中，制得所述的免疫磁珠捕获纳米粒子。
41.(2)纳米金粒子的的制备：取200ml质量分数为0.01％的氯金酸溶液在磁力搅拌下加热至沸腾；然后取质量分数为1％柠檬酸钠溶液，加入沸腾的氯金酸溶液中，待沸腾20-30min反应结束，冷却至室温，制成纳米金粒子。
42.(3)免疫金属信号纳米粒子的制备：将100-1000ul金纳米粒子与1-10ul 10-100um拉曼信号分子ir808和巯基修饰的核酸适配体混合，室温下孵育1-30min，在-100℃
‑‑
60℃下冷冻1-10h，解冻后，用pbs-t洗涤数次后，加入100-5000ul质量分数为25％-100％的tbs溶液，室温下反应1-5h封闭剩余活性位点，离心，用pbs-t溶液洗涤，最后弃去上层清液，重新分散在100-1000ulpbs-t溶液中，获得免疫金属信号纳米粒子。
43.(4)夹层(三明治式)结构的制备：将制得的免疫磁珠捕获纳米粒子与不同浓度的假的新冠病毒sars-cov-2和免疫金信号纳米粒子同时混合后，室温孵化3-7min，磁分离后pbs-t溶液洗涤，构筑成三明治夹心结构。
44.(5)sars-cov-2病毒的检测：将形成三明治夹心结构的沉淀取出滴于镀有金膜的硅片上，通过便携式拉曼光谱仪，直接进行拉曼检测，即可实现s蛋白的快速检出拉曼光谱结果。
45.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
46.1、本发明以核酸适配体作为特异性识别元件，特异性结合sars-cov-2病毒表面抗原，不需要进行裂解、核酸提取、扩增等前处理即可进行检测；
47.2、本发明相比于免疫分析法中使用抗体作为识别元件，一方面能够稳定纳米材料在检测体系中的分散状态；另一方面能够高特异性和高亲和力地识别目标蛋白，并且稳定性好，制备成本低，修饰的核酸适配体组合也在很大程度上提高了检测的准确性，可以防止病毒变异带来的问题，检测速度更快；
48.3、本发明可在5分钟内实现新冠病毒sars-cov-2抗原及变异病毒的快速检测，为早期检测2019-sars-cov-2病毒颗粒创造了条件。
附图说明
49.图1是本发明原理示意图，免疫磁珠捕获纳米粒子与sars-cov-2蛋白发生特异性免疫反应，通过与免疫金信号纳米粒子孵化，构筑成夹层(三明治式)结构；
50.图2是不同sars-cov-2假病毒浓度的表面增强拉曼光谱图；
51.图3是不同变异sars-cov-2假病毒浓度的检测柱形图，a为模拟检测奥密克戎突变病毒，b为模拟检测德尔塔突变病毒；
52.图4是不同种类假病毒的检测柱形图。
具体实施方式
53.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合附图和具体实施例对本发明进行更详细地描述，但本发明的保护范围并不受限于这些实施例。
54.本发明的检测方法利用新冠病毒sars-cov-2 s蛋白核酸适配体特异性识别的原理(优先采用sars-cov-2 s蛋白核酸适配体，但不仅限于s蛋白核酸适体，亦可用sars-cov-2其他抗原组分的核酸适体)，通过新冠病毒sars-cov-2抗原免疫磁珠捕获纳米粒子与s蛋白(或其他抗原组分)发生特异性识别之后，与修饰sars-cov-2抗原核酸适体的免疫金属信
号纳米粒子孵育，形成三明治夹心结构。所述的新冠病毒sars-cov-2抗原免疫磁珠捕获纳米粒子具有磁性并修饰能特异性识别新冠病毒sars-cov-2抗原的适配体或适配体组合(优先采用sars-cov-2 s蛋白核酸适配体，但不仅限于s蛋白核酸适体，亦可用sars-cov-2其他抗原组分的核酸适体)；所述的免疫金信号纳米粒子具备拉曼信号表达和sars-cov-2抗原的适配体组合修饰。
55.以下实施例中用到的核酸适配体为新冠病毒表面刺突蛋白的核酸适配体，标记为末端修饰生物素标记；
56.b&w洗涤缓冲液：用8mm ph6的tris-hcl、6mm edta和6m nacl配制而成；
57.pbs-t溶液：在pbs溶液中加入质量分数0.5％的吐温-20。
58.实施例1
59.1)免疫磁珠捕获纳米粒子的制备：取200ul浓度为10ug/ul的修饰了链霉亲和素的1μm磁珠，加入1ml b&w洗涤缓冲液，涡旋混匀使磁珠充分悬浮，磁吸弃去上清液，再用200ul b&w洗涤两次；将上述磁珠在b&w洗涤缓冲液重悬至最终浓度的一半，一起加入200ul 10um的三种生物素化适配体
60.5-biotin-atccagagtgacgcagcatttcatcgggtccaaaaggggctgctcgggattgcggatatggacacgt-3、
61.5-biotin-cagcaccgaccttgtgctttgggagtgctggtccaagggcgttaatggaca-3和5-biotin-cgcagcacccaagaacaaggactgcttaggattgcgataggttcgg-3，这三种适配体的体积配比是1:1:1，在室温下孵育20min，磁吸弃去上清液，并用b&w洗涤缓冲液(含有ph6的25mm tris-hcl、5mm edta和6mm nacl)洗涤两次，重悬于500ul pbs溶液中，加入3000ul1％bsa溶液，室温下反应1.5h封闭磁珠表面的剩余结合位点，磁分离，并用pbs溶液洗涤，最后重新分散在500ul pbs溶液中，制得所述的免疫磁珠捕获纳米粒子。
62.2)纳米金粒子的制备：取200ml质量分数为0.01％的氯金酸溶液在磁力搅拌下加热至沸腾；然后取4.5ml质量分数为1％柠檬酸钠溶液，加入沸腾的氯金酸溶液中，待沸腾25min反应结束，冷却至室温，制成粒径为55nm纳米金粒子。
63.3)免疫金信号纳米粒子的制备：将上述制得的100ul金纳米粒子与10ul 50um拉曼信号分子ir808和巯基修饰的核酸适配体
64.5-sh-cagcaccgaccttgtgctttgggagtgctggtccaagggcgttaatggaca-3、
65.5-sh-cagcaccgaccttgtgctttgggagtgctggtccaagggcgttaatggaca-3、
66.5-sh-cgcagcacccaagaacaaggactgcttaggattgcgataggttcgg-3组合混合，三种核酸适配体体积配比是1:1:1，室温孵育20min，-80℃下冷冻1h，解冻后，用pbs-t洗涤三次后，加入1000ul质量分数为25％的tbs溶液，室温下反应3h封闭剩余活性位点，离心，用pbs-t溶液洗涤，最后弃去上层清液，重新分散在100ulpbs-t溶液中，获得免疫金信号纳米粒子。
67.4)夹层(三明治式)结构的制备：将制得的免疫磁珠捕获纳米粒子与四种不同浓度(106tu/ml、105tu/ml、104tu/ml、103tu/ml)的假新冠病毒sars-cov-2和免疫金信号纳米粒子同时混合后，室温孵化3min，磁分离后pbs-t溶液洗涤，构筑成三明治夹心结构。
68.5)sars-cov-2病毒的检测：将形成明治夹心结构的沉淀取出3ul滴于镀有金膜的硅片上，采用便携式拉曼光谱仪对溶液态直接进行拉曼检测(激光波长785nm)，测试条件定为2s来实现s蛋白的快速检出拉曼光谱结果，结果如图2所示。从图2可以看出可以在适配体
作用下可以快速的检测到新冠病毒，并且检测限至少可以达到103tu/ml。
69.新冠变异病毒和其他不同种类病毒的检测：将制得的免疫磁珠捕获纳米粒子和不同浓度变异新冠假病毒和其他不同种类病毒与免疫金信号纳米粒子混合后，室温孵育3min，磁分离后pbs-t溶液洗涤4次，再磁分离，构筑成三明治夹心结构，并将其滴于镀有金膜的硅片上，通过便携式拉曼光谱仪，直接进行拉曼检测(激光波长785nm)，测试条件定为2s来实现新冠变异病毒和其他不同种类病毒的快速检出拉曼光谱结果。其结果见图3-4，从图3可知在不同适配体的作用下可以很好的检测不同的新冠变异毒株，说明适配体对于新冠病毒的识别具有良好的普适性。从图4可知在适配体的作用下可以很好将新冠病毒与其他形貌相似的流感病毒区分开来，说明适配体对于新冠病毒的识别具有优异的特异性。
70.实施例2
71.1)免疫磁珠捕获纳米粒子的制备：取200ul浓度为10ug/ul的修饰了链霉亲和素的1um磁珠，加入1ml b&w洗涤缓冲液，涡旋混匀使磁珠充分悬浮，磁吸弃去上清液，再用100ul b&w洗涤两次；将上述磁珠在b&w洗涤缓冲液重悬至最终浓度的一半，同时加入200ul 10um的三种生物素化适配体
72.5-biotin-atccagagtgacgcagcatttcatcgggtccaaaaggggctgctcgggattgcggatatggacacgt-3、
73.5-biotin-cagcaccgaccttgtgctttgggagtgctggtccaagggcgttaatggaca-3和5-biotin-cgcagcacccaagaacaaggactgcttaggattgcgataggttcgg-3，这三种适配体的体积配比是1:1:1，在室温下孵育15分钟，磁吸弃去上清液，并用b&w洗涤缓冲液洗涤两次，重悬于500ul pbs溶液中，加入5000ul 1％bsa溶液，室温下反应1.5h封闭磁珠表面的剩余结合位点，磁分离，并用pbs溶液洗涤，最后重新分散在1000ul pbs溶液中，制得所述的免疫磁珠捕获纳米粒子。
74.2)纳米金粒子的制备：取200ml质量分数为0.01％的氯金酸溶液在磁力搅拌下加热至沸腾；然后取4.5ml质量分数为1％柠檬酸钠溶液，加入沸腾的氯金酸溶液中，待沸腾25min反应结束，冷却至室温，制成纳米金粒子。
75.3)免疫金属信号纳米粒子的制备：将100ul金纳米粒子与10ul 50um拉曼报告分子ir808混合，室温孵育10分钟，离心，弃去上层清液，重新分散在pbs-t溶液中，再与三种巯基修饰的适配体5-sh-cagcaccgaccttgtgctttgggagtgctggtccaagggcgttaatggaca-3、
76.5-sh-cagcaccgaccttgtgctttgggagtgctggtccaagggcgttaatggaca-3和
77.5-sh-cgcagcacccaagaacaaggactgcttaggattgcgataggttcgg-3一起混合后，这三种适配体的体积比是1:1:1，-80℃下冷冻1h，解冻后，用pbs-t洗涤3次后，加入100ul 25％bsa溶液封闭剩余活性位点，室温孵化1h，离心，用pbs-t溶液洗涤3次，最后弃去上层清液，重新分散在100ul pbs-t溶液中，获得免疫金属信号纳米粒子。
78.4)夹层(三明治式)结构的制备：将制得的免疫磁珠捕获纳米粒子与四种不同浓度(106tu/ml、105tu/ml、104tu/ml、103tu/ml)的假新冠病毒sars-cov-2和免疫金信号纳米粒子同时混合后，室温孵化5min，磁分离后pbs-t溶液洗涤，构筑成三明治夹心结构。
79.5)sars-cov-2病毒的检测：将形成三明治夹心结构的沉淀取出3ul滴于镀有金膜的硅片上，待干了之后通过便携式拉曼光谱仪，直接进行拉曼检测(激光波长785nm)，测试时间确定为2s实现s蛋白的快速检出拉曼光谱结果。
80.新冠变异病毒和其他不同种类病毒的检测：将制得的免疫磁珠捕获纳米粒子和不同浓度新冠pseudovirus-2019-ncov假病毒和免疫金信号纳米粒子混合后，室温孵育5min，磁分离后pbs-t溶液洗涤4次，再磁分离，构筑成三明治夹心结构，并将其滴于镀有金膜的硅片上，通过便携式拉曼光谱仪，直接进行拉曼检测(激光波长785nm)，测试时间确定为2s实现新冠变异病毒和其他不同种类病毒的快速检出拉曼光谱结果。
81.上述实施例仅是本发明的优化实施方法，用以例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。应当指出，对于任何熟习此项技艺的人士在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修改，这些修改也应视为本发明的保护范畴。