一种玉米淀粉餐盒食品模拟液中17种基因毒性芳香胺迁移量的检测方法

1.本发明涉及分析检测技术领域，特别涉及一种超高效液相色谱-串联质谱法（uplc-ms/ms）分析检测玉米淀粉餐盒食品模拟液中基因毒性芳香胺迁移量的方法。


背景技术：

2.目前，生物基可降解餐具作为塑料的替代产品正在得到大力推广。研究发现，食品接触材料中的有害污染物会迁移到食品中。其中，芳香胺作为食品接触材料的加工助剂，着色剂偶氮染料的分解产物，以及残留的胶黏剂与水的反应产物，可通过吸收、溶解、扩散的形式迁移至食品中。在定量构效关系评估中（toxtree version 2.6.6），以下17种芳香胺：对间苯二胺、4,4
’‑
二氨基二苯醚、2,6-二氨基甲苯、对甲氧基苯胺、对甲苯胺、1,5-二氨基萘、2,4-二甲基苯胺、间氯苯胺、邻联甲苯胺、2-甲氧基-5-三氟甲基苯胺、4,4'-二氨基二苯硫醚、2-氨基-4-硝基甲苯、4-氨基联苯、3,4-二氯苯胺、对氯苯胺、2-氨基联苯和3,5-二氯苯胺，全部为基因毒性结构预警（包括ames试验和啮齿动物体内微核试验）和遗传毒致癌性结构预警，说明，这17种芳香胺极易攻击靶细胞的dna，产生不可逆的并可遗传的基因损伤，从而引起致癌、致突变、致畸的毒性作用。
3.现有技术中，塑料制品中有害芳香胺的检测方法有分光光度法、气相色谱法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法。但是，这些方法都存在一定的局限性。其中，分光光度法存在一定的假阳性，只适合初筛。气相色谱法和气相色谱-质谱法需要衍生化处理，前处理较为繁琐。液相色谱和液相色谱-串联质谱法前处理较为简单，具有一定的准确性和选择性，但是分析时间较长，一次分析时间需要30分钟-50分钟，时效性不能满足现代检测技术的要求。
4.玉米淀粉基餐盒属于一种生物基可降解餐具，以天然玉米淀粉、植物纤维、生物聚酯、多元醇为原料，为了实现与石油基餐具相同的使用性能，还添加了一定范围的加工助剂、添加剂等，存在的杂质较多，基质较为复杂。17种基因毒性芳香胺中，间氯苯胺与对氯苯胺、4-氨基联苯与2-氨基联苯、3,4-二氯苯胺与3,5-二氯苯胺均为同分异构体，需要优化色谱条件和质谱参数，使之有效地分离，以便进一步准确地定性和定量分析。因此，实现玉米淀粉基餐盒食品模拟液中的多种基因毒性芳香胺同时检测，存在较大的技术难度，能同时定性和定量检测多少种类物质，是提高检测效率的关键。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种玉米淀粉餐盒食品模拟液中17种基因毒性芳香胺迁移量的检测方法，通过使用超高效液相色谱串联质谱降低了基质效应，通过优化色谱条件和质谱参数能实现多种同分异构体的有效分离，进一步提升检测灵敏度和重现性。
6.为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种玉米淀粉餐盒食品模拟液中17种基因毒性芳香胺迁移量的检测方法，包括以
下步骤：（1）以超高效液相色谱-串联质谱法（uplc-ms/ms）进行分析，设定超高效液相色谱-串联质谱条件：1）色谱仪：uplc-ms/ms（acquity uplc h-class/xevo tq-xs，waters，ma，usa）2）色谱柱：beh phenyl column，2.1 mm
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100 mm，1.7 μm；这种苯基柱对芳香族化合物具有独特的选择性，能实现17种基因毒性芳香胺特别是间氯苯胺与对氯苯胺、4-氨基联苯与2-氨基联苯、3,4-二氯苯胺与3,5-二氯苯胺这三对同分异构体的有效分离。
7.3）柱温：35-45℃；4）流动相a为0.07%（v/v）含有甲酸的甲醇溶液，流动相b为水，进行梯度洗脱，优化的洗脱程序为：0～1.0分钟；99%a，1%b，1.0～3.0分钟：99%～70%a，1%～30%b，3.0～7.0分钟：70%～0%a，30%～100%b；7.0～9.5分钟：0%a，100%b，9.5～9.6分钟：0%～99%a，100%～1%b，9.6～12.0分钟：99%a，1%b，总运行时间为12分钟,17种基因毒性芳香胺的出峰时间全部少于7min；5）流动相流速：0.20-0.3ml/min；6）注射样品量为10μl-20 μl，温度为20℃-30℃；7）离子源：电喷雾正离子源（esi+），离子源温度150℃-170℃；8）扫描方式：多反应离子监测模式；9）脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为氮气；洗脱温度为500℃，洗脱气体流速为1000l/h；锥孔气体流速为150 l/h；碰撞气体流速为0.12ml/min；10）毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量：毛细管电压为0.5kv和0.6kv；锥孔电压为20v；针对17种基因毒性芳香胺设置了优化的碰撞能量，优化的碰撞能量和对应的离子对分别如下：间苯二胺：母离子109，定性离子65，碰撞能量18v，定量离子92，碰撞能量14v；4,4
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二氨基二苯醚：母离子201，定性离子80，碰撞能量30v，定量离子108，碰撞能量20v；2,6-二氨基甲苯：母离子123，定性离子108，碰撞能量16v，定量离子106，碰撞能量14v；对甲氧基苯胺：母离子124，定性离子92，碰撞能量15v，定量离子93，碰撞能量17v；对甲苯胺：母离子108，定性离子91，碰撞能量16v，定量离子93，碰撞能量15v；1,5-二氨基萘：母离子159，定性离子142，碰撞能量20v，定量离子115，碰撞能量20v；2,4-二甲基苯胺：母离子122，定性离子105，碰撞能量17v，定量离子107，碰撞能量15v；间氯苯胺：母离子213，定性离子196，碰撞能量19v，定量离子180，碰撞能量36v；邻联甲苯胺：母离子128，定性离子75，碰撞能量27v，定量离子93，碰撞能量17v；2-甲氧基-5-三氟甲基苯胺：母离子122，定性离子77，碰撞能量20v，定量离子105，碰撞能量10v；4,4'-二氨基二苯硫醚：母离子217，定性离子139，碰撞能量30v，定量离子124，碰撞能量20v；
2-氨基-4-硝基甲苯：母离子128，定性离子75，碰撞能量27v，定量离子93，碰撞能量17v；4-氨基联苯：母离子170，定性离子153，碰撞能量20v，定量离子152，碰撞能量26v；3,4-二氯苯胺：母离子170，定性离子153，碰撞能量20v，定量离子152，碰撞能量26v；对氯苯胺：母离子192，定性离子148，碰撞能量20v，定量离子177，碰撞能量20v；2-氨基联苯：母离子162，定性离子74，碰撞能量36v，定量离子127，碰撞能量18v；3,5-二氯苯胺：母离子162，定性离子74，碰撞能量36v，定量离子127，碰撞能量18v；（2）绘制标准曲线：分别准确称取一定量的17种基因毒性芳香胺标准物质，加甲醇溶解并定容，配得标准储备液；分别准确移取一定体积的标准储备液，用甲醇稀释并定容，配得标准工作溶液；将17种基因毒性芳香胺的标准工作溶液注入超高效液相色谱-串联质谱（uplc-ms/ms）进行分析，将每种基因毒性芳香胺的信号响应值与对应浓度按外标法绘制标准工作曲线；所述17种基因毒性芳香胺标准物质为：间苯二胺、4,4
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二氨基二苯醚、2,6-二氨基甲苯、对甲氧基苯胺、对甲苯胺、1,5-二氨基萘、2,4-二甲基苯胺、间氯苯胺、邻联甲苯胺、2-甲氧基-5-三氟甲基苯胺、4,4'-二氨基二苯硫醚、2-氨基-4-硝基甲苯、4-氨基联苯、3,4-二氯苯胺、对氯苯胺、2-氨基联苯和3,5-二氯苯胺；（3）样品制备：将玉米基餐盒剪成一定大小的小片，分别用一定体积的四种食品模拟液a、b、c、d，于一定温度条件下浸泡一定时间获得样品浸泡液；其中，食品模拟液a为水；食品模拟液c为10%乙醇水溶液；食品模拟液b为3%冰乙酸水溶液；食品模拟液d为橄榄油；食品模拟液a、c浸泡后的样品浸泡液分别直接经滤膜过滤后供超高效液相色谱-串联质谱测定；食品模拟液b浸泡后的样品浸泡液先用氨水调节ph至7，再经滤膜过滤后供超高效液相色谱-串联质谱测定；食品模拟液d浸泡后的样品浸泡液用正己烷-甲醇液液萃取法萃取，取甲醇萃取液经滤膜过滤后供超高效液相色谱-串联质谱测定；（4）检测：按样品浸泡液检出的质量色谱峰保留时间和定性离子相对丰度比进行定性分析，按定量离子峰面积进行定量分析，获得17种基因毒性芳香胺的迁移量。
8.步骤（2）中，配制得17种基因毒性芳香胺标准工作液的浓度为：0.10μg/l，0.20μg/l，0.50μg/l，1.00μg/l，2.00μg/l，15μg/l，30μg/l，75μg/l，150μg/l和300μg/l。
9.步骤（3）中玉米基餐盒小片的大小为，1.5 cm
×
4 cm；食品模拟液体积为20 ml，浸泡温度为5℃、25℃、40℃、100℃，分别模拟凉拌食品、常温食品和热烫食品；浸泡时间模拟一般外卖送餐时长，设为：30分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时；5℃浸泡温度时的浸泡时间为：30分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、6小时、9小时、15小时。
10.步骤（3）中，所用滤膜孔径为0.22μm。
11.步骤（3）中，食品模拟液b的样品浸泡液先用氨水调节ph至7，指先取1ml样品浸泡液用氨水调节ph至7，再加水稀释至2ml；食品模拟液d的样品浸泡液用正己烷-甲醇液液萃取法萃取，指取食品模拟液d的样品浸泡液5ml置于分液漏斗中，加入正己烷5ml，震荡10min后静置，加入甲醇5ml，震荡10min后静置。
12.步骤（4）中定性分析时，如果样品浸泡液中检出的质量色谱峰保留时间与标准工作液中的某种组分一致，且样品中定性离子的相对丰度与浓度接近的标准工作液的定性离子相对丰度相比，按如下规则进行判断：相对离子丰度＞50%时，允许的相对误差
±
20%，含
±
20%；20%＜相对离子丰度≤50%时，允许的相对误差
±
25%，含
±
25%；10%＜相对离子丰度≤20%时，允许的相对误差
±
30%，含
±
30%；相对离子丰度≤10%时，允许的相对误差
±
50%，含
±
50%；误差在上述范围内，则判定样品中存在对应的组分，否则，判定样品中不存在对应的组分；定量分析时，依据标准曲线，以定量离子峰面积进行外标法定量，计算得各食品模拟液中的17种基因毒性芳香胺的含量。
13.同现有的技术相比，本发明的有益效果在于：1、本发明从多种可能出现的芳香胺中筛选出17种具有基因毒性结构预警的有机化合物，一次性进行检测，可同时定性和定量得到检测结果，无干扰，无需衍生化，只需将样品提取液进行简单地前处理就能进行仪器分析，操作简便。
14.2、时效性有了较大幅度地提升，分析时间从常规方法的30分钟-50分钟缩短到只需要12分钟，17种基因毒性芳香胺的出峰时间全部少于7min，不仅节省了试验用溶剂，还可实现样品的快速分析。
15.3、灵敏度高，采用优化的梯度洗脱程序和质谱参数，不仅使17种基因毒性芳香胺特别是间氯苯胺与对氯苯胺、4-氨基联苯与2-氨基联苯、3,4-二氯苯胺与3,5-二氯苯胺这三对同分异构体得到有效分离，而且检测灵敏度也得到提升，17种基因毒性芳香胺的检出限在0.01μg/kg-3.0μg/kg，定量限在0.03μg/kg-9.9μg/kg，低于气相色谱法、气质联用法、液相色谱法和液相色谱-串联质谱法的方法检出限和定量限。
16.本发明为生物基餐具食品模拟液中检测基因毒性芳香胺的迁移量的同时监测和安全性评估提供了一种更加准确、高效、快速的分析方法。
附图说明
17.图1位表1：超高效液相色谱-串联质谱法同时检测17种基因毒性芳香胺的梯度洗脱程序。
18.图2为表2：超高效液相色谱-串联质谱法同时检测17种基因毒性芳香胺的质谱参数。
19.图3为表3：17种基因毒性芳香胺的具体的化合物信息。
20.图4为表3的续表。
21.图5为表4：超高效液相色谱-串联质谱法同时检测17种基因毒性芳香胺的方法确
认参数。
22.图6为表5：超高效液相色谱-串联质谱法（uplc-ms/ms）同时分析玉米淀粉餐盒食品模拟液中17种基因毒性芳香胺的迁移量的结果。
23.图7为：17种基因毒性芳香胺标准物质的质谱图。
具体实施方式
24.实施例1检测方法的确认：1、超高效液相色谱-串联质谱条件：1）色谱柱：eh phenyl column，2.1 mm
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100 mm，1.7 μm；2）柱温：35℃；3）流动相a为0.07%（v/v）含有甲酸的甲醇溶液，流动相b为水，梯度洗脱程序见表1，总运行时间为12分钟；4）流动相流速：0.20 ml/min；5）注射样品量为10μl，温度为20℃；6）离子源：电喷雾正离子源（esi+），离子源温度150℃；7）扫描方式：多反应离子监测模式（multi reaction ion monitoring mode，mrm）；8）脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为氮气；洗脱温度为500℃，洗脱气体流速为1000l/h；锥孔气体流速为150 l/h；碰撞气体流速为0.12ml/min；9）毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量：毛细管电压为0.5kv和0.6kv；锥孔电压为20v；碰撞能量的设置见表2的质谱参数；10）检测离子：检测离子的设置见表2的质谱参数。
25.2、绘制标准曲线：用甲醇溶解17种基因毒性芳香胺的标准物质，配制成系列标准工作溶液，浓度范围为0.10μg/l，0.20μg/l，0.50μg/l，1.00μg/l，2.00μg/l，15μg/l，30μg/l，75μg/l，150μg/l和300 μg/l。将17种基因毒性芳香胺的系列标准工作液注入超高效液相色谱-串联质谱（uplc-ms/ms）进行分析，将每种基因毒性芳香胺的信号响应值与对应浓度按外标法绘制标准工作曲线。17种基因毒性芳香胺标准物质的质谱图见图6。
26.3、样品制备：将玉米基餐盒剪成1.5 cm
×
4 cm的小片，用20 ml的食品模拟液a（水）于25℃的温度条件下浸泡2小时，浸泡液直接经0.22μm的滤膜过滤后供超高效液相色谱-串联质谱测定。向食品模拟液a的浸泡液中加入17种基因毒性芳香胺标准品15 μg/l、75 μg/l和150 μg/l，经0.22μm的滤膜过滤后供超高效液相色谱-串联质谱测定。样品按以上处理方法重复处理6次以进行加标回收和精密度实验。
27.4、检测：按样品检出的质量色谱峰保留时间和定性离子相对丰度比进行定性分析，按定量离子峰面积进行定量分析。
28.经检测，方法的线性范围、标准曲线，相关系数、检测限、定量限、加标回收和精密
度的方法确认参数见表4。由表可知，方法的线性范围在0.10μg/l-300 μg/l，相关系数r2为0.9911-0.9997，检出限在0.01μg/kg-3.0μg/kg，定量限在0.03μg/kg-9.9μg/kg，当加标量为15 μg/l时，回收率为82.6%-114%，rsd为0.2%-2.7%，当加标量为75μg/l时，回收率为80%-114.1%，rsd为0.3%-4%，当加标量为150μg/l时，回收率为99.4%-108%，rsd为0.2%-2.4%，均符合gb/t 27404检测方法确认的技术要求。
29.实施例2玉米淀粉餐盒食品模拟液中17种基因毒性芳香胺的迁移量的检测：检测方法的确认：1、超高效液相色谱-串联质谱条件：1）色谱柱：eh phenyl column，2.1 mm
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100 mm，1.7 μm；2）柱温：35℃；3）流动相a为0.07%（v/v）含有甲酸的甲醇溶液，流动相b为水，梯度洗脱程序见表1，总运行时间为12分钟；4）流动相流速：0.22 ml/min；5）注射样品量为20μl，温度为20℃；6）离子源：电喷雾正离子源（esi+），离子源温度150℃；7）扫描方式：多反应离子监测模式（multi reaction ion monitoring mode，mrm）；8）脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为氮气；洗脱温度为500℃，洗脱气体流速为1000l/h；锥孔气体流速为150 l/h；碰撞气体流速为0.12ml/min；9）毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量：毛细管电压为0.5kv和0.6kv；锥孔电压为20v；碰撞能量的设置见表2的质谱参数；10）检测离子：检测离子的设置见表2的质谱参数。
30.2、绘制标准曲线：分别准确称取一定量的17种基因毒性芳香胺标准物质，加甲醇溶解并定容，配得标准储备液。分别准确移取一定体积的17种基因毒性芳香胺标准储备液，用甲醇稀释并定容，配得标准工作溶液。将17种基因毒性芳香胺注入超高效液相色谱-串联质谱（uplc-ms/ms）进行分析，将每种基因毒性芳香胺的信号响应值与对应浓度按外标法绘制标准工作曲线。
31.3、样品制备：将玉米基餐盒剪成1.5 cm
×
4 cm的小片，分别用20 ml的食品模拟液a（水）、食品模拟液b（3%乙酸水溶液）、食品模拟液c（10%乙醇水溶液）和食品模拟液d（橄榄油）于40℃浸泡2小时，食品模拟液a（水）和食品模拟液c（10%乙醇水溶液）的样品浸泡液直接经0.22μm的滤膜过滤后供超高效液相色谱-串联质谱测定。食品模拟液b（3%冰乙酸水溶液）的样品浸泡液，先取1ml用氨水调节ph至7，然后加水稀释至2ml，最后再用0.22μm的滤膜过滤后供超高效液相色谱-串联质谱测定。模拟液d(橄榄油)的浸泡液，先取5ml置于分液漏斗中，加入正己烷5ml，震荡10min后静置，然后加入甲醇5ml，震荡10min后静置，最后取甲醇萃取液经0.22μm的滤膜过滤后供超高效液相色谱-串联质谱测定。
32.4、检测：
按样品检出的质量色谱峰保留时间和定性离子相对丰度比进行定性分析，按定量离子峰面积进行定量分析。玉米淀粉餐盒食品模拟液中17种基因毒性芳香胺的迁移量见表5。
33.由表5可知，17种基因毒性芳香胺中4,4
’‑
oda（4,4
’‑
二氨基二苯醚）、2,6-tda（2,6-二氨基甲苯）、p-asd（对甲氧基苯胺）均未检出迁移量。其他15种基因毒性芳香胺在食品模拟液a（水）中的迁移量为1.319μg/kg-61.103μg/kg，在食品模拟液b（3%冰乙酸水溶液）中的迁移量为1.266μg/kg-24.005μg/kg，在食品模拟液c（10%乙醇水溶液）中的迁移量为1.354μg/kg-39.745μg/kg，在模拟液d(橄榄油)中的迁移量为1.37μg/kg-45.164μg/kg。其中，对人的中枢神经系统及肝脏损害较强的2,4-dma（2,4-二甲基苯胺）的迁移量显著高于其他基因毒性芳香胺，在食品模拟液a（水）、食品模拟液b（3%乙酸水溶液）、食品模拟液c（10%乙醇水溶液）和食品模拟液d（橄榄油）中的迁移量分达到61.103μg/kg、6.397μg/kg、39.745μg/kg、45.164μg/kg。
34.本发明并不局限于上述实施例，在本发明公开的技术方案的基础上，本领域的技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中的一些技术特征作出一些替换和变形，这些替换和变形均在本发明的保护范围内。