细胞牵引力的测量方法

1.本发明涉及一种用于细胞与周围环境的力学信号观测的技术手段，更具体涉及细胞牵引力的测量方法，即一种细胞牵引力显微镜技术(traction force microscopy，tfm)。


背景技术：

2.生物体的整个生命过程都与周围力学环境密不可分，例如：宇航员长期生活在太空失重环境中，骨组织中破骨细胞被激活导致骨丢失的发生；离子通道蛋白piezo可以直接感知周围环境的拉压剪切力，改变蛋白结构并激活下游生化信号。
3.细胞是生物体结构和功能的基本单位。细胞及其内部的分子变形、运动及相互作用等力学行为贯穿了细胞的整个生命过程。随着越来越多的力学刺激调控细胞功能的信号通路的发现，目前学术界已经基本达成共识：力学与生化因素的耦合在细胞的生命过程中具有重要意义。
4.细胞在胞外基质中的黏附和迁移需要依靠两者之间的动态相互作用力，又称“细胞牵引力”。细胞牵引力由细胞内部应力纤维的相对滑移产生，经由黏着斑(一种位于细胞膜表面、由跨膜蛋白整合素和多种胞浆蛋白构成的蛋白大分子复合物)传递到细胞外基质，是细胞感知和响应胞外环境，行使正常生理功能的必要条件，是细胞最重要的力学特性之一。
5.细胞牵引力会影响细胞及胞外基质的生化和力学状态。例如：整合素的激活和黏着斑的成熟等生化事件要求牵引力超过一定的阈值；牵引力可以调控胞外基质的蛋白纤维结构和排列方向。
6.细胞内部应力纤维的相对滑移速度和整合素的活化状态也会影响细胞牵引力的大小。例如：布雷他汀和肌球蛋白轻链酶抑制剂都可以通过抑制肌球蛋白活性降低应力纤维相对滑移速度，减小细胞牵引力。
7.通常情况下，细胞在组织中倾向于维持牵引力大小的稳定，这对正常生理过程具有重要的意义，而牵引力大小的异常改变将会导致疾病的发生，例如癌症、组织过度纤维化、动脉粥样硬化等。
8.因此，细胞牵引力与胞内外生化-力学信号是相互耦合且实时改变的。理解这种力-生化耦合互作机制，将对解释胞外环境调控细胞特性的原理、解读细胞感知和响应周围力-生化环境的机制、探究力信号和生命之间的关系有很大帮助。为此，我们需要一些技术方法，在活细胞中对生化信号和力学信号进行长时间的同步动态观测。其中，生化信号的观测可通过将目标蛋白标记上荧光，利用荧光显微镜进行观察；力学信号的观测则依赖于测量细胞牵引力的技术方法。
9.在细胞力学信号测量的领域，近四十年来，研究者们开发了多种测量细胞牵引力的技术方法，主要分为两大类：通过测量荧光信号强度计算分子变形估算牵引力的荧光分子探针方法、通过测量弹性材料变形估算牵引力的微柱阵列方法和弹性基底膜方法(即“细胞牵引力显微镜技术”)。
10.荧光分子探针方法：
11.荧光分子探针方法基于荧光共振能量转移原理而实现：对于两个不同的距离很近的荧光分子，若其中一个荧光分子(称为“荧光供体”)的发射光与另一个荧光分子(称为“荧光受体”)的激发光重叠，则供体在被外界光照射激发后，其发射能量会通过共振转移给受体，激发受体发射荧光，供体发射荧光的强度相应减弱。共振能量转移的程度与荧光供、受体分子间距相关，当间距小于10纳米时即可发生能量转移，间距越小能量转移程度越高。
12.经典的荧光分子探针方法是将设计好的荧光分子探针通过化学交联修饰到玻璃片上。荧光分子探针由单独存在的荧光受体及修饰到细胞外基质(extracellular matrix,ecm)蛋白肽段上的荧光供体组成，二者之间以共价键形式连接一段有弹性的螺旋状脱氧核糖核酸(dna)片段(称为dna弹簧)。细胞在玻璃片上粘附时，细胞膜表面的整合素分子与荧光受体修饰的ecm蛋白肽段结合；细胞牵引力传递给dna片段导致其受拉伸长，供、受体分子距离变大；用荧光显微镜分别测量静息状态与细胞施加牵引力时供、受体荧光分子的荧光强度比值，可估算出两者间距的变化量；结合dna弹簧的弹性系数，可最终推算出细胞牵引力。
13.荧光分子探针方法空间分辨率较高，与光学显微镜相当，且能测量较小的力(约数皮牛至数十皮牛)。微柱阵列方法：
14.微柱阵列方法是利用微加工技术(如光刻等)将弹性材料(通常是聚二甲基硅氧烷，polydimethylsiloxane,pdms)表面加工成大小、分布均匀的圆柱阵列(直径数百纳米至数微米，高数微米至数十微米)，每根微柱相当于一个圆形截面的悬臂梁结构。
15.在微柱顶端修饰细胞外基质蛋白肽段；细胞在微柱顶端黏附时，通过细胞牵引力拉动微柱顶端发生侧向位移；用光学显微镜记录下微柱的侧向位移量；通过材料弹性系数和微柱几何参数，结合材料力学经典解，可估算出微柱所受的侧向力，即细胞牵引力。
16.微柱阵列方法的空间分辨率主要由微柱间隔决定，通常为数微米，目前最高可以达到约800纳米。该方法使用的力学模型较为简单，牵引力结果噪音较小。
17.细胞牵引力显微镜技术：
18.细胞牵引力显微镜技术(traction force microscopy,tfm)是发展历史最久，也是目前应用最广泛的测量细胞牵引力的方法。其基本原理是：将细胞接种到一块包埋有荧光示踪小球的弹性基底上，细胞在弹性基底上黏附并施加牵引力引起基底变形；通过区域追踪的数字图像相关算法追踪基底表面荧光示踪小球的位置变化，可得到基底在牵引力作用下的变形场；套用合适的力学模型，可计算出牵引力场。
19.细胞牵引力显微镜技术起源于上世纪八十年代。1980年，harris等人将pdms薄膜铺设在液态硅酮表面，观察到成纤维细胞在pdms薄膜表面黏附并拉动薄膜发生褶皱变形，并根据薄膜的力学参数和变形情况估算出细胞牵引力的大小。由于pdms的褶皱变形具有高度非线性的特征，对其进行力学分析较为困难，因此该方法只能获得半定量的牵引力结果。
20.1998年，wang等人将荧光小球包埋在聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel,paag)中，将细胞接种在paag上并使对基底施加牵引力产生变形；用荧光显微镜分别记录静息状态与细胞施加牵引力时基底中荧光小球的位置，进而计算出基底材料的变形场；结合paag的弹性系数和泊松比，反演并估算出细胞牵引力场。这就是经典的tfm方法。
21.经典tfm方法涉及由弹性基底的位移场反演得到细胞的牵引力场，这个过程基于
弹性力学中半无限空间问题的布西尼克-塞路提(boussinesq-cerruti)基本解，即一个半无限大空间表面受到一个法向或切向的集中力时半无限大空间的形变场。牵引力场的反演过程是一个病态反问题，即由结果反推原因，一点微小的误差即可造成极大的影响。为了尽量减弱病态反问题对反演结果的影响，2008年sabass等人引入吉洪诺夫(tikhonov)正则化，建立了正则化的fttc方法(regularized fourier-transform traction cytometry,reg-fttc)，修正问题的病态。其中需要引入正则化参数λ，以约束重构牵引力场的幅值(也可理解为修复牵引力结果的“不合理性”或“病态程度”)。
22.但由于正则化参数的选取是一个定性的过程，完全依赖实验经验与实验人员的感官，即：选取不同的正则化参数λ的值，判断牵引力重构结果中牵引力较大的位置应该分布于细胞边缘或伪足处或黏着斑定位处，选取其中重合度较高的λ值为最终参数值。
23.该方法在具体操作时，正则化参数λ的选择对牵引力场结果的准确性有很大影响：λ选得过小，不足以修正问题的病态，牵引力场结果中仍存在大量噪音；λ选得过大，问题病态被过度修正，牵引力场结果过度平滑，丢失大量细节。λ的选择与荧光示踪小球的分布密度、显微镜的像素大小和分辨率、位移和牵引力场算法的网格大小有关，基本不受细胞种类、观测时长等生物学因素的影响。
24.经典tfm方法材料制备简单，生物相容性好，使用常规的细胞培养环境和普通的荧光显微镜即可完成实验，且能获得较为可靠的、定量的牵引力场结果，非常适合活细胞中长时间的力学信号观测。另外，该方法使用的基底材料(paag)是连续、均匀、各向同性的线弹性材料，且弹性刚度可调，适用于研究胞外基质弹性对细胞的调控。
25.但根据tfm方法所得牵引力场的精度主要由基底材料表面能够被识别到的荧光小球的密度(即位移场采样密度)和荧光小球的定位精度决定。荧光小球分布过于稀疏可能导致基底部分变形较大的位置没有荧光小球，从而丢失了该位置的牵引力信号。
26.2016年，colin-york等人提出，根据基底表面识别到的荧光小球密度，结合奈奎斯特定理，估算tfm方法的空间分辨率。奈奎斯特定理指出：当一个系统以超出信号最高频率至少两倍以上的频率对模拟信号进行采样时，该模拟信号可以从采样获得的离散值中完全恢复。由此定理推断,tfm方法的空间分辨率约为荧光小球平均间距(即位移场采样密度)的两倍。
27.经典tfm方法的位移场采样间隔约5微米，估算得空间分辨率约10微米。能观察整个细胞或较大尺度亚细胞范围内的牵引力分布情况，但无法观测尺度较小的亚细胞结构(如大小在3-10微米的成熟黏着斑)中的牵引力。因此需要对经典tfm方法进行改进，进一步提高其空间分辨率。
28.2012年，plotnikov等人通过使用两种颜色的荧光微粒及改进材料变形场算法，建立了高分辨的tfm方法，空间分辨率达到约1.5微米(引用文献1)。2016年colin-york等人建立了基于受激发射损耗显微镜(stimulated emission depletion microscopy,sted)的tfm方法，空间分辨率约1.4微米(引用文献2)。2019年，该课题组又建立了基于结构光照明显微镜(structured illumination microscopy,sim)的tfm方法，空间分辨率约2微米(引用文献3)。上述几种高分辨tfm方法空间分辨率最高达到1.4微米，可以观察尺度较小的亚细胞结构(例如大小约3-10微米的成熟黏着斑)内牵引力的分布情况。
29.引用文献：
30.引用文献1：plotnikov s v,sabass b,schwarz u s,et al.high-resolution traction force microscopy[m]//waters j c,wittman t.methods in cell biology.academic press.2014:367-94.
[0031]
引用文献2：colin-york h,eggeling c,fritzsche m.dissection of mechanical force in living cells by super-resolved traction force microscopy[j].nature protocols,2017,12(4):783-96.
[0032]
引用文献3：colin-york h,javanmardi y,barbieri l,et al.spatiotemporally super-resolved volumetric traction force microscopy[j].nano letters,2019,19(7):4427-34.


技术实现要素：

[0033]
发明要解决的问题
[0034]
上文提到的荧光分子探针方法，通过荧光供、受体的荧光强度来估算dna螺旋的伸长量，只能得到细胞牵引力的大小，而无法得到细胞牵引力的方向，且荧光分子探针只能修饰到玻璃片上，只能测量培养在玻璃片上的细胞的牵引力，不能用于研究胞外基质弹性对细胞的调控。
[0035]
微柱阵列方法涉及精细加工且空间分辨率高度依赖于微柱的尺寸与排列间隔，材料加工较困难，且只有微柱顶端可以供细胞粘附，基底材料与细胞之间的粘附并非连续，可能对细胞产生未知的影响。
[0036]
经典tfm方法的空间分辨率较低，10微米的空间分辨率允许观察整个细胞或较大尺度亚细胞范围内的牵引力分布情况，但无法观测尺度较小的亚细胞结构中的牵引力。同时通过实验手段对牵引力重构算法中的正则化参数λ的选择做定性判断。该方法依赖于肉眼判断，主观性较强，精度较低，且一旦改变实验条件就需重新进行实验选择λ，成本较高，效率较低。此外，将示踪荧光球体混入弹性基底的做法导致荧光球体沿弹性基底剖面的纵向分布，为荧光显微镜的观测及焦平面的选取带来了较大的误差。
[0037]
而提到的几种高分辨tfm方法虽然空间分辨率提高至1.4微米，但仍与目前常用的观测活细胞生化信号的荧光显微镜(空间分辨率约为250纳米)有一定差距；与细胞力学的重要研究对象黏着斑(新生黏着斑尺寸小于1微米)也有一定差距。且基于两种颜色荧光微粒的方法观测时需要占用两个荧光通道，导致时间分辨率较低，且不利于力学信号与多种生物学信号的耦合观察；sted显微镜对细胞的光毒性较大，不适用于长时间的活细胞观测；基于sim显微镜的方法时间分辨率高且对细胞友好，但空间分辨率相较前两者略低。
[0038]
此外，另有报道中，利用全内反射荧光显微镜、转盘共聚焦显微镜纳米印刷技术、贝叶斯估计算法等方法建立了一系列高分辨tfm方法。在示踪荧光球体方面，已经有尝试将荧光球体以化学交联的方式交联至弹性基底表面，极大地减弱了经典tfm方法中荧光球体沿基底材料剖面纵向分布所带来的显微镜观测误差。
[0039]
但上述高分辨tfm方法均未能在牵引力测量的空间分辨率上有进一步突破。
[0040]
为解决现有技术中上述存在的不足，本发明的目的在于，提供一种新的超分辨tfm方法，以将tfm方法牵引力场结果的空间分辨率提高到接近传统光学显微镜的水平，同时具备可检测牵引力大小及方向、时间分辨率较高、操作较简便、可探究弹性基底对细胞的影
响、可定量判断采用不同正则化参数λ数值时牵引力场反演效果等等的特点，以解决荧光分子探针方法、微柱阵列方法、以及经典tfm方法与高分辨tfm方法所存在的种种问题，最终实现能满足活细胞中较小尺度的亚细胞结构(如尺度为约1微米的新生黏着斑)的牵引力观测需求，实现生化和力学信号的同尺度、长时间耦合观测，为解读细胞响应胞外力-生化耦合环境的机制提供更有效的工具。
[0041]
用于解决问题的方案
[0042]
经过发明人长期的研究，发现通过如下技术方案的实施能够解决上述技术问题：
[0043]
[1].本发明提供了一种细胞牵引力的测量方法，其中，所述方法包括：(a)在基底材料表面形成示踪用荧光球体的步骤；(b)细胞外基质蛋白修饰的步骤；(c)图像采集的步骤以及(d)位移场和牵引力场计算的步骤，其中，
[0044]
步骤(a)中，所述基底材料为经由具有伯胺基的不饱和单体共聚改性的聚丙烯酰胺材料；所述示踪荧光球体的平均粒径为90～110nm；
[0045]
步骤(b)中，所述细胞外基质蛋白经由光反应蛋白交联剂与所述示踪荧光球体结合，所述结合引起所述基底材料表面形变；
[0046]
步骤(c)中，包括使用基于结构光照明显微镜(structured illumination microscopy,sim显微镜)采集所述荧光球体在所述细胞外基质蛋白作用下的形变图像；
[0047]
步骤(d)中，通过计算机软件程序进行细胞牵引力场的计算。
[0048]
[2].根据[1]的方法，其中，所述步骤(a)中，所述聚丙烯酰胺材料为至少部分交联的聚丙烯酰胺。
[0049]
[3].根据[1]或[2]所述的方法，其中，所述步骤(a)中，所述具有伯胺基的不饱和单体为具有伯胺基的丙烯酸酯类单体。
[0050]
[4].根据[1]～[3]任一项所述的方法，其中，所述基底材料的杨氏模量为0.2～100kpa。
[0051]
[5].根据[1]～[4]任一项所述的方法，其中，所述步骤(a)中，所述荧光球体的平均粒径为95～105nm。
[0052]
[6].根据[1]～[5]任一项所述的方法，其中，所述步骤(a)中，所述基底材料表面荧光球体密度为12～16个/每平方微米。
[0053]
[7].根据[1]～[6]任一项所述的方法，其中，所述步骤(b)中，所述光反应蛋白交联剂包括sulfo-sanpah和edc交联剂。
[0054]
[8].根据[1]～[7]任一项所述的方法，其中，所述步骤(c)中，使用所述sim显微镜得到所述荧光球体在所述基底材料表面形变前后的位置图像，所述sim显微镜包括使用发射波长为488nm附近激光的发射器，所述sim显微镜使用100倍物镜。
[0055]
[9].根据[1]～[8]任一项所述的方法，其中，所述荧光球体的的发射波长在490～510nm。
[0056]
[10].根据[1]～[9]任一项所述的方法，其中，在所述步骤(d)中，包括在正则化参数为λ＝2.0
×
10-8
～4.0
×
10-8
的条件下通过reg-fttc(regularized fourier-transform traction cytometry,reg-fttc)方法进行牵引力场的计算。
[0057]
发明的效果
[0058]
本发明的有益效果在于，建立了一种超分辨牵引力显微镜技术的实验方法与数据
处理方法，与现有技术相比，能够将牵引力检测分辨率提高到例如516纳米(与新生黏着斑、囊泡运输等的尺度相当)；牵引力的检测精度可以达到
±
83.58皮牛(与整合素-基质蛋白配体结合键解离力相当)，因此可以感知细胞膜上单分子解离和黏附事件，这是牵引力显微镜的分辨率首次达到新生黏着斑和囊泡运输的分辨率。
[0059]
另外，本发明提供的技术方案信号采集时间间隔小于10秒，可支持至少数十分钟的活细胞持续观测，基本可以实现生化信号和力学信号的同尺度耦合观测，且能捕捉到大蛋白分子级别的力学事件。
[0060]
本发明将细胞牵引力的分辨率推进至细胞中重要生化事件(黏着斑新生、囊泡运输)的尺度，最终实现活细胞中生化和力学信号的同尺度、长时间耦合观测，为解读细胞响应胞外力-生化耦合环境的机制提供更有效的工具。打开了细胞所处的微观世界中力学测量的一扇大门，有广阔的生物学和细胞力学应用前景。
附图说明
[0061]
图1：sim超分辨荧光显微镜成像原理示意图
[0062]
图2：paag基底材料上铺设直径40纳米和100纳米的荧光球体的sim超分辨图像的对比
[0063]
图3：aema改进paag表面性能示意图
[0064]
图4：aema改善基底表面前后荧光球体的铺设效果图
[0065]
图5：原子力显微镜afm扫描得到的基底材料(paag)表面微形貌的三维视图(左)和平面视图(右)
[0066]
图6：铺设(左上)与未铺设(左下)荧光球体的弹性基底对细胞铺展黏附的影响，可见细胞形态与铺展面积并未有显著差异
[0067]
图7：confocal和sim显微镜的位移场采样密度和定位精度随荧光球体铺设密度的变化(横坐标分别为如下文表1中第1、2、4、5、8、9行6个实验条件制备的荧光球体样品，纵坐标为每个样品用不同显微镜拍摄时能够被识别到的荧光球体密度和荧光球体定位精度)(重复样品数：3个/组)
[0068]
图8：本发明超分辨tfm方法位移场测量误差(左)和牵引力误差估计原理示意图(右)
具体实施方式
[0069]
以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方案、具体例子而进行，但本发明不限定于这些实施方案、具体例子。需要说明的是：
[0070]
本说明书中，使用“数值a～数值b”表示的数值范围是指包含端点数值a、b的范围。
[0071]
本说明书中，使用“基本上”或“实质上”表示与理论模型或理论数据的标准偏差在3％、优选为2％、更优选为1％范围以内，并且，这里的偏差也包括了系统性偏差。
[0072]
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
[0073]
本说明书中，使用“(a)”、“(b)”等用来描述以及区分各个不同的步骤，其仅仅是为
了区分不同步骤的命名，并不代表对应步骤的实施顺序或者实施时机。
[0074]
本说明书中，使用“常温”指的是23
±
2℃的室内温度。
[0075]
本说明书中，使用“丙烯酸酯类单体”包括了丙烯酸酯单体以及(甲基)丙烯酸酯单体。
[0076]
本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
[0077]
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
[0078]
本发明对于现有的tfm方法提出了新的改进措施，建立了一种超分辨牵引力显微镜技术的实验方法与数据处理方法。
[0079]
本发明认为为有效提高tfm方法的空间分辨率，需要基于提高位移场采样密度和降低实验及算法中的噪音两大原则，从基底材料、显微镜硬件和算法三方面对经典tfm方法做出改进。
[0080]
(荧光显微镜的选择)
[0081]
如前文所说明的，根据tfm方法所得牵引力场的精度主要由基底材料表面能够被识别到的荧光球体的密度(即位移场采样精度)和荧光球体的定位精度决定。
[0082]
为了降低噪音，提高荧光球体定位和识别的准确度，必须获得更加清晰的荧光球体原始图像。本发明选用一种超分辨荧光显微镜代替经典tfm方法的激光共聚焦(confocal)显微镜进行图像采集。
[0083]
目前常见的商用超分辨显微镜有随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy,storm)、受激发射损耗显微镜(stimulated emission depletion microscopy,sted)和结构光照明显微镜(structured illumination microscopy,sim)。它们的侧向空间分辨率分别为20、30和100纳米。虽然前两者的空间分辨率较sim更有优势，但本发明认为storm的时间分辨率低且需要对样品做化学处理，sted入射光强度过高对细胞毒性较大，都不适用于活细胞拍摄。
[0084]
另外，与storm和sted二者相比，sim显微镜时间分辨率高，基于机械光栅的一代sim显微镜采集单张超分辨图像仅需数秒，基于液晶空间光调制器(liquid crystal spatial light modulator,lc-slm)的二代sim显微镜图像采集频率可达到100赫兹左右；sim显微镜无需对细胞做特殊处理，可以观察大部分常见荧光蛋白和荧光染料；sim显微镜光毒性较低，支持长时间的活细胞观测。因此，基于sim显微镜的tfm方法具有很好的普适性和应用前景。
[0085]
结合上述见解，本发明选择sim显微镜用于本发明超分辨tfm方法中荧光球体图像的采集。
[0086]
(示踪用荧光球体)
[0087]
已知的是sim显微镜的成像原理是将栅格化的结构照明光叠加到样品上，利用摩尔纹效应，将样品中的高频信号移动到光学显微镜可以分辨的低频区域，采集图像后再套
用已知的照明光结构数据，利用算法重构出样品的超分辨荧光图像，如图1所示。
[0088]
sim的重构算法中涉及反卷积计算，是经典的病态问题，虽然该算法中引入的维纳滤波器能在一定程度上修正问题的病态，仍需较高信噪比的显微镜原始图像输入，才能得到高质量的超分辨图像结果。
[0089]
经典tfm方法以及高分辨tfm方法中使用的平均粒径为40纳米的荧光球体，其光强较弱，导致其原始荧光图像信噪比较低，无法重构出有效的sim超分辨图像。因此，本发明换用荧光强度相对更高的平均粒径为90～110纳米，优先为95～105纳米，更优选为100纳米的荧光球体。通过该平均粒径的范围的优化，使得同时兼顾了荧光球体在基底材料上的铺设密度和sim显微镜下的分辨率。
[0090]
图2中，在本发明一些具体的实施方案中，对比了paag基底材料上铺设平均粒径40纳米和100纳米的荧光球体的sim超分辨图像。结果显示，40纳米的铺设密度较小，在进行去卷积处理后不能提供有效分辨率；使用平均粒径在100纳米左右荧光球体铺设基底材料，既可以达到较高的铺设密度，又可以在sim显微镜下被清晰分辨。
[0091]
另外，对于本发明所述的示踪用荧光球体的来源，没有特别限制，可以使用本领域常规的方法获得或者通过商购获得，在一些优选的实施方案中，所述荧光球体的表面具有羧基基团。
[0092]
在本发明一些优选的实施方案中，本发明使用颜色为绿色(发射波长为492-577nm)，更优选地，使用发射波长为492～520nm的荧光球体。
[0093]
(基底材料以及荧光球体的铺设)
[0094]
本发明中，所述基底材料使用共聚改性的聚丙烯酰胺(paag)材料。对于该基底材料，通常可以具有0.2kpa以上，优选为5以上，且在110kpa以下，优选为100kpa以下的杨氏模量。
[0095]
对于所述共聚改性的聚丙烯酰胺材料，优选为至少部分交联的聚合物材料，以容易的实现上述的杨氏模量。对于本发明的共聚改性的聚丙烯酰胺材料的制备方法，没有特别限制，可以为通过丙烯酰胺单体、改性单体在引发剂、交联剂的存在下进行聚合和交联而得到。
[0096]
现有技术中，使用化学交联法将荧光球体交联至基底材料表面时，需要先将荧光球体以一定比例用纯水稀释，滴加到基底材料上并室温静置使其自然沉降至基底材料表面，从而使得荧光球体在所述基底材料表面铺设。
[0097]
由于本发明所限定的平均粒径的纳米球体与传统平均粒径为40纳米的球体相比，与基底材料表面的接触面积较小，不易被吸附和交联，即使使用传统的化学交联的方法铺设荧光球体，每平方微米仅有约0.5个荧光球体分布。虽然也尝试了增加荧光球体在paag表面包被时工作液的球体浓度或延长吸附时间，可以在一定程度上提高球体铺设密度，例如：
[0098]
已经尝试了将荧光球体的浓度提高5倍，吸附时间从30分钟延长至过夜(约8～12小时)，荧光球体的铺设密度达到每平方微米5个，分布间隔约为450纳米，与传统光学显微镜250纳米的空间分辨率仍有一定差距。
[0099]
因此，本发明对基底材料的表面性能进行改进，以获得更高的荧光球体铺设密度，并且，优选地，在此基础上也通过进一步的增加工作液荧光球体浓度与延长吸附时间来提高上述铺设密度。
[0100]
传统的采用化学交联法将荧光球体交联至基底材料表面主要采用edc一部分或两步法，即将表面有羧基修饰的荧光球体交联到表面有仲胺基暴露的paag材料表面。
[0101]
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺[1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,edc]是常用的氨基-羧基零间距交联剂，其一端先与荧光球体表面的羧基集团反应，形成可以与氨基反应的o-酰基异脲酯中间产物，随后迅速与paag表面的仲胺基基团反应形成酰胺键，并释放一分子异脲产物，即edc一步交联法。
[0102]
edc一步法的中间产物在水溶液中非常不稳定，反应效率不高。1990年，grabarek等人提出了edc两步交联法：在反应溶液中加入n-羟基硫代琥珀酰亚胺(hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonicacid sodium salt,sulfo-nhs)；sulfo-nhs与o-酰基异脲酯反应，生成半稳定的可以与仲胺基反应的nhs酯；nhs酯是胺特异性官能基团，可以与paag表面的氨基反应，生成稳定的酰胺键。edc两步法操作简便、中间产物稳定、反应效率高，是目前分子生物学和生物材料研究中最常用的氨基-羧基交联方法。
[0103]
然而，如前所述，paag材料表面的氨基多为酰胺基团，由于其亲核性较低，导致本发明限定平均粒径范围的荧光球体和paag基底的交联效率不高。因此，本发明在尝试了使用具有伯胺基的不饱和单体作为改性单体对基底材料进行(共聚)改性。
[0104]
在本发明一些具体的实施方案中，对于所述具有伯胺基的不饱和单体可以选自具有伯胺基的丙烯酸酯类单体，优选地，可以使用碳原子数为2～10，优选为2～5的具有伯胺基的烷基醇与丙烯酸的酯化物。在进一步优选的实施方案中，使用2-氨基乙基(甲基)丙烯酸酯。对于形成所述基底材料的改性单体的用量，以形成基底材料所用的丙烯酰胺单体的重量计，可以为0.5～10质量％，优选为1～5质量％。以表3中17.31kpa与29.78kpa的实施例为例，改性单体用量为3.28质量％。
[0105]
进一步，对于使用上述具有伯胺基的丙烯酸酯类单体对本发明的基底材料进行改性的方法，没有特别限制，在一些优选的实施方案中，可以将丙烯酰胺单体、具有伯胺基的丙烯酸酯类单体在有溶剂或无溶剂的情况下预先混合，然后再向混合体系中加入交联剂、引发剂等，从而形成凝胶态体系。
[0106]
在本发明一种典型的实施方案中，在使用2-氨基乙基甲基丙烯酸酯的盐酸盐(2-aminoethyl methacrylate hydrochloride,aema)对聚丙烯酰胺材料进行改性后，在不改变材料力学性能的情况下，可以向聚丙烯酰胺材料引入更多的伯胺基团。其过程可参见图3的示意图。
[0107]
因此提高氨基的亲核性，增加交联剂的反应效率，使更多的本发明的荧光球体被交联到基底表面，如图4所示，可以看出，sim显微镜下aema改善基底表面后荧光球体的密度有明显提升。
[0108]
经过上述改性的基底材料，可以用来形成基底材料层，所述基底材料层的面积没有特别限定，可以以满足足够观测的区域为准；对于基底材料层的厚度，从观测便利性和有效性良好的角度考虑，可以为10～30μm厚。
[0109]
经过上述改性的基底材料，其表面铺设的荧光球体数量明显上升，可达到每平方微米平均为12～16个，优选为14～15.1个的荧光球体铺设密度。
[0110]
在一些优选的实施方案中，荧光球体分布间隔约258纳米，基本与传统光学显微镜250纳米的空间分辨率持平。此时，confocal显微镜已经无法分辨出每个球体的位置，这也
证实了本发明超分辨tfm方法中使用sim显微镜的必要性。
[0111]
为了推广tfm方法的应用范围，对aema用量、工作液球体荧光球体浓度和吸附时间这三个实验条件进行调整，确立了不同球体铺设密度的实验参数，可满足多种空间分辨率的牵引力检测需求，如下表1(样品数：10个/组，改性paag基底)所示：
[0112]
表1
[0113][0114]
为防止荧光球体因铺设密度过大形成特殊拓扑结构影响细胞功能，用afm扫描了基底表面形貌。结果显示，基底表面荧光球体排列随机，高度约为数十纳米，未形成特殊的拓扑形貌，如图5所示。
[0115]
为排除材料表面的不平整形貌可能带来的对细胞黏附和铺设的影响，考察了基底材料表面铺设荧光球体对成纤维细胞铺设的影响，结果显示，有/无荧光球体铺设的基底表面，成纤维细胞面积没有统计学差异(见图6)，提示荧光球体铺设对细胞铺设没有明显影响。
[0116]
(细胞外基质蛋白的修饰)
[0117]
本发明提供的超分辨牵引力显微镜技术的实验方法中，基于使用sim显微镜以采集细胞在前文所述的基底材料表面贴壁前后，荧光球体的位移情况，进而通过reg-fttc(regularized fourier-transform traction cytometry,reg-fttc)方法进行牵引力场的重构。
[0118]
对于细胞外基质蛋白与本发明的荧光球体的结合方式，在本发明一些具体的实施方案中，通过光反应蛋白交联剂将二者进行结合。对于可用的光反应性蛋白交联剂的种类没有特别限制，可以从本领域中常用的交联剂中进行选择，例如氨基-氨基交联剂sulfo-sanpah。但本发明所用的荧光球体铺设在基底材料(层)表面，掩盖其所在位置基底表面的氨基基团，而以荧光球体表面的羧基代替，该位置处基底无法通过sulfo-sanpah与细胞外基质蛋白相连。为使细胞外基质蛋白可以在基底材料表面均匀分布，在本发明一些优选的实施方案中，所述光反应蛋白交联剂可以为氨基-氨基交联剂sulfo-sanpah与氨基-羧基交联剂edc。采用两种蛋白交联剂混合交联的形式，细胞外基质蛋白表面的氨基既能与基底材料表面的氨基相连，又能与荧光球体表面的羧基相连，使得细胞外基质蛋白能够在基底材料表面均匀分布。
[0119]
在使用上述细胞外基质蛋白交联(接种)至改性的paag胶表面并接种细胞待其贴壁后，可以使用前述sim显微镜进行图像信息的采集，进一步，可以使用酶、碱性溶剂、表面活性剂等解除所述蛋白与细胞间的连接后再次使用sim显微镜进行图像信息的采集，两种图像中荧光球体位置的变化可以作为下文计算位移场和牵引力场的图像基础。
[0120]
(reg-fttc方法中正则化参数λ的选择)
[0121]
为了修正reg-fttc方法中问题的病态，需要引入正则化参数λ，如前所述经典tfm方法中，正则化参数λ的选择是定性的，依赖于肉眼判断，主观性较强，精度较低，且一旦改变实验条件就需重新进行实验选择正则化参数λ，成本较高，效率较低。
[0122]
为了能够对正则化参数λ的选取进行定量判断，本发明中可以使用计算机程序，例如matlab程序。用计算机模拟tfm方法的实验和计算过程，从而确定适合本发明技术方案正则化参数λ。
[0123]
具体步骤如下：
[0124]
1)模仿常见的黏着斑大小以及其在细胞内的排布情况，给出5个长2微米，宽0.5微米，间隔1微米的椭圆作为模拟牵引力场，并假设牵引力在椭圆内均匀分布；
[0125]
2)用布西尼克-塞路提解计算出模拟的理论位移场；
[0126]
3)按照每平方微米15个点的随机排布模拟铺有荧光球体的基底；
[0127]
4)将荧光球体位置代入理论位移场计算出基底变形后荧光球体的位置；
[0128]
5)将模拟的荧光球体在基底变形前后的位置图像卷积sim显微镜的psf(点扩展函数，point spread function)函数，叠加5％的白噪音，可模拟出sim显微镜采集的荧光球体变形图像和参考图像；
[0129]
6)用粒追踪的图像相关算法计算基底变形场；
[0130]
7)选则不同的正则化参数λ，用reg-fttc算法计算得到模拟的重构牵引力场。
[0131]
需要说明的是，在上述的步骤5)中，sim显微镜的psf函数的标准差σ与使用的荧光显微镜的种类和物镜镜头有关，具体该标准差可以通过如下方式确定：
[0132]
■
由衍射定理，传统光学显微镜的分辨率约为δxy＝0.61λ/na；
[0133]
■
考虑到显微镜分辨率与入射光和发射光波长相关，选择短波长的488纳米激光器和绿色荧光球体完成超分辨tfm实验，绿色荧光球体的发射峰为515纳米，为计算简便，记λ为500纳米，sim显微镜通常使用100倍高数值孔径物镜，na为1.49；
[0134]
■
将λ和na代入步骤1)中的公式，计算得光学显微镜的空间分辨率为204.7纳米，该数值与psf函数半高宽(full width at half maximum,fwhm)相当；
[0135]
■
由fwhm＝2.355σ计算得psf函数标准差；
[0136]
■
sim显微镜的空间分辨率约为传统光学显微镜的一半，故将标准差结果再除以2，最终计算得sim显微镜psf函数的标准差σ＝1.44；
[0137]
■
实际超分辨tfm实验中，高斯拟合得到的荧光球体psf函数标准差约为1.5，略大于理论计算值，这可能是由显微镜和相机的背景噪音导致，可以引入白噪音进行修正。
[0138]
因此，在上述步骤5)中选择σ＝1.44进行超分辨tfm方法的模拟计算。
[0139]
进一步，在matlab计算结果的基础上，定义了牵引力识别能力ψ和牵引力残差ζ两个参数评判牵引力场的重构效果。牵引力识别能力的表达式为：
[0140][0141]
其中，f
reconstr
表示模拟的重构牵引力场，a0为模拟的理论牵引力场中有牵引力的位置，a
background
为模拟的理论牵引力场中没有牵引力的位置，‖‖取2-范数。ψ描述了重构牵引力场的信噪比，该数值越大代表牵引力场重构效果越好。牵引力残差的表达式为：
[0142]
ζ＝‖f
reconstr-f0‖2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(4)
[0143]
其中，f
reconstr
和f0分别表示模拟的重构和理论牵引力场。ζ描述了重构牵引力场和理论牵引力场的误差，该数值越小代表牵引力场重构效果越好。
[0144]
结果显示，当正则化参数取λ＝2.0
×
10-8
～4.0
×
10-8
时，牵引力识别能力ψ较大，牵引力残差ζ较小，尤其当λ在3.0
×
10-8
附近时牵引力识别能力ψ最大，牵引力残差ζ最小，牵引力场云图还原度最高，说明此时牵引力场重构效果最好。因此，最优选选定λ＝3
×
10-8
作为本发明的超分辨tfm方法的正则化参数。
[0145]
经验表明，正则化参数λ的选择主要与荧光球体的psf函数大小、显微镜分辨率、荧光图像像素尺寸、位移场采样率有关。为进一步推广tfm方法的应用范围，在表2给出了不同空间分辨率tfm方法推荐使用的实验参数，并用这些参数模拟tfm过程，给出推荐选用的正则化参数λ。
[0146]
表2：
[0147][0148]
同样，也证实了经典/高分辨/超分辨tfm方法的牵引力残差ζ随λ的变化，随着空间分辨率的提高，λ参数的选择逐渐减小。这可能是因为较高分辨率tfm方法的位移场检测噪音较小，牵引力计算的病态程度较低，对噪音修正的需求也随之下降，证实了提高位移场检测精度对超分辨tfm方法实现的必要性。
[0149]
计算机模拟tfm过程的实现为λ参数的选择提供了更加精准的评判标准，且操作简单，成本低，适用于多种空间分辨率的tfm方法。
[0150]
(位移场和牵引力场的计算)
[0151]
如前所述，正则化参数确定后，可以通过对sim图像进行常规的数据处理以得到荧
光球体的位移变化(位移场)，进而通过reg-fttc(regularized fourier-transform traction cytometry,reg-fttc)方法进行牵引力场的重构或计算。
[0152]
对于具体的计算方法，可以借助现有的数据库，例如matlab数据库的内置函数来进行，例如通过数据处理精确确定位移前后荧光球体的位置或位置的变化，进而可以：
[0153]
i)用函数griddata将位移场插值到规则的矩形网格点(选取的网格大小使插值后的采样点与位移场计算中识别到的荧光球体数量一致，插值算法：三次样条插值)；
[0154]
ii)用函数fft2计算频域空间位移场；
[0155]
iii)用如下式反演频域空间牵引力场:
[0156][0157]
iv)用函数ifft2计算实域空间牵引力场结果；
[0158]
v)用quiver函数画出牵引力场云图。
[0159]
(超分辨tfm方法的误差估计)
[0160]
为了对超分辨tfm方法的牵引力检测能力有更加精准的了解，本发明对位移场采样密度、定位精度和背景噪音进行了估计。
[0161]
选取了上表1中的第1、2、4、5、8、9行6个实验条件制备荧光球体样品，分别用confocal和sim显微镜，以5秒为时间间隔，连续采集100张荧光球体图像。为避免图像采样频率不同导致的误差，两台显微镜系统选择相同的放大倍数，像素尺寸皆为30纳米。用tfm位移场算法中的高斯拟合方法识别并定位每个荧光球体的中心位置，统计荧光球体识别密度(即位移场采样密度)和荧光球体中心位置在100张图像中的标准差(即位移场定位精度)。结果显示，在荧光球体铺设密度较低时，confocal和sim显微镜对荧光球体的识别密度基本一致；随着球体铺设密度逐渐上升，confocal显微镜对荧光球体的识别能力逐渐下降，当荧光球体铺设密度达到每平方米15个左右时，confocal显微镜几乎无法正确识别荧光球体。在荧光球体能够被正确识别的情况下，球体的定位精度基本不受铺设密度的影响，而主要由显微镜的类型决定。confocal显微镜的定位精度较低，约为
±
10.88纳米，sim显微镜的定位精度较高，约为
±
1.75纳米(见图7)。
[0162]
位移场的误差估计方法如下：在不接种细胞的情况下依次进行超分辨tfm方法的各项步骤；采集加入胰酶前后基底上荧光球体的变形图像和参考图像；将计算得到的变形场视为超分辨tfm方法的位移场背景噪音。将两个方向上的所有位移分量混合统计，画出分布直方图(见图8a)。
[0163]
结果显示，位移场背景噪音呈高斯分布形态，用高斯函数拟合分布曲线，得到标准差为0.06像素(约1.719纳米)。
[0164]
此外，基于弹性力学理论(图8b)，对超分辨tfm方法的牵引力检测精度进行了估算。对于满足布西尼克-塞路提解的情况，如果基底材料表面的一点o受到切向集中力p，那么沿作用力方向距离x点处的位移u应当满足：
[0165]
u(x,0,0)＝p(1+v)/(πex)
[0166]
其中，e和v分别为基底材料的杨氏模量和泊松比，v随x增大而减小。超分辨tfm方法的位移采样间隔为257.9纳米，即对于集中力作用点o，最远至少能在距离其257.9纳米的位置进行采样，若该采样点的位移大于位移场背景噪音
±
1.719纳米，集中力的信号就有可能被捕捉到。
[0167]
将超分辨tfm中使用的改性的paag材料本构参数e＝60千帕和v＝0.5代入上式中，得到超分辨tfm最小可以捕捉到约83.58皮牛的集中力信号(即牵引力的检测精度约为
±
83.58皮牛)。整合素-基质蛋白配体结合键的最可几解离力约为100皮牛，与超分辨tfm的牵引力检测能力在数值上相当，显示了本发明的超分辨tfm方法很有可能可以捕捉到大蛋白分子级别的力学事件。
[0168]
实施例
[0169]
以下，将通过实施例对本发明进行进一步的说明：
[0170]
培养皿玻璃的表面处理和改性的paag基底的制备
[0171]
1)在直径35毫米的玻璃底共聚焦细胞培养皿(底面玻片直径20毫米)中加入1毫升1m的氢氧化钠溶液，室温静置2小时；
[0172]
2)弃掉氢氧化钠溶液，用去离子水和无水乙醇各涮洗3次；
[0173]
3)加入200微升aptes(硅烷偶联剂，以0.5％的浓度溶于无水乙醇)，室温静置10分钟；
[0174]
4)加入1毫升去离子水，在室温摇床上缓慢摇动(转速40转/分钟)30分钟；
[0175]
5)弃掉皿内液体，用去离子水涮洗3次；
[0176]
6)加入1毫升0.5％戊二醛溶液，室温静置30分钟；
[0177]
7)弃掉戊二醛，用洗耳球将玻璃底表面吹干待用；
[0178]
8)根据实验需求，选取如下表3中第四列配方配置基底材料溶液并加入表1规定的改性单体(其中表1中改性单体浓度为反应混合液中的浓度)，滴加10微升溶液至预处理的培养皿玻璃底表面，迅速盖上直径18毫米圆形盖玻片，室温静置30分钟；
[0179]
表3：
[0180][0181]
9)待基底材料凝固后，加入纯水浸泡5分钟，揭去18毫米圆形盖玻片。
[0182]
示踪荧光球体的铺设
[0183]
1)根据实验需求，选取表1中的适当浓度配置荧光球体工作液，涡旋振荡1分钟混匀；
[0184]
2)在制备好的基底材料层表面加入适量工作液(以恰好能覆盖基底材料层表面为宜，约200微升)，室温静置适当时间使球体吸附到基底材料表面(吸附时间参考表1)；
[0185]
3)弃掉荧光球体工作液，加入200微升edc两步法交联剂(1毫克/毫升edc+2.5毫克/毫升sulfo-nhs溶于50mm的mes溶液)，室温静置30分钟；
[0186]
4)加入2毫升dpbs(磷酸缓冲溶液)，室温静置2小时。
[0187]
细胞外基质蛋白的修饰
[0188]
1)配置sulfo-sanpah交联剂(1.5毫克/毫升sulfo-sanpah+1毫克/毫升edc溶于
dpbs溶液)，加入适量sulfo-sanpah交联剂至已铺设示踪荧光球体的改性的paag材料表面(以恰好能覆盖基底材料表面为宜，约200微升)；
[0189]
2)用15瓦杀菌紫外灯照射15分钟(样品距离紫外灯不超过10厘米)；
[0190]
3)弃掉液体，用dpbs溶液涮洗3次，加入200微升ecm蛋白溶液(胶原蛋白溶于20mm的乙酸溶液，纤连蛋白溶于dpbs)，4摄氏度孵育过夜。
[0191]
细胞接种和荧光显微镜图像的采集
[0192]
1)细胞接种密度：5
×
103个细胞/样品；
[0193]
2)物镜镜头、像素尺寸和视场大小：参考表2“超分辨tfm方法”；
[0194]
3)激发光和探测器参数：sim显微镜，绿色荧光通道(488纳米激光器)，激光强度20％，相机曝光时间20毫秒，红色荧光通道(561纳米激光器)，激光强度20％，相机曝光时间20毫秒。
[0195]
4)根据实验需求，采集荧光球体变形图像和荧光蛋白图像；
[0196]
5)弃掉培养基，加入1毫升0.25％胰蛋白酶，消化5分钟(操作时，细胞样品固定在显微镜载物台上，不要触碰样品)，继续采集荧光球体变形图像。
[0197]
位移场的计算
[0198]
1)使用matlab内置函数normxcorr2(后文内容除特别说明外，所有函数都为matlab内置函数)计算荧光球体参考图像和变形图像的图像相关系数，将数值最大处的坐标值作为细胞消化前后样品和显微镜载物台水平方向的刚体平移值；
[0199]
2)将图14中给出的荧光球体psf标准差作为初始σ值，用函数fspecial和imfilter对参考图像进行拉普拉斯高斯滤波(参数：窗口大小4σ，标准差σ)，滤波后的图像记为imglog；
[0200]
3)用函数ordfilt2对imglog进行最大滤波(参数：窗口大小2σ)，滤波后的图像记为imgmax；
[0201]
4)比较imglog和imgmax，将数值一致的点作为参考图像中的局部极大值点，即备选的荧光球体中心位置；
[0202]
5)用函数lsqcurvefit对每个备选的球体中心位置周围进行二维高斯函数拟合(参数：窗口大小4σ，标准差初始值σ)，记录拟合获得的函数最大值(即球体中心荧光强度)、中心位置、标准差和残差2-范数；
[0203]
6)计算所有备选球体拟合后残差2-范数的分布情况，选取平均值附近95％的球体作为最终识别到的荧光球体；
[0204]
7)对于每个荧光球体的中心位置，在变形图像的相应位置搜索附近区域(搜索范围：40像素)，计算搜索区域图像与参考图像中的荧光球体图像的图像相关系数(窗口大小：4σ)，找到相关系数中最高的位置，记为该球体变形后移动到的位置；
[0205]
8)以该位置为中心，用函数lsqcurvefit对周围区域进行二维高斯函数拟合(参数：窗口大小4σ)，定位出亚像素精度的球体中心位置，提高位移场计算精度。
[0206]
牵引力场的计算(正则化参数选择λ＝3.0
×
10-8
)
[0207]
1)用函数griddata将位移场插值到规则的矩形网格点(选取的网格大小使插值后的采样点与位移场计算中识别到的荧光球体数量一致，插值算法：三次样条插值)；
[0208]
2)用函数fft2计算频域空间位移场；
[0209]
3)用根据式(2)反演频域空间牵引力场；
[0210]
4)用函数ifft2计算实域空间牵引力场结果；
[0211]
5)用quiver函数画出牵引力场云图。
[0212]
需要说明的是，尽管以具体实例介绍了本发明的技术方案，但本领域技术人员能够理解，本公开应不限于此。
[0213]
以上已经描述了本公开的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术的改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。