1.本发明属于植物多酚提取检测技术领域，具体涉及一种基于高效液相色谱仪检测猕猴桃中多酚化合物的方法。
背景技术：
2.猕猴桃，又称奇异果，因其口味鲜美、营养价值高受到广大消费者的喜爱。猕猴桃含有丰富的vc、膳食纤维、氨基酸，钙、钾等矿物质元素以及多酚类化合物，其中猕猴桃多酚类化合物被认为是猕猴桃的主要活性物质。可以调节血液循环，影响血管的渗透性和柔韧度，从而预防血管老化和脑血管供血不足。尽管多酚广泛存在于猕猴桃中，然而猕猴桃中多酚的含量受诸多因素影响，如加工过程及储存条件等。多酚类物质如单宁、槲皮素、杨梅素、表儿茶素、原儿茶酸、绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、没食子酸、根皮苷等，通过测定多酚类物质的含量高低，可以在一定程度上判断猕猴桃品质的好坏。
3.但是，植物多酚的应用及相关领域，多酚鉴定与其含量或纯度测定是非常重要也是最常遇到的问题，由于植物多酚与黄酮类、蒽醌类、简单酚和木质素等在植物体内共存并且性质相近，其本身更是一类结构和性质都极为相似的混合物，并且多酚性质较为活泼，很易发生缩合或者降解，因此对其进行精确定量比较困难，特别是用分离提纯的方法对其进行定量测定是极其困难的。目前关于植物多酚含量的测定方法有数十种，但是获得一种快速、简便、准确地测定出各类样品中多酚含量的方法尚处于进一步研究开发中，必须根据实际情况选择不同的测定方法及相关测试条件，如何选择合适的测定法和标准物，以及样品的制备与多酚的提取检测条件，均会对测定结果有很大影响。专利文献cn107621456a报道了一种猕猴桃多酚含量的测定方法，其包括浸提、测定吸光度数值、重复浸提、计算多酚当量、计算多酚含量等步骤，但其是针对总多酚含量进行测定，其提取率不高，检测结果不够精确，无法快速、准确测定出多种多酚的含量。期刊文献《从猕猴桃中提取多酚的研究》研究了提取猕猴桃中多酚的最佳工艺条件，得出采用30％的丙酮溶液按1:9的料液比，在35℃下提取30min，但其也仅仅是针对总酚含量进行测定，无法对猕猴桃果肉中数十种多酚含量进行检测，且其检测准确性不高，检测结果精密度不够。
4.综上所述，现有技术中有关猕猴桃中多酚类化合物的检测方法，存在提取效率不高或者是检测手段复杂，往往需要采用多种精密检测仪器进行联用的方法，才能较准确地测定出猕猴桃中各种多酚类物质的含量，对于猕猴桃多酚的检测方法，尚需提供一种准确度和精密度高，且检测手段操作简单、方便，能够快速精准检测出猕猴桃中植物多酚化合物的方法。
技术实现要素：
5.本发明的目的就是为了解决上述技术问题，从而提供一种基于高效液相色谱仪检测猕猴桃中多酚化合物的方法，具备检测准确度和精密度高、多酚提取液稳定性好，能够同时检测出猕猴桃中多酚类化合物的含量。
6.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
7.一种基于高效液相色谱仪检测猕猴桃中多酚化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
8.a.猕猴桃多酚类化合物的提取：首先将猕猴桃破碎打浆，加入抗氧化剂，采用惰性气体保护防止褐变，然后加入乙醇-水溶液超声提取，收集上清液后重复提取2-3次，合并上清液，获得多酚提取液；
9.b.标准溶液的配制：取槲皮素、杨梅素、表儿茶素、原儿茶酸、绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、没食子酸、根皮苷标准品，分别用色谱甲醇溶解，配制成600mg/l的基础液，再逐级稀释配成浓度为0.05、0.5、5、25、50、100mg/l的标准溶液，再配制成混合标准溶液备用，取20μl标准溶液进样分析，得到标准品色谱图，再制作成标准曲线；
10.c.采用高效液相色谱仪测定步骤a获得的多酚提取液中多酚类化合物的含量，色谱柱为：atlantis c18(250mm*4.6mm，5μm)，流动相a为体积比为1％乙酸水溶液(v/v)；流动相b为体积比为0.2％乙酸-乙腈水；选择柱温，选择流动相梯度洗脱，选择波长后检测，得到猕猴桃样品色谱图，根据高效液相色谱仪检测出的猕猴桃样品色谱图与标准品色谱图进行对比鉴定，通过标准曲线对猕猴桃中多酚类化合物进行定量分析。
11.其中步骤a中所述的惰性气体为氮气或氩气，所述的抗氧化剂为丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯、抗坏血酸其中的任意一种。
12.其中步骤a中乙醇-水溶液中乙醇的浓度为30-60％。
13.其中步骤b中超声提取的功率为梯度洗脱程序如下：0-30min，流动相a的体积占比为90％-45％；30-60min，流动相a的体积占比为45％-0％；60-70min，流动相a的体积占比为0％-50％；70-80min，流动相a的体积占比为50％-90％。
14.其中步骤b中所述的槲皮素、杨梅素、表儿茶素、原儿茶酸、绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、没食子酸、根皮苷标准品的纯度≥98％。
15.其中步骤c中所述的柱温25-35℃。
16.其中步骤c中所述的检测波长为240-380nm。
17.有益效果：采用本发明的检测方法共检测出槲皮素、杨梅素、表儿茶素、原儿茶酸、绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、没食子酸、根皮苷等9种多酚类化合物，本发明提供的方法样品前处理简单，成本低，具备检测准确度和精密度高、多酚提取液稳定性好，可推广应用到快速富含多酚的水果检测中。
具体实施例
18.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
19.实施例1
20.一种基于高效液相色谱仪检测猕猴桃中多酚化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
21.a.猕猴桃多酚类化合物的提取：首先将猕猴桃破碎打浆，加入抗氧化剂，采用惰性气体保护防止褐变，然后加入乙醇-水溶液超声提取，收集上清液后重复提取3次，合并上清
液，获得多酚提取液；
22.b.标准溶液的配制：取槲皮素、杨梅素、表儿茶素、原儿茶酸、绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、没食子酸、根皮苷标准品，分别用色谱甲醇溶解，配制成600mg/l的基础液，再逐级稀释配成浓度为0.05、0.5、5、25、50、100mg/l的标准溶液，再配制成混合标准溶液备用，取20μl标准溶液进样分析，得到标准品色谱图，再制作成标准曲线；
23.c.采用高效液相色谱仪测定步骤a获得的多酚提取液中多酚类化合物的含量，色谱柱为：atlantis c18(250mm*4.6mm，5μm)，流动相a为体积比为1％乙酸水溶液(v/v)；流动相b为体积比为0.2％乙酸-乙腈水；选择柱温，选择流动相梯度洗脱，选择波长后检测，得到猕猴桃样品色谱图，根据高效液相色谱仪检测出的猕猴桃样品色谱图与标准品色谱图进行对比鉴定，通过标准曲线对猕猴桃中多酚类化合物进行定量分析。
24.其中步骤a中所述的惰性气体为氮气，所述的抗氧化剂为抗坏血酸。
25.其中步骤a中乙醇-水溶液中乙醇的浓度为60％。
26.其中步骤b中超声提取的功率为梯度洗脱程序如下：0-30min，流动相a的体积占比为90％-45％；30-60min，流动相a的体积占比为45％-0％；60-70min，流动相a的体积占比为0％-50％；70-80min，流动相a的体积占比为50％-90％。
27.其中步骤b中所述的槲皮素、杨梅素、表儿茶素、原儿茶酸、绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、没食子酸、根皮苷标准品的纯度≥98％。
28.其中步骤c中所述的柱温25℃。
29.其中步骤c中所述的检测波长为380nm。
30.实施例2
31.一种基于高效液相色谱仪检测猕猴桃中多酚化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
32.a.猕猴桃多酚类化合物的提取：首先将猕猴桃破碎打浆，加入抗氧化剂，采用惰性气体保护防止褐变，然后加入乙醇-水溶液超声提取，收集上清液后重复提取2次，合并上清液，获得多酚提取液；
33.b.标准溶液的配制：取槲皮素、杨梅素、表儿茶素、原儿茶酸、绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、没食子酸、根皮苷标准品，分别用色谱甲醇溶解，配制成600mg/l的基础液，再逐级稀释配成浓度为0.05、0.5、5、25、50、100mg/l的标准溶液，再配制成混合标准溶液备用，取20μl标准溶液进样分析，得到标准品色谱图，再制作成标准曲线；
34.c.采用高效液相色谱仪测定步骤a获得的多酚提取液中多酚类化合物的含量，色谱柱为：atlantis c18(250mm*4.6mm，5μm)，流动相a为体积比为1％乙酸水溶液(v/v)；流动相b为体积比为0.2％乙酸-乙腈水；选择柱温，选择流动相梯度洗脱，选择波长后检测，得到猕猴桃样品色谱图，根据高效液相色谱仪检测出的猕猴桃样品色谱图与标准品色谱图进行对比鉴定，通过标准曲线对猕猴桃中多酚类化合物进行定量分析。
35.其中步骤a中所述的惰性气体为氮气或氩气，所述的抗氧化剂为丁基羟基茴香醚。
36.其中步骤a中乙醇-水溶液中乙醇的浓度为30％。
37.其中步骤b中超声提取的功率为梯度洗脱程序如下：0-30min，流动相a的体积占比为90％-45％；30-60min，流动相a的体积占比为45％-0％；60-70min，流动相a的体积占比为0％-50％；70-80min，流动相a的体积占比为50％-90％。
38.其中步骤b中所述的槲皮素、杨梅素、表儿茶素、原儿茶酸、绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、没食子酸、根皮苷标准品的纯度≥98％。
39.其中步骤c中所述的柱温35℃。
40.其中步骤c中所述的检测波长为240nm。
41.实施例3
42.一种基于高效液相色谱仪检测猕猴桃中多酚化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
43.a.猕猴桃多酚类化合物的提取：首先将猕猴桃破碎打浆，加入抗氧化剂，采用惰性气体保护防止褐变，然后加入乙醇-水溶液超声提取，收集上清液后重复提取2次，合并上清液，获得多酚提取液；
44.b.标准溶液的配制：取槲皮素、杨梅素、表儿茶素、原儿茶酸、绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、没食子酸、根皮苷标准品，分别用色谱甲醇溶解，配制成600mg/l的基础液，再逐级稀释配成浓度为0.05、0.5、5、25、50、100mg/l的标准溶液，再配制成混合标准溶液备用，取20μl标准溶液进样分析，得到标准品色谱图，再制作成标准曲线；
45.c.采用高效液相色谱仪测定步骤a获得的多酚提取液中多酚类化合物的含量，色谱柱为：atlantis c18(250mm*4.6mm，5μm)，流动相a为体积比为1％乙酸水溶液(v/v)；流动相b为体积比为0.2％乙酸-乙腈水；选择柱温，选择流动相梯度洗脱，选择波长后检测，得到猕猴桃样品色谱图，根据高效液相色谱仪检测出的猕猴桃样品色谱图与标准品色谱图进行对比鉴定，通过标准曲线对猕猴桃中多酚类化合物进行定量分析。
46.其中步骤a中所述的惰性气体为氮气或氩气，所述的抗氧化剂为没食子酸丙酯。
47.其中步骤a中乙醇-水溶液中乙醇的浓度为50％。
48.其中步骤b中超声提取的功率为梯度洗脱程序如下：0-30min，流动相a的体积占比为90％-45％；30-60min，流动相a的体积占比为45％-0％；60-70min，流动相a的体积占比为0％-50％；70-80min，流动相a的体积占比为50％-90％。
49.其中步骤b中所述的槲皮素、杨梅素、表儿茶素、原儿茶酸、绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、没食子酸、根皮苷标准品的纯度≥98％。
50.其中步骤c中所述的柱温30℃。
51.其中步骤c中所述的检测波长为320nm。
52.实施例4
53.方法学考察
54.1.线性关系
55.将酚类物质混合标准品配制成0.05、0.5、5、25、50、100mg/l浓度梯度进行测定，根据色谱图计算回归方程、相关系数、线性范围及检出限。槲皮素、杨梅素、表儿茶素、原儿茶酸、绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、没食子酸、根皮苷标准品9种酚类物质标准品相应的线性范围内的浓度与峰面积呈现良好的线性关系，相关系数均0.9991-0.9999之间，满足酚类物质的检测分析。
56.2.精密度试验
57.为了验证方法的精密度，将50mg/l混合标准样品按本发明所述的色谱条件重复进样10次，根据各标准物质的积分峰面积计算其相对标准偏差(rsd)。结果表明，9种酚类物质
的rsd介于0.32％-1.22％，说明该方法具有较高的精密度。
58.3.重复性试验
59.称取同一份猕猴桃样品10份，按步骤a样品前处理方法将样品做同样处理，在本发明所述的色谱条件下进行测定，通过计算各成分的积分峰面积的rsd值检验方法的重复性。结果显示槲皮素、杨梅素、表儿茶素、原儿茶酸、绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、没食子酸、根皮苷标准品9种酚类物质标准品的rsd值均低于2.12％，表明该方法重复性良好。
60.4.稳定性试验
61.取同一份猕猴桃多酚提取样品溶液，在相同色谱条件下，分别在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h进样测定样品中酚类物质含量。样品中槲皮素、杨梅素、表儿茶素、原儿茶酸、绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、没食子酸、根皮苷9种酚类化合物保留时间和含量的rsd值均小于3.56％，表明在48h内稳定，说明该方法稳定性良好。
62.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。