一种与肺癌相关的血浆外泌体蛋白标志物、抗体及其应用

一种与肺癌相关的血浆外泌体蛋白标志物、抗体及其应用
发明领域
1.本发明属于分子生物学领域，涉及一类与肺癌相关的血浆外泌体蛋白标志物、两种抗体及其应用。


背景技术：

2.肺癌是全世界发病率和病死率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（nsclc）占所有肺癌类型的85%以上，死亡率高达80%～90%。由于缺乏有效的早期诊断筛查方法，70%肺癌患者确诊时已是晚期，5年生存率仅为16%～18%。因此nsclc 的早期诊断尤其重要。目前，nsclc临床早筛主要基于经典的血液肿瘤标志物——癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，cea）、低剂量计算机断层扫描（low-dose computerized tomography，ldct）以及纤维支气管内窥镜等检查。但是，这些检测手段具有低敏感性或有创性等局限，因此，基于液体活检开发无创和敏感的筛查是nsclc 早诊的重大挑战。
3.外泌体（exosomes）是纳米级别的细胞外囊泡，其直径介于50
–
150 nm，起源于内体系统，存在于包括血液在内的几乎所有体液中。其携带dna、m rna、非编码rna、蛋白质和脂质，它能够借由脂质双层膜结构，保护其内容物不被降解。所有细胞类型，包括肿瘤细胞，都能够将外泌体释放到细胞外空间，并且癌症患者的外泌体数量显著高于健康人。肿瘤来源的外泌体一旦释放后就可以充当前哨，通过与质膜融合或与蛋白质受体相互作用来靶向细胞，进而广泛的参与肿瘤的增殖、转移和逃逸等过程。外泌体可为肺癌的早期诊断提供重要信息，具有成为肺癌肿瘤标志物的潜力。因此，外泌体是癌症领域最有希望的液体活检标记之一。
4.研究表明，部分外泌体蛋白在肿瘤患者体内异常表达，具有成为肿瘤诊断标志物的潜力。与常规肿瘤确诊方法相比，外泌体蛋白检测具有取样简便，检测成本低等优势，在肿瘤诊断生物标志物方面具有广阔的开发及应用前景。
5.但是，血浆外泌体蛋白在肺癌无创诊断中的应用前景仍有待发掘，如果能筛选到肺癌中异常表达的血浆外泌体蛋白作为生物标志物，并研发相应的诊断试剂盒，对肺癌的诊断现状将会有大大的推动。
6.

技术实现要素：

7.本发明的主要目的是针对肺癌临床无创诊断中的问题，提出一类与肺癌相关的血浆外泌体蛋白标志物、以及该类血浆外泌体蛋白标志物在制备肺癌诊断试剂盒中的应用。
8.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种与肺癌相关的血浆外泌体蛋白标志物，所述的血浆外泌体蛋白标志物为血浆外泌体蛋白tlr7。
9.进一步的技术方案，所述的血浆外泌体蛋白标志物为血浆外泌体蛋白cd47、cd63、tlr7的组合。
10.cd47是一种广泛表达的跨膜糖蛋白，也称为整联蛋白相关蛋白（iap），分子量52 kda。该蛋白具有免疫球蛋白可变的n端结构域、5个跨膜结构域和一个短的c端胞内尾，胞内尾部有四种可变不同剪接异构体，从而形成4个亚型。cd47亚型2主要在造血细胞、血管内皮细胞和上皮细胞中表达，1亚型在角质形成细胞中表达，3和4亚型在神经元细胞、肠粘膜细胞和睾丸细胞中均有表达。
11.cd63是一种蛋白质抗原，在人体中由cd63基因编码，cd63主要出现在细胞外囊泡的表面，也会出现在普通的细胞膜表面。
12.toll 样受体（tlr）家族成员针对果蝇中密切相关的 toll 样受体命名，在天然免疫应答中发挥重要作用。tlr 识别各种病原体中存在的保守基序，并介导防御反应。触发 tlr 通路导致 nf-κb 激活及对免疫基因和炎症基因的后续调控。
13.本发明提供了一种抗体，所述抗体能特异性捕获包括上述的与肺癌相关的血浆外泌体蛋白标志物。该抗体是由abcam公司定制合成的抗tlr7蛋白的单克隆抗体和生物素化的抗tlr7蛋白抗体；进一步的，该抗体是由abcam公司定制合成的抗cd47、cd63、tlr7蛋白的单克隆抗体和生物素化的抗cd47、cd63、tlr7蛋白抗体。
14.本发明提供了上述的血浆外泌体蛋白标志物、抗体在肺癌诊断试剂盒制备中的应用。
15.本发明提供了一种肺癌诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测血浆中的上述的蛋白标志物的表达量。
16.进一步的技术方案，所述的试剂盒中包括上述的抗体。
17.进一步的技术方案，所述的试剂盒还包括酶联免疫常用的试剂和酶。
18.进一步的技术方案，所述的试剂盒包括抗tlr7蛋白的单克隆抗体、 tlr7标准品、生物素化的抗tlr7蛋白抗体、辣根过氧化物标记的亲和素、生物素。
19.进一步的技术方案，所述的试剂盒包括抗cd47、cd63、tlr7蛋白的单克隆抗体，cd47、cd63、tlr7标准品，生物素化的抗cd47、cd63、tlr7蛋白抗体，辣根过氧化物标记的亲和素，生物素。
20.本发明的有益效果：本发明提供的血浆外泌体蛋白标志物作为肺癌诊断的标志物的优势在于：(1) 传统肺癌的血浆标志物主要是以癌胚抗原(cea)为代表的蛋白类生物标志物，存在灵敏性和特异性不高的缺点，而血浆外泌体tlr7蛋白是一种新型生物标志物，在肺癌病人血浆中特异表达且表达稳定，易于检测、定量。通过本发明提供的tlr7蛋白，或cd47、cd63、tlr7蛋白组合进行肺癌血浆无创诊断，有利于对目前肺癌进行辅助诊断，将大大提高肺癌无创诊断的敏感性和特异性。
21.(2) 本发明系统的通过外泌体蛋白质谱分析及western blot方法研究了血浆外泌体蛋白在肺癌患者血浆外泌体中的差异表达，进一步验证其在肺癌诊断中的应用价值。
22.（3）本发明通过elisa对大样本进行了多阶段验证，采用了绝对定量进行验证：血浆外泌体tlr7、cd47、cd63蛋白组合使用与相较于血浆外泌体tlr7单一使用，敏感度和特异性均有明显提高；保证了肺癌血浆外泌体cd47、cd63、tlr7蛋白生物标志物和诊断试剂盒的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
23.附图说明
24.图1（a）为血浆外泌体形态图；图1（b）为血浆外泌体粒径图；图1（c）为血浆外泌体表面标志蛋白图；图2为肺癌病人组与健康对照组血浆中表达差异最显著的21种蛋白质的质谱分析热图。
25.图3为3种筛选出的显著差异蛋白（cd63、prss1、cd47、tlr7）在肺癌病人组与健康对照组血浆外泌体中表达差异的western blot结果图。
26.图4为蛋白质cd47、cd63、tlr7在肺癌病人组与健康对照组血浆外泌体中的差异表达的elisa结果图。
27.图5为tlr7对肺癌病人诊断效果的roc图；图6为cd47、cd63、tlr7组合使用、与tlr7单一使用、cea蛋白质分别对肺癌病人诊断效果的roc图。
具体实施方式
28.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例
29.一种与肺癌相关的血浆外泌体蛋白标志物，所述的血浆外泌体蛋白标志物为血浆外泌体蛋白tlr7，优选为血浆外泌体蛋白cd47、cd63、tlr7的组合。
30.本发明提供了一种抗体，所述抗体能特异性捕获包括上述的与肺癌相关的血浆外泌体蛋白标志物。该抗体是由abcam公司定制合成的抗tlr7蛋白的单克隆抗体和生物素化的抗tlr7蛋白抗体；优选地，该抗体是由abcam公司定制合成的抗cd47、cd63、tlr7蛋白的单克隆抗体和生物素化的抗cd47、cd63、tlr7蛋白抗体。
31.本发明提供了上述的血浆外泌体蛋白标志物、抗体在肺癌诊断试剂盒制备中的应用。
32.本发明提供了一种肺癌诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测血浆中的上述的蛋白标志物的表达量。
33.所述的试剂盒中包括上述的抗体。述的试剂盒还包括酶联免疫常用的试剂和酶。
34.所述的试剂盒包括抗tlr7蛋白的单克隆抗体、 tlr7标准品、生物素化的抗tlr7蛋白抗体、辣根过氧化物标记的亲和素、生物素。
35.所述的试剂盒包括抗cd47、cd63、tlr7蛋白的单克隆抗体，cd47、cd63、tlr7标准品，生物素化的抗cd47、cd63、tlr7蛋白抗体，辣根过氧化物标记的亲和素，生物素。
36.本发明首先分离了肺癌病人及与病人年龄性别等信息匹配的健康对照的血浆样本，提取外泌体进行蛋白质谱分析，经过初步筛选后通过样本进行验证，进而筛选出一组与肺癌高度相关的且具有较高敏感性和特异性的血浆外泌体标志物，并基于此研发出可应用于肺癌临床诊断的试剂盒，为肺癌的筛查和早期诊断提供基础。
37.本发明解决问题的技术方案包括：(1)以标准操作程序(sop) 采集符合标准的血样，系统收集完整的临床病例信息资料。
38.(2) 血浆外泌体蛋白差异表达谱筛选分析：筛选肺癌患者、与肺癌患者年龄性别相匹配的健康人对照，分离血浆外泌体，通过蛋白质谱分析，得到血浆外泌体蛋白表达谱，筛选出差异表达的蛋白并通过样本进行验证。
39.(3) 对前面筛选到的差异表达的血浆外泌体蛋白进行定量分析，明确与肺癌发病相关的血浆外泌体蛋白。
40.(4) 基于以上筛选到的血浆外泌体蛋白，研发诊断试剂盒。
41.具体来说包括以下几个部分：(1) 收集病人样本：
①
经影像学诊断、病理学确认的肺癌病例；
②
所有样本为术前，未经放化疗和新辅助治疗的；
③
健康对照为与病人年龄性别匹配的正常人。本研究共采用38例符合标准的肺癌病人血浆样本进行研究。
42.(2)使用total exosome isolation kit (from plasma) (invitrogen thermos fisher)试剂盒提取血浆外泌体。
43.(3)外泌体质量检测：通过透射电镜、nanosight、western blot，对血浆外泌体进行鉴定。
44.(4)蛋白质谱分析：
①
提取血浆外泌体总蛋白，进行蛋白质质谱分析；数据分析与处理(5)western blot方法
①
提取血浆外泌体；
②
使用abcam公司生产的蛋白抗体进行western blot分析验证；
④
检测比较肺癌患者与健康正常对照血浆样本中外泌体蛋白的表达变化。
45.(6)制备肺癌血浆外泌体蛋白诊断试剂盒
①
前期通过蛋白质谱检测肺癌患者和正常对照之间的种类差异和表达差异的蛋白，通过western blot技术进一步对肺癌患者和健康对照中差异较显著的血浆外泌体蛋白进行检测，作为辅助肺癌诊断的指标。最后筛选到与肺癌相关的血浆外泌体蛋白：cd47、cd63、tlr7蛋白作为诊断标志物。在此基础上研发肺癌诊断试剂盒，该试剂盒包括抗cd47、cd63、tlr7蛋白的单克隆抗体，cd47、cd63、tlr7标准品，生物素化的抗cd47、cd63、tlr7蛋白抗体，辣根过氧化物标记的亲和素，生物素等。
46.(7)数据分析所有统计检验均使用graphpad prism软件7进行。数据以平均值
±
sems表示。p 《 0.05为差异有统计学意义。组间样本的正态性和等方差分别用shapiro-wilk检验和brown-forsythe检验进行评估。当样本组间达到正态性和方差相等时，采用单因素方差分析(随后采用bonferroni多重比较检验)、双因素方差分析(随后采用bonferroni多重比较检验)或t检验。
47.以下是本发明进一步的说明：首先，对提取的血浆外泌体进行鉴定，通过透射电镜观察形态观察外泌体形态，如
图1（a）所示；nanosight对外泌体进行粒径分析，如图1（b）所示；western blot检测外泌体表面标志蛋白，如图1（c）所示；可以看出外泌体形态、大小、生化指标均符合测试研究标准。
48.在探索阶段，发明人分别对4例肺癌血浆外泌体和4例健康对照血浆外泌体，运用蛋白质谱分析，通过筛选发现有21种蛋白质在肺癌血浆外泌体样本中发生显著变化（变化倍数》2），结果如图2所示。
49.根据测序结果，发明人选择了在肺癌患者中表达显著升高，且升高水平排在前4位的外泌体蛋白进行分析（升高倍数》2），由abcam公司定制合成相应的蛋白质抗体进行检测，对有统计学显著差异的蛋白质在4例肺癌病例和4例对照中进行进一步进行一一验证，进而观察本研究结果的稳定程度，结果发现肺癌病例样本的外泌体中cd47、cd63、tlr7蛋白升高最为显著，结果如图3所示。
50.根据以上结果，在另外4例健康对照和4例肺癌患者血浆中对上述cd47、cd63、tlr7蛋白进行进一步elisa检测验证，结果显示：cd47、cd63、tlr7蛋白在肺癌样本中显著升高，结果如图4所示。
51.进一步分析上述蛋白用于肺癌诊断的效果，使用了30例病人样本做了roc曲线(receiver operatingcharacteristiccurve，受试者工作特征曲线)分析发现tlr7蛋白对肺癌有较好的诊断效果，结果如图5所示，敏感度达到83.33%，特异性达到80%。
52.进一步分析cd47、cd63和tlr7蛋白组合使用与tlr7蛋白单一使用、与传统基于癌胚蛋白cea肺癌诊断效果的对比，结果如图6所示。组合使用对肺癌有较好的诊断效果，曲线下面积达到0.9328，敏感度达到93.33%，特异性达到80%，与传统基于癌胚蛋白cea的检测方式敏感度（66.67%）和特异性（76.67%）或者tlr7蛋白单一检测方式敏感度（83.33%）和特异性（80%）相比，均有明显提高。