一种水产贝类中微塑料的定性定量检测方法

1.本发明涉及一种水产贝类中微塑料的定性定量检测方法。


背景技术：

2.微塑料(microplastics,mp)是指粒径小于5mm的塑料颗粒，是当前海洋环境、食品安全研究的热点新兴污染物之一。在洋流循环系统、河口湾和受其他人类活动影响剧烈的沿海海域环境受微塑料污染最为严重，而这些水域正是食用海产品的捕捞和养殖区。因此，海产品是否受到微塑料污染成为人们密切关注的问题。研究发现，微塑料可被多种海洋生物摄入，而海洋动物被人类食用是暴露微塑料危害的主要途径。滤食动物会在滤食过程中把水中的微塑料收纳入消化道；而以底栖生物为食的海洋动物则可能会在进食同时摄入沉积物中的微塑料。目前已在多种人类可食用的海产品如双壳贝类中发现微塑料。
3.贝类为其他营养级的生物提供栖息地和食物，是连接浮游和底栖生态系统的桥梁，它可以通过食物链把污染物传递到更高的营养级，由此给海洋环境带来一定的生态风险。另外，双壳贝类也是一种重要的海产品，与人体健康息息相关。对双壳贝类的大量食用成为微塑料暴露于人体的一条重要途径，有必要对贝类中的微塑料进行定性和定量检测。
4.由于生物样品含有大量的有机质，因此有机质的消解和目标微塑料的提取是贝类中微塑料准确检测的关键，也是后续定性定量鉴别方法的前提。目前微塑料的检测中大部分采用可视化鉴定、显微镜观察和热重分析等方法，通过样品可视化挑选，将微塑料粒子拣出，再采用显微红外或者拉曼等方法进行定性检测。这类方法比较直观，但是不适合大批量样品分析，人工拣选目标塑料粒子的效率极低，同时也会受到其他非目标基质的干扰。
5.另外，化学成分的确证是微塑料定性分析的关键。傅里叶变换显微红外光谱(micro-ftir)、显微拉曼光谱(micro-raman)及扫描电子显微镜x射线能量色散谱(sem-eds)等技术被用于微塑料化学成分的确证。micro-ftir技术通过采集微区内不同微塑料的红外光谱图进行高聚物化学组分鉴定，是目前多种环境介质中微塑料定性分析的主流技术，但是在检测前需要通过人工挑拣出微塑料粒子，耗时长，而且容易有疏漏。micro-raman技术可通过材料表面官能团的信息对尺寸小至1μm的微塑料进行化学组分检测，但如何去除拉曼光谱荧光背景是操作中的难点。sem-eds技术则是通过观测微塑料表面的特征能谱进行定性检测。目前双壳贝类体内微塑料的定量分析主要通过目检法进行人工计数计算其丰度。目检法耗时、费力并且误差较大。


技术实现要素：

6.针对现有技术中，微塑料的定性检测存在的问题，以及定量分析目检法的缺陷，本发明采用有机溶剂快速溶解或洗脱提取样品中的微塑料，利用热裂解-气相色谱-质谱技术对塑料粒子的特征峰进行鉴定，通过裂解色谱图、裂解产物质谱图进行定性定量分析。
7.本发明采用的技术方案是：
8.一种水产贝类中微塑料的定性定量检测方法，所述方法包括以下步骤：
气相色谱-质谱仪检测得到；
29.所述的特征峰为塑料标准品经过热裂解后，得到的特征小分子的色谱峰和相对应的质谱图，记录每种塑料标准品的特征峰，通过对样品的色谱峰和质谱峰的定性分析，来判定塑料粒子的成分；
30.在定量检测中，塑料粒子的标准曲线按以下方法制得：将微塑料标准品用和步骤(3)相同的有机溶剂溶解，配制成标准品溶液，取不同体积量的标准品溶液于热裂解-气相色谱质谱的样品杯中，待溶剂挥发，得到微塑料颗粒含量不同的进样品，用热裂解-气相色谱-质谱仪在相同条件下检测，以塑料粒子的特征峰的定量离子峰面积作为纵坐标，微塑料的质量作为横坐标，绘制得到标准曲线。
31.热裂解-气相色谱-质谱仪的条件为：
32.裂解温度600℃，裂解时间1min，接口温度：300℃。
33.色谱-质谱条件：色谱柱：db-5ht柱30m
×
0.25mm
×
0.10mm；柱温：初温50℃，以5℃/min的速率升温到280℃，保持0分钟；进样口温度：300℃，分流比20:1；溶剂延迟：2min；载气：高纯氦气，流量1.0ml/min；色谱-质谱接口温度：280℃；电离方式：ei；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；采用全扫描模式进行定性，质谱扫描范围：29m/z-600m/z。
34.所述步骤(4)中，浓缩可以是加热浓缩或氮吹浓缩。
35.本发明方法适用于水产贝类中特征峰较为明显的微塑料粒子的分析，如聚酰胺、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯醇等，提取快速彻底，损失小，分析速度快，可同时实现定性和定量检测。
36.本发明使用的热裂解-气相色谱-质谱技术py
–
gc/ms(pyrolysis
–
gaschromatography coupled with mass spectrometry)技术虽然与micro-ftir和micro-raman相比不是一种无损的检测方式，但因为有质谱的应用，使得其在定性和定量方面更有优势。py
–
gc/ms可以把待测样品中的微纤维或微塑料当成一个“黑箱”里的未知物质，通过消解等前处理方法去除基质干扰后根据热裂解产物的质谱分析来达到定性定量检测的目的。同时前处理过程中采用特定有机溶剂提取技术，将塑料粒子完全溶解提取或洗脱提取，可以缩短人工目检的时间，同时提取较为全面，可以进行定量测试。
附图说明
37.图1 pa6、pa66、ps三种塑料标准品的总离子流图。
38.图2 pa6的标准曲线图。
39.图3贻贝样品(未加标)的热裂解总离子流图。
40.图4贻贝加标回收样品的热裂解总离子流图。
41.图5缢蛏的内脏团照片。
42.图6缢蛏的鳃照片。
43.图7缢蛏的肉质照片。
44.图8缢蛏内脏团样品的裂解色谱提取离子流图。
45.图9 pa66的特征小分子环戊酮的质谱图。
46.图10贻贝的内脏团照片。
47.图11贻贝的鳃照片。
48.图12贻贝的肉质照片。
49.图13贻贝肉质样品的裂解色谱提取离子流图。
50.图14 ps的特征小分子苯乙烯的质谱图。
51.图15血蛤的内脏团照片。
52.图16血蛤的鳃照片。
53.图17血蛤的肉质照片。
54.图18血蛤鳃样品的裂解色谱提取离子流图。
55.图19 pa6的特征小分子己内酰胺质谱图。
具体实施方式
56.下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明，但本发明的保护范围不限于此。
57.实施例1
58.塑料标准品特征峰的检测：
59.将pa6、pa66和ps粉末等质量混合均匀，取少量放到热裂解-气相色谱质谱仪的样品杯内进样，scan模式，得到pa6、pa66、ps三种标准品总离子流图，如图1所示。图1中，4.813分钟是pa66的裂解特征小分子环戊酮，5.902分钟是ps的裂解特征小分子苯乙烯，11.649分钟是pa6的裂解特征小分子己内酰胺。
60.热裂解设备：品牌frontier lab，型号：double-shot pyrolyzer py-2020id。
61.气相色谱-质谱：品牌agilent，型号：6890n-5975b。
62.仪器条件为：
63.裂解温度600℃，裂解时间1min，接口温度：300℃。
64.色谱-质谱条件：色谱柱：db-5ht柱30m
×
0.25mm
×
0.10mm；柱温：初温50℃，以5℃/min的速率升温到280℃，保持0分钟；进样口温度：300℃，分流比20:1；溶剂延迟：2min；载气：高纯氦气，流量1.0ml/min；色谱-质谱接口温度：280℃；电离方式：ei；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；采用全扫描模式进行定性，质谱扫描范围：29m/z-600m/z。
65.实施例2
66.pa6的标准曲线制作和定量检测：
67.将pa6微塑料粒子用六氟异丙醇溶解，配制成2mg/ml标准储备液。取2.5ml标准储备液，用六氟异丙醇定容至25毫升，配制成0.2mg/ml标准使用液。分别取10μl、20μl、40μl、80μl、160μl和320μl的标准使用液于热裂解-气相色谱质谱的样品杯中，待溶剂挥发，得到微塑料颗粒含量为2μg、4μg、8μg、16μg、32μg和64μg的标准系列。注意如果待挥发的溶剂量超过样品杯容量，需要分次添加样品。
68.将上述不同质量的标准系列用热裂解-气相色谱-质谱仪进行检测，sim模式，仪器条件同实施例1。
69.以pa6特征峰的定量离子峰面积作为纵坐标，微塑料的质量作为横坐标，绘制得到pa6的标准曲线，如图2所示。线性回归方程为y＝1.06e+06x+6.32e+05，r2＝1.00。
70.加标进行定量检测并计算回收率：
71.将贻贝样品按照内脏团、鳃和肉质进行分类解剖，解剖好的部位分类制样匀浆。称
取10g肉质，加入10wt％koh溶液200ml，涡旋振荡分散样品后在60℃烘箱中加热2小时，每过半个小时取出振荡分散一次。随后将样品用1800目不锈钢网筛过滤，用去离子水冲洗筛上物。随后用15ml六氟异丙醇作为溶剂分三次彻底冲洗网筛表面，至网筛表面的微塑料粒子全部溶解，洗脱液转移至玻璃试管中，加热浓缩至近干，用六氟异丙醇定容至1毫升，取50微升样液转移至样品杯中，挥发溶剂后进样，用热裂解-气相色谱-质谱仪进行检测，sim模式，仪器条件同实施例1。
72.另取相同样品10g，加入pa6颗粒2mg，其余检测步骤同上。
73.贻贝样品(未加标)的热裂解总离子流图如图3所示，贻贝加标回收样品的热裂解总离子流图如图4所示。
74.将加标样品特征峰的定量离子峰面积和标准曲线对比，计算得到样品中的pa6含量为1.98μg/g，加标回收率为91.0％。
75.实施例3
76.缢蛏中微塑料粒子检测
77.将缢蛏样品按照内脏团、鳃和肉质进行分类解剖(分别如图5-7所示)，解剖好的部位分类制样匀浆。称取5g内脏团，加入pa66颗粒1mg，加入10wt％koh溶液100ml，涡旋振荡分散样品后在60℃烘箱中加热2小时，每过半个小时取出振荡分散一次。消化结束将溶液用1800目不锈钢网筛过滤，用去离子水冲洗网筛表面，随后用10毫升六氟异丙醇作为溶剂，反复冲洗网筛表面，将网筛表面的微塑料粒子溶解并全部洗脱至玻璃试管中，氮吹浓缩至约100微升，转移至样品杯中，挥发溶剂后进样，用热裂解-气相色谱-质谱仪进行检测。
78.热裂解设备：品牌frontier lab，型号：double-shot pyrolyzer py-2020id。
79.气相色谱-质谱：品牌agilent，型号：6890n-5975b。
80.仪器条件为：
81.裂解温度600℃，裂解时间1min，接口温度：300℃。
82.色谱-质谱条件：色谱柱：db-5ht柱30m
×
0.25mm
×
0.10mm；柱温：初温50℃，以5℃/min的速率升温到280℃，保持0分钟；进样口温度：300℃，分流比20:1；溶剂延迟：2min；载气：高纯氦气，流量1.0ml/min；色谱-质谱接口温度：280℃；电离方式：ei；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；采用全扫描模式进行定性，质谱扫描范围：29m/z-600m/z。
83.加标样品检出pa66，回收率87.5％，图8为缢蛏加标样品的裂解色谱提取离子流图，m/z 84，其中可见pa66的特征峰4.813分，这是pa66热裂解后，特征小分子环戊酮的色谱峰，图9为pa66的特征小分子环戊酮的质谱图。
84.实施例4
85.贻贝中微塑料粒子检测
86.将贻贝样品按照内脏团、鳃和肉质进行分类解剖(分别如图10-12所示)，解剖好的部位分类制样匀浆。称取15g肉质，加入ps颗粒1mg，加入10wt％koh溶液200ml，涡旋振荡分散样品后在60℃烘箱中加热2小时，每过半个小时取出振荡分散一次。随后将样品用1800目不锈钢网筛过滤，用去离子水冲洗筛上物，再将残留样品用进行二次消化，用50ml30％h2o2冲洗到玻璃三角瓶中，加入0.05m的feso4溶液30ml，再60℃加热1小时，间隔20分钟补加20ml30％h2o2。消化结束将溶液用1800目不锈钢网筛过滤，用去离子水冲洗网筛表面，随后用15ml二甲苯作为溶剂反复冲洗网筛表面，将网筛表面的微塑料粒子洗脱至玻璃试管中，
氮吹浓缩至约100微升，转移至样品杯中，挥发溶剂后进样，用热裂解-气相色谱-质谱仪进行检测，仪器条件同实施例3。加标样品检出ps，回收率90.3％，图13为贻贝加标样品的裂解色谱提取离子流图，m/z104，其中可见ps的特征峰5.902分，这是ps热裂解后，特征小分子苯乙烯的色谱峰。图14为ps的特征小分子苯乙烯的质谱图。
87.实施例5血蛤中微塑料粒子检测
88.将血蛤样品按照内脏团、鳃和肉质进行分类解剖(分别如图15-17所示)，解剖好的部位分类制样匀浆。称取5g鳃，加入pa6颗粒1mg，加入10％koh溶液100ml，涡旋振荡分散样品后在60℃烘箱中加热2小时，每过半个小时取出振荡分散一次。随后将样品用1800目不锈钢网筛过滤，用去离子水冲洗筛上物，随后用10ml六氟异丙醇作为溶剂将网筛表面的微塑料粒子洗脱至玻璃试管中，氮吹浓缩至约100微升，转移至样品杯中，挥发溶剂后进样，用热裂解-气相色谱-质谱仪进行检测，仪器条件同实施例3。加标检出pa6，回收率88.7％，图18为血蛤样品的裂解色谱提取离子流图，m/z 113，其中可见pa6特征峰11.649分，这是pa6热裂解后，特征性小分子己内酰胺的色谱峰。图15为pa6的特征性小分子己内酰胺质谱图。