数字PCR检测系统

数字pcr检测系统
技术领域
1.本发明属于光电检测技术领域，具体涉及一种高效率高精度的数字pcr检测系统。


背景技术：

2.作为第三代pcr技术，数字pcr成为近年来的研究热点，并且凭借其绝对定量、高灵敏、重复性好成为新一代核酸定量技术。可以精确计算dna分子的个数，是对起始样品的绝对定量。成为肿瘤液体活检、癌症早期筛查、感染性疾病检测等核心关键技术之一。目前市场上存在的基于流式原理的数字pcr荧光检测系统多采用显微物镜聚焦光源来激发荧光信号，在使用中可能存在聚焦光斑过大或者多束荧光偏移等问题，导致产生的荧光信号不强，很难做到多荧光同时检测。现有的成熟产品中多采用单、双通道荧光检测，只能同时检测一种或两种目标核酸分子，效率不高，无法实现多重荧光分析。或采用ccd成像方式检测微滴阴阳性，相比于基于流式原理的数字pcr检测系统来说线性范围低、通量小。另外常用的数字pcr检测系统也存在光路体积过大的问题。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提出一种数字pcr检测系统，解决现有技术存在的难以高精度地检测荧光信号和难以高效率地进行数字pcr检测以及检测系统体积过大的问题。采用x-棱镜可以压缩光路，大大减小检测系统的体积。
4.为实现上述目的，本发明的数字pcr检测系统包括激发光源模块、荧光信号检测模块、微滴传送模块、微滴计数模块以及二向色镜ⅲ；所述激发光源模块包括多色激发光源，激发光源模块的多色激发光源整合为同一输出方向；所述荧光信号检测模块包括多个荧光探测器；所述激发光源模块的多色激发光源经二向色镜ⅲ反射并经微滴传送模块的平凸物镜垂直入射至微滴传送模块，多色激发光源照射在微滴传送模块内的样品微滴上并反射多色荧光信号，反射的多色荧光信号经二向色镜ⅲ透射进入荧光信号检测模块，所述多色荧光信号经荧光信号检测模块分成多束并分别进入相应的荧光探测器转化为数字信号；多色激发光源照射在微滴传送模块内的样品微滴上产生的散射光信号进入微滴计数模块，通过所述微滴计数模块计算微滴个数，并分辨微滴尺寸，滤除尺寸不符合要求的微滴。
5.所述激发光源模块包括第一激发光源子模块、第二激发光源子模块、第三激发光源子模块、第四激发光源子模块、二向色镜ⅰ以及x-棱镜ⅰ；所述第三激发光源子模块的光束以及第四激发光源子模块的光束分别经二向色镜ⅰ反射和透射为同一方向的光束，并与第一激发光源子模块以及第二激发光源子模块的光束经x-棱镜ⅰ整合并输出作为激发光源模块的输出光束。
6.所述第一激发光源子模块包括激发光源ⅰ、与所述激发光源ⅰ对应的准直透镜组ⅰ以及与所述激发光源ⅰ对应的滤光片ⅰ；所述激发光源ⅰ发出的经准直透镜组ⅰ进行缩束准直并滤光片ⅰ进行滤光后射入x-棱镜ⅰ；
所述第二激发光源子模块包括激发光源ⅱ、与所述激发光源ⅱ对应的准直透镜组ⅱ以及与所述激发光源ⅱ对应的滤光片ⅱ；所述激发光源ⅱ发出的经准直透镜组ⅱ进行缩束准直并滤光片ⅱ进行滤光后射入x-棱镜ⅰ；所述第三激发光源子模块包括激发光源ⅲ、与所述激发光源ⅲ对应的准直透镜组ⅲ以及与所述激发光源ⅲ对应的滤光片ⅲ；所述激发光源ⅲ发出的经准直透镜组ⅲ进行缩束准直并滤光片ⅲ进行滤光后射入二向色镜ⅰ，经二向色镜ⅰ反射后射入x-棱镜ⅰ；所述第四激发光源子模块包括激发光源ⅳ、与所述激发光源ⅳ对应的准直透镜组ⅳ以及与所述激发光源ⅳ对应的滤光片ⅳ；所述激发光源ⅳ发出的经准直透镜组ⅳ进行缩束准直并滤光片ⅳ进行滤光后射入二向色镜ⅰ，经二向色镜ⅰ透射后射入x-棱镜ⅰ。
7.所述激发光源ⅰ、激发光源ⅱ、激发光源ⅲ、激发光源ⅳ为led光源、卤素光源、激光光源或汞灯光源。
8.所述荧光信号检测模块包括x-棱镜ⅱ、二向色镜ⅱ、第一荧光检测子模块、第二荧光检测子模块、第三荧光检测子模块以及第四荧光检测子模块；第一激发光源子模块和第一荧光检测子模块形成第一检测通路，第二激发光源子模块和第二荧光检测子模块形成第二检测通路，第三激发光源子模块和第三荧光检测子模块形成第三检测通路，第四激发光源子模块和第四荧光检测子模块形成第四检测通路；入射至荧光信号检测模块的光经x-棱镜ⅱ分成三束，第一束经二向色镜ⅱ反射及透射后分别进入第一荧光检测子模块以及第二荧光检测子模块；第二束进入第三荧光检测子模块，第三束进入第四荧光检测子模块。
9.所述第一荧光检测子模块包括荧光探测器ⅰ、与荧光探测器ⅰ对应的针孔滤波器ⅰ、与荧光探测器ⅰ对应的准直透镜组
ⅴ
以及与荧光探测器ⅰ对应的滤光片
ⅴ
；进入第一荧光检测子模块的光束经滤光片
ⅴ
滤光后经准直透镜组
ⅴ
准直再经针孔滤波器ⅰ滤波后被荧光探测器ⅰ，并经荧光探测器ⅰ接收转换为数字信号；所述第二荧光检测子模块包括荧光探测器ⅱ、与荧光探测器ⅱ对应的针孔滤波器ⅱ、与荧光探测器ⅱ对应的准直透镜组ⅵ以及与荧光探测器ⅱ对应的滤光片ⅵ；进入第二荧光检测子模块的光束经滤光片ⅵ滤光后经准直透镜组ⅵ准直再经针孔滤波器ⅱ滤波后被荧光探测器ⅱ，并经荧光探测器ⅱ接收转换为数字信号；所述第三荧光检测子模块包括荧光探测器ⅲ、与荧光探测器ⅲ对应的针孔滤波器ⅲ、与荧光探测器ⅲ对应的准直透镜组ⅶ以及与荧光探测器ⅲ对应的滤光片ⅶ；进入第三荧光检测子模块的光束经滤光片ⅶ滤光后经准直透镜组ⅶ准直再经针孔滤波器ⅲ滤波后被荧光探测器ⅲ，并经荧光探测器ⅲ接收转换为数字信号；所述第四荧光检测子模块包括荧光探测器ⅳ、与荧光探测器ⅳ对应的针孔滤波器ⅳ、与荧光探测器ⅳ对应的准直透镜组
ⅷ
以及与荧光探测器ⅳ对应的滤光片
ⅷ
；进入第四荧光检测子模块的光束经滤光片
ⅷ
滤光后经准直透镜组
ⅷ
准直再经针孔滤波器ⅳ滤波后被荧光探测器ⅳ，并经荧光探测器ⅳ接收转换为数字信号。
10.所述荧光探测器ⅰ、荧光探测器ⅱ、荧光探测器ⅲ以及荧光探测器ⅳ为pmt光电倍增管、apd雪崩光电二极管、光子计数探头、iccd像增探测器或emccd电子倍增ccd探测器。
11.所述微滴传送模块包括：流道，所述流道的进液端包括中间的主通道以及与主通道汇聚一点的位于两侧的分通道；所述流道检测点位置处为平凸物镜，多色激发光源经平凸物镜入射至微滴传送模
块；以及驱动装置，通过所述驱动装置使样品微滴在所述流道内形成层流，由流道的一端途经平凸物镜流至另一端。
12.所述驱动装置包括鞘液瓶、蠕动泵、样品液以及注射泵；所述样品液通过注射泵进入流道进液端的主通道并形成微滴；所述鞘液瓶内的液体通过蠕动泵进入流道的两个分通道，在主通道和分通道汇聚点通过鞘液流包裹微滴形成层流。
13.所述微滴计数模块包括聚焦透镜和光电二极管；所述聚焦透镜位于所述微滴传送模块与所述光电二极管之间，多色激发光源照射在微滴传送模块内的样品微滴上产生的散射光信号经聚焦透镜聚焦后经光电二极管收集。
14.本发明的有益效果为：本发明的数字pcr检测系统通过采用平凸物镜与流道结合，使得通过流道的样品微滴发出的荧光信号能被精确收集，从而使得荧光信号检测模块能够精确的检测样品微滴的荧光信号，进而能精确的统计样品中目标核酸分子的浓度。通过多通道的激发光源模块和荧光信号检测模块，可以同时检测多种目标核酸分子，使得系统检测效率显著提高。通过激发光源模块中的x-棱镜来整合光束，以及荧光信号检测模块中的x-棱镜来分离光束，使得系统的体积显著减小。在检测过程中，样品微滴在流道中逐个经过检测点，激发光源模块将多色光源处理整合后形成一束窄光，经过二向色镜ⅲ反射到流道，样品微滴受到激发光源激发，发出荧光信号透过二向色镜ⅲ送入荧光信号检测模块，将样品微滴的荧光信号转换成数字信号进行后续处理，微滴计数模块用于统计经过的微滴个数及尺寸，并滤除尺寸不符合的微滴。根据收集到的荧光信号数据和微滴数据，达到精确统计原始样品中目标核酸分子浓度的目的。
附图说明
15.图1为本发明的数字pcr检测系统整体结构示意图；图2为本发明的数字pcr检测系统中微滴传送模块结构示意图；图3为本发明的数字pcr检测系统中流道检测点位置放大图；图4为本发明的数字pcr检测系统中平凸物镜原理图；图5为本发明的数字pcr检测系统中x-棱镜ⅰ结构示意图；图6为本发明的数字pcr检测系统中x-棱镜ⅱ结构示意图；其中：10、激发光源模块，111、激发光源ⅰ，112、激发光源ⅱ，113、激发光源ⅲ，114、激发光源ⅳ，121、准直透镜组ⅰ，122、准直透镜组ⅱ，123、准直透镜组ⅲ，124、准直透镜组ⅳ，131、滤光片ⅰ，132、滤光片ⅱ，133、滤光片ⅲ，134、滤光片ⅳ，14、x-棱镜ⅰ，15、二向色镜ⅰ，20、荧光信号检测模块，211、荧光探测器ⅰ，212、荧光探测器ⅱ，213、荧光探测器ⅲ，214、荧光探测器ⅳ，221、针孔滤波器ⅰ，222、针孔滤波器ⅱ，223、针孔滤波器ⅲ，224、针孔滤波器ⅳ，231、准直透镜组
ⅴ
，232、准直透镜组ⅵ，233、准直透镜组ⅶ，234、准直透镜组
ⅷ
，241、滤光片
ⅴ
，242、滤光片ⅵ，243、滤光片ⅶ，244、滤光片
ⅷ
，25、x-棱镜ⅱ，26、二向色镜ⅱ，30、二向色镜ⅲ，40、微滴传送模块，41、流道，42、平凸物镜，43、样品微滴，44、驱动装置，441、鞘液瓶，442、蠕动泵，443、样品液，444、注射泵，445、废液瓶，50、微滴计数模块，51、聚焦透镜，52、光电二极管。
具体实施方式
16.下面结合附图对本发明的实施方式作进一步说明。
17.参见附图1-附图6，本发明的数字pcr检测系统包括激发光源模块10、荧光信号检测模块20、微滴传送模块40、微滴计数模块50以及二向色镜ⅲ30；所述激发光源模块10包括多色激发光源，激发光源模块10的多色激发光源整合为同一输出方向；所述荧光信号检测模块20包括多个荧光探测器；所述激发光源模块10的多色激发光源经二向色镜ⅲ30反射并经微滴传送模块40的平凸物镜42垂直入射至微滴传送模块40，多色激发光源照射在微滴传送模块40内的样品微滴43上并反射多色荧光信号，反射的多色荧光信号经二向色镜ⅲ30透射进入荧光信号检测模块20，所述多色荧光信号经荧光信号检测模块20分成多束并分别进入相应的荧光探测器转化为数字信号；多色激发光源照射在微滴传送模块40内的样品微滴43上产生的散射光信号进入微滴计数模块50，通过所述微滴计数模块50计算微滴个数，并分辨微滴尺寸，滤除尺寸不符合要求的微滴。
18.所述激发光源模块10将多色激发光源整合；所述荧光信号检测模块20将收集的荧光信号分成多束，送入相应的荧光探测器转化为数字信号；所述微滴传送模块40由所述驱动装置44驱动所述样品微滴43经过检测点进行检测；所述微滴计数模块50将用以计算微滴个数，并分辨微滴尺寸，滤除尺寸不符合要求的微滴。所述二向色镜ⅲ30用以反射激发光源，透射检测荧光。
19.所述二向色镜ⅲ30位于激发光源模块10、微滴传送模块40和荧光信号检测模块20三者之间。将激发光源模块10输出的光反射进入微滴传送模块40，照射到微滴传送模块40里的样品微滴43上，同时微滴传送模块40里的样品微滴43发出散射光信号经所述二向色镜ⅲ30透射进入荧光信号检测模块20；所述二向色镜ⅲ30为半反半透色镜，所述半反半透色镜位于水平方向上的倾斜角为45度。
20.所述激发光源模块10包括第一激发光源子模块、第二激发光源子模块、第三激发光源子模块、第四激发光源子模块、二向色镜ⅰ15以及x-棱镜ⅰ14；所述第三激发光源子模块的光束以及第四激发光源子模块的光束分别经二向色镜ⅰ15反射和透射为同一方向的光束，并与第一激发光源子模块以及第二激发光源子模块的光束经x-棱镜ⅰ14整合并输出作为激发光源模块10的输出光束。
21.所述第一激发光源子模块包括激发光源ⅰ111、与所述激发光源ⅰ111对应的准直透镜组ⅰ121以及与所述激发光源ⅰ111对应的滤光片ⅰ131；所述激发光源ⅰ111发出的经准直透镜组ⅰ121进行缩束准直并滤光片ⅰ131进行滤光后射入x-棱镜ⅰ14；所述第二激发光源子模块包括激发光源ⅱ112、与所述激发光源ⅱ112对应的准直透镜组ⅱ122以及与所述激发光源ⅱ112对应的滤光片ⅱ132；所述激发光源ⅱ112发出的经准直透镜组ⅱ122进行缩束准直并滤光片ⅱ132进行滤光后射入x-棱镜ⅰ14；所述第三激发光源子模块包括激发光源ⅲ113、与所述激发光源ⅲ113对应的准直透镜组ⅲ123以及与所述激发光源ⅲ113对应的滤光片ⅲ133；所述激发光源ⅲ113发出的经准直透镜组ⅲ123进行缩束准直并滤光片ⅲ133进行滤光后射入二向色镜ⅰ15，经二向色镜ⅰ15反射后射入x-棱镜ⅰ14；所述第四激发光源子模块包括激发光源ⅳ114、与所述激发光源ⅳ114对应的准直
透镜组ⅳ124以及与所述激发光源ⅳ114对应的滤光片ⅳ134；所述激发光源ⅳ114发出的经准直透镜组ⅳ124进行缩束准直并滤光片ⅳ134进行滤光后射入二向色镜ⅰ15，经二向色镜ⅰ15透射后射入x-棱镜ⅰ14。
22.所述激发光源ⅰ111、激发光源ⅱ112、激发光源ⅲ113、激发光源ⅳ114为led光源、卤素光源、激光光源或汞灯光源。
23.所述滤光片ⅰ131光谱范围与所述激发光源ⅰ111相匹配，所述滤光片ⅱ132光谱范围与所述激发光源ⅱ112相匹配，所述滤光片ⅲ133光谱范围与所述激发光源ⅲ113相匹配，所述滤光片ⅳ134光谱范围与所述激发光源ⅳ114相匹配。
24.所述二向色镜ⅰ15为半反半透色镜，所述半反半透色镜位于竖直方向上的倾斜角为45度。所述x-棱镜ⅰ14位于所述激发光源模块10的输出端，将三束光整合。
25.所述二向色镜ⅰ15位于所述x-棱镜ⅰ14与所述滤光片ⅲ133、所述滤光片ⅳ134之间，将反射所述滤光片ⅲ133进行处理后的所述激发光源ⅲ113的光，将透过所述滤光片ⅳ134进行处理后的所述激发光源ⅳ114的光。
26.所述准直透镜组ⅰ121和所述滤光片ⅰ131位于所述x-棱镜ⅰ14与所述激发光源ⅰ111之间，将所述激发光源ⅰ111发出的光进行准直缩束并滤光。
27.所述准直透镜组ⅱ122和所述滤光片ⅱ132位于所述x-棱镜ⅰ14与所述激发光源ⅱ112之间，将所述激发光源ⅱ112发出的光进行准直缩束并滤光。
28.所述准直透镜组ⅲ123和所述滤光片ⅲ133位于所述二向色镜ⅰ15与所述激发光源ⅲ113之间，将所述激发光源ⅲ113发出的光进行准直缩束并滤光。
29.所述准直透镜组ⅳ124和所述滤光片ⅳ134位于所述二向色镜ⅰ15与所述激发光源ⅳ114之间，将所述激发光源ⅳ114发出的光进行准直缩束并滤光。
30.所述荧光信号检测模块20包括x-棱镜ⅱ25、二向色镜ⅱ26、第一荧光检测子模块、第二荧光检测子模块、第三荧光检测子模块以及第四荧光检测子模块；第一激发光源子模块和第一荧光检测子模块形成第一检测通路，第二激发光源子模块和第二荧光检测子模块形成第二检测通路，第三激发光源子模块和第三荧光检测子模块形成第三检测通路，第四激发光源子模块和第四荧光检测子模块形成第四检测通路；入射至荧光信号检测模块20的光经x-棱镜ⅱ25分成三束，第一束经二向色镜ⅱ26反射及透射后分别进入第一荧光检测子模块以及第二荧光检测子模块；第二束进入第三荧光检测子模块，第三束进入第四荧光检测子模块。
31.所述第一荧光检测子模块包括荧光探测器ⅰ211、与荧光探测器ⅰ211对应的针孔滤波器ⅰ221、与荧光探测器ⅰ211对应的准直透镜组
ⅴ
231以及与荧光探测器ⅰ211对应的滤光片
ⅴ
241；进入第一荧光检测子模块的光束经滤光片
ⅴ
241滤光后经准直透镜组
ⅴ
231准直再经针孔滤波器ⅰ221滤波后被荧光探测器ⅰ211，并经荧光探测器ⅰ211接收转换为数字信号；所述第二荧光检测子模块包括荧光探测器ⅱ212、与荧光探测器ⅱ212对应的针孔滤波器ⅱ222、与荧光探测器ⅱ212对应的准直透镜组ⅵ232以及与荧光探测器ⅱ212对应的滤光片ⅵ242；进入第二荧光检测子模块的光束经滤光片ⅵ242滤光后经准直透镜组ⅵ232准直再经针孔滤波器ⅱ222滤波后被荧光探测器ⅱ212，并经荧光探测器ⅱ212接收转换为数字信号；
所述第三荧光检测子模块包括荧光探测器ⅲ213、与荧光探测器ⅲ213对应的针孔滤波器ⅲ223、与荧光探测器ⅲ213对应的准直透镜组ⅶ233以及与荧光探测器ⅲ213对应的滤光片ⅶ243；进入第三荧光检测子模块的光束经滤光片ⅶ243滤光后经准直透镜组ⅶ233准直再经针孔滤波器ⅲ223滤波后被荧光探测器ⅲ213，并经荧光探测器ⅲ213接收转换为数字信号；所述第四荧光检测子模块包括荧光探测器ⅳ214、与荧光探测器ⅳ214对应的针孔滤波器ⅳ224、与荧光探测器ⅳ214对应的准直透镜组
ⅷ
234以及与荧光探测器ⅳ214对应的滤光片
ⅷ
244；进入第四荧光检测子模块的光束经滤光片
ⅷ
244滤光后经准直透镜组
ⅷ
234准直再经针孔滤波器ⅳ224滤波后被荧光探测器ⅳ214，并经荧光探测器ⅳ214接收转换为数字信号。
32.所述荧光探测器ⅰ211、荧光探测器ⅱ212、荧光探测器ⅲ213以及荧光探测器ⅳ214为pmt光电倍增管、apd雪崩光电二极管52、光子计数探头、iccd像增探测器或emccd电子倍增ccd探测器。
33.所述二向色镜ⅱ26为半反半透色镜，所述半反半透色镜位于水平方向上的倾斜角为45度。所述x-棱镜ⅱ25位于荧光信号检测模块20的输入端，将一束光分散为三束光。
34.所述二向色镜ⅱ26位于所述x-棱镜ⅱ25与所述滤光片
ⅴ
241、所述滤光片ⅵ242之间，反射500nm-515nm波段的荧光信号送入对应的荧光探测器ⅰ211进行处理，透过590nm-605nm波段的荧光信号送入对应的荧光探测器ⅱ212进行处理。
35.所述针孔滤波器ⅰ221、所述准直透镜组
ⅴ
231、所述滤光片
ⅴ
241依次位于所述二向色镜ⅱ26和所述荧光探测器ⅰ211之间；将送过来的荧光信号进行滤光、准直、滤除杂散光后进入所述荧光探测器ⅰ211中处理成数字信号以便后续处理。
36.所述针孔滤波器ⅱ222、所述准直透镜组ⅵ232、所述滤光片ⅵ242依次位于所述二向色镜ⅱ26和所述荧光探测器ⅱ212之间；将送过来的荧光信号进行滤光、准直、滤除杂散光后进入所述荧光探测器ⅱ212中处理成数字信号以便后续处理。
37.所述针孔滤波器ⅲ223、所述准直透镜组ⅶ233、所述滤光片ⅶ243依次位于所述x-棱镜ⅱ25和所述荧光探测器ⅲ213之间；将送过来的荧光信号进行滤光、准直、滤除杂散光后进入所述荧光探测器ⅲ213中处理成数字信号以便后续处理。
38.所述针孔滤波器ⅳ224、所述准直透镜组
ⅷ
234、所述滤光片
ⅷ
244依次位于所述x-棱镜ⅱ25和所述荧光探测器ⅳ214之间；将送过来的荧光信号进行滤光、准直、滤除杂散光后进入所述荧光探测器ⅳ214中处理成数字信号以便后续处理。
39.所述滤光片
ⅴ
241光谱范围与所述荧光探测器ⅰ211相匹配，所述滤光片ⅵ242光谱范围与所述荧光探测器ⅱ212相匹配，所述滤光片ⅶ243光谱范围与所述荧光探测器ⅲ213相匹配，所述滤光片
ⅷ
244光谱范围与所述荧光探测器ⅳ214相匹配。
40.所述微滴传送模块40包括：流道41，所述流道41的进液端包括中间的主通道以及与主通道汇聚一点的位于两侧的分通道；所述流道41检测点位置处为平凸物镜42，多色激发光源经平凸物镜42入射至微滴传送模块40；所述平凸物镜42为所述流道41的一部分，将所述激发光源聚焦到所述样品微滴43上；以及驱动装置44，通过所述驱动装置44使样品微滴43在所述流道41内形成层流，
由流道41的一端途经平凸物镜42流至另一端。
41.所述驱动装置44包括鞘液瓶441、蠕动泵442、样品液443以及注射泵444；所述样品液443通过注射泵444进入流道41进液端的主通道并形成微滴；所述鞘液瓶441内的液体通过蠕动泵442进入流道41的两个分通道，在主通道和分通道汇聚点通过鞘液流包裹微滴形成层流。最后经流道41另一端的废液瓶445收集。
42.所述微滴计数模块50包括聚焦透镜51和光电二极管52；所述聚焦透镜51位于所述微滴传送模块40与所述光电二极管52之间，多色激发光源照射在微滴传送模块40内的样品微滴43上产生的散射光信号经聚焦透镜51聚焦后经光电二极管52收集。
43.本发明实施例为四通道（fam、vic、rox、cy5）微滴式数字pcr检测系统。
44.所述激发光源ⅰ111波段范围为450-490nm，所述激发光源ⅱ112波段范围为515-535nm，所述激发光源ⅲ113波段范围为560-590nm，所述激发光源ⅳ114波段范围为620-650nm。
45.所述二向色镜ⅰ15反射波段为560-590nm，透射波段为620-650nm。
46.所述x-棱镜ⅰ14的i面上镀有短波通双色滤光膜来反射560-650nm波段的光而透射450-540nm波段的光，而ii面上是反射450-490nm波段的光，透射510-650nm波段的长波通双色滤光膜。
47.所述荧光探测器ⅰ211波段范围为500nm-515nm，所述荧光探测器ⅱ212波段范围为590-605nm，所述荧光探测器ⅲ213波段范围为605-620nm，所述荧光探测器ⅳ214波段范围为675-690nm。
48.所述二向色镜ⅱ26反射波段为500nm-515nm，透射波段为590-605nm。
49.在所述x-棱镜ⅱ25的i面上镀有双色滤光膜来反射500-600nm波段的光而透射605-690nm波段的光，而ii面上是反射670-690nm波段的光，透射500-670nm波段的双色滤光膜。
50.所述二向色镜ⅲ30反射波段为450-490nm、515-535nm、560-590nm、620-650nm，透射波段为500nm-515nm、590-605nm、605-620nm、675-690nm。
51.本发明的数字pcr检测系统的工作过程为：在所述激发光源模块10中所述激发光源ⅰ111发出的光经过准直透镜组ⅰ121准直并缩束，再经过滤光片ⅰ131滤光后射入x-棱镜ⅰ14上方输入端；所述激发光源ⅱ112发出的光经过准直透镜组ⅰ121准直并缩束，再经过滤光片ⅱ132滤光后射入x-棱镜ⅰ14左方输入端；所述激发光源ⅲ113发出的光经过所述准直透镜组ⅲ123准直并缩束，再经过所述滤光片ⅲ133进行滤光后由所述二向色镜ⅰ15反射，所述激发光源ⅳ114发出的光经过所述准直透镜组ⅳ124准直并缩束，再经过滤光片ⅳ134滤光后透过所述二向色镜ⅰ15与上述光束合为一束光，并射入x-棱镜ⅰ14下方输入端；经所述x-棱镜ⅰ14整合后形成一束光从右输出端射出。
52.光束经过所述二向色镜ⅲ30反射射入所述微滴传送模块40中，所述样品微滴43在所述驱动装置44的驱动下在所述流道41中形成层流，所述样品微滴43在鞘液流的包裹下流过所述流道41中的检测点，光束由所述平凸物镜42聚焦形成光斑照射在所述样品微滴43上。
53.所述样品微滴43内包含fam、vic、rox、cy5四种荧光探针，在受到激发光照射后，所
述样品微滴43内如果含有目标dna，经过pcr扩增后，相应的荧光探针就会产生很强的荧光。如果不含目标dna，荧光探针的荧光信号很弱，或者没有。所述样品微滴43发射出的荧光信号再由所述同一平凸物镜42收集，透过所述二向色镜ⅲ30进入所述荧光信号检测模块20。
54.进入所述荧光信号检测模块20的荧光信号射入x-棱镜ⅱ25下方输入端，由x-棱镜ⅱ25分散为三束不同波段的荧光，所述x-棱镜ⅱ25右方输出端出射的一束荧光再经过所述二向色镜ⅱ26分为两束荧光，所述两束荧光的其中一束经过所述滤光片
ⅴ
241滤光后再经过所述准直透镜组
ⅴ
231准直，再由所述针孔滤波器
ⅴ
滤除杂散光后进入所述荧光探测器ⅰ211转化为数字信号；另一束荧光经过所述滤光片ⅵ242滤光后再经过所述准直透镜组ⅵ232准直，再由所述针孔滤波器ⅵ滤除杂散光后进入所述荧光探测器ⅱ212转化为数字信号；所述x-棱镜ⅱ25上方输出端出射的一束荧光经过所述滤光片ⅶ243滤光后再经过所述准直透镜组ⅶ233准直，再由所述针孔滤波器ⅶ滤除杂散光后进入所述荧光探测器ⅲ213转化为数字信号；所述x-棱镜ⅱ25左方输出端出射的一束荧光经过所述滤光片
ⅷ
244滤光后再经过所述准直透镜组
ⅷ
234准直，再由所述针孔滤波器
ⅷ
滤除杂散光后进入所述荧光探测器ⅳ214转化为数字信号。
55.从所述微滴传送模块40中发出的另一路散射光信号则进入所述微滴计数模块50，由所述聚焦透镜51收集散射光信号送入所述光电二极管52，用以计算经过检测点的微滴个数和尺寸，并滤除尺寸过大或过小的无用微滴。所述散射光信号为前向散射光，其强度与微滴的大小有关。
56.在系统中，设定好各通道检测阈值后，若检测到相关荧光信号，则为1，此所述样品微滴43包含该目标dna分子，若没有检测到相关荧光信号或荧光信号很弱，则为0，此所述样品微滴43不包含该目标dna分子。再结合检测的微滴个数则可以计算出原始样品中各目标dna分子的浓度。