一种蒲公英植物及其提取物中总黄酮的检测方法与流程

1.本发明涉及光学检测领域，具体为一种精确检测蒲公英植物及其提取物中总黄酮的方法。


背景技术：

2.蒲公英植物及其提取物中含有极其丰富的黄酮，是蒲公英植物的主要活性成分，具有良好的广谱抑菌性，并具有较强的抗氧化作用，能有效清除超氧阴离子自由基，蒲公英植物黄酮还具有良好的抗炎作用。是判断蒲公英植物及其提取物质量的重要指标之一。
3.目前蒲公英植物及其提取物中总黄酮检测方法为硝酸铝络合分光光度法。具体为在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在条件下,黄酮类化合物与铝盐生成螯和物,加入氢氧化钠溶液后显红橙色,在500nm波长处有吸收峰且符合定量分析的比尔定律。其显色原理发生在黄酮醇类成分邻位无取代的邻二酚羟基部位,不具有邻位无取代邻二酚羟基的黄酮醇类成分加入上述试剂时是不显色的。但是蒲公英植物及其提取物中还含有极丰富的绿原酸、咖啡酸和菊苣酸(为方便描述，本文将绿原酸、咖啡酸和菊苣酸统称为三酸)，此三酸也含有邻位无取代的邻二酚羟基，会与硝酸铝发生络合反应，因此对总黄酮检测产生干扰。黄酮类化合物泛指两个苯环通过三个碳原子相互连接而成的一系列化合物的总称，即具有c6-c3-c6结构的一类化合物的总称。从定义来讲，三酸并不属于总黄酮的范围，却能在总黄酮检测中发生显色反应，所以目前蒲公英植物及其提取物使用硝酸铝络合分光光度法检测的为三酸和总黄酮，而并非单独的总黄酮。
4.为了更准确的检测蒲公英植物及其提取物中总黄酮含量，部分研究人员使用高效液相色谱法一一检测黄酮成分，后将结果相加计算出总黄酮含量。但蒲公英植物及其提取物中黄酮复杂，有数十种之多，单纯使用高效液相色谱法检测工作量巨大，耗时极长，不具备大规模检测的基础。
5.因此，蒲公英植物及其提取物中总黄酮急需一种检测准确、操作简便的检测方法。


技术实现要素：

6.本发明目的在于提供一种蒲公英植物及其提取物总黄酮的精准检测方法，通过高效液相色谱法和紫外法联用，极大提高了蒲公英植物及其提取物总黄酮检测的准确性。
7.为实现上述目的，本发明设计了以下方案：
8.步骤一：使用高效液相色谱法检测蒲公英植物及其提取物三酸的含量。
9.步骤二：使用紫外法检测蒲公英植物及其提取物含邻二酚羟基物质的总量。
10.步骤三：通过归一化得出的公式计算蒲公英植物及其提取物总黄酮的实际含量。
11.优选的，步骤一中高效液相色谱法操作为：(1)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈(a)-0.1％磷酸水(b)进行梯度洗脱，梯度洗脱条件如下，0-15min，9％-12％a；15-16min，12％-18％a；16-30min，18％-20％a；30-42min，20％-50％a；42-55min，50％a。检测波长为323nm。流速为1ml/min，
进样量为10μl。(2)对照品溶液的配制：精密称取绿原酸对照品3.0mg、咖啡酸对照品3.0mg、菊苣酸对照品10.0mg置25ml量瓶中，加入80％甲醇溶液20ml超声溶解30min，放冷，加80％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀即得。(3)供试品溶液的配制：取蒲公英药材或提取物适量，精密称定，置50ml量瓶中，加入80％甲醇适量，超声40min，取出，放冷至室温，定容至刻度，混匀，滤过，取续滤液，即得。(4)将对照品溶液和供试品溶液按照色谱条件注入高效液相色谱仪进行分析。
12.优选的，步骤二中，使用的紫外法为硝酸铝络合分光光度法。其操作如下：(1)对照品溶液的配制：芦丁标准品于105℃干燥至恒重，精密称量20mg置于100ml量瓶中，加60％乙醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加60％乙醇至刻度，摇匀备用，即得每1ml含芦丁0.2mg。(2)标准曲线的绘制：精密量取标准品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml，5.0ml，于25ml容量瓶，各加水至6.0ml，加5％亚硝酸钠溶液1.0ml，混匀，放置6分钟，再加10％硝酸铝溶液1.0ml，摇匀，放置6分钟，再加4％氢氧化钠溶液10.0ml，加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，在500nm的波长处测定吸光度，以吸光度(a)为纵坐标，芦丁质量m(mg)为横坐标，绘制标准曲线。(3)供试品总黄酮含量的测定：精密称定供试品样品适量，置50ml容量瓶中，加适量60％乙醇溶液，超声溶解30min，放冷，用60％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，过滤。精密量取续滤液3.0ml,置于25ml容量瓶中，加水至6.0ml，加5％亚硝酸钠溶液1.0ml，摇匀，放置6分钟，再加10％硝酸铝溶液1.0ml，摇匀，放置6分钟，再加4％氢氧化钠溶液10.0ml，加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以不加样品的亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠溶液为空白对照，在500nm的波长处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含芦丁的质量(mg)，即得。
13.优选的，步骤三中的蒲公英植物及其提取物中的总黄酮的实际含量计算方法为：蒲公英植物及其提取物中总黄酮的实际含量等于含邻二酚羟基的物质总量减去1.73倍绿原酸的实际含量，减去3倍咖啡酸的实际含量，再减去2.1倍菊苣酸的实际含量的值。均以芦丁为对照标准品计算。
14.与现有技术相比，本发明优点是：
15.优点1：综合运用高效液相色谱法和紫外法，使得结果既具有高效液相色谱法的准确性，又能同时检测所有的黄酮。
16.优点2：蒲公英植物及其提取物常规检测中需要单独检测总黄酮和绿原酸、咖啡酸和菊苣酸，本发明在此基础上优化，检测量并未大幅增加，但检测结果更加真实，与紫外法相比准确20％-50％。
17.优点3：本发明使用了数据处理中的归一化方法，将所有成分含量均以芦丁为对照标准品计算，简化了计算的过程，便于操作。
附图说明
18.图1为绿原酸在500nm处的标准曲线。
19.图2为咖啡酸在500nm处的标准曲线。
20.图3为菊苣酸在500nm处的标准曲线。
21.图4为芦丁在500nm处的标准曲线。
具体实施方式
22.下面将结合具体实例对本发明做出详细阐述，下述实例不用于限制本发明，只用于说明本发明。本发明范围由所附权利要求书限定。实例中所使用的药材、试剂如无特殊说明均来自于市场购买。
23.实施例1：蒲公英植物及其提取物总黄酮计算公式的归一化处理。
24.精确称取绿原酸对照品11.00mg，使用80％甲醇稀释50倍。分别取1ml、2ml、3ml、4ml、5ml至25ml容量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1.0ml，混匀，放置6分钟，再加10％硝酸铝溶液1.0ml，摇匀，放置6分钟，再加4％氢氧化钠溶液10.0ml，加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，在500nm的波长处测定吸光度，以吸光度(a)为纵坐标，绿原酸质量m(mg)为横坐标，绘制标准曲线。
25.绿原酸在500nm处的标准曲线如说明书附图-图1所示。
26.精确称取咖啡酸对照品10.80mg，使用80％甲醇稀释50倍。分别取1ml、2ml、3ml、4ml、5ml至25ml容量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1.0ml，混匀，放置6分钟，再加10％硝酸铝溶液1.0ml，摇匀，放置6分钟，再加4％氢氧化钠溶液10.0ml，加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，在500nm的波长处测定吸光度，以吸光度(a)为纵坐标，咖啡酸质量m(mg)为横坐标，绘制标准曲线。
27.咖啡酸在500nm处的标准曲线如说明书附图-图2所示。
28.精确称取菊苣酸对照品11.05mg，使用80％甲醇稀释50倍。分别取1ml、2ml、3ml、4ml、5ml至25ml容量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1.0ml，混匀，放置6分钟，再加10％硝酸铝溶液1.0ml摇匀，放置6分钟，再加4％氢氧化钠溶液10.0ml，加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，在500nm的波长处测定吸光度，以吸光度(a)为纵坐标，菊苣酸质量m(mg)为横坐标，绘制标准曲线。
29.菊苣酸在500nm处的标准曲线如说明书附图-图3所示。
30.将芦丁标准品于105℃干燥至恒重，精密量取标准品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml，5.0ml，于25ml容量瓶，各加水至6.0ml，加5％亚硝酸钠溶液1.0ml，混匀，放置6分钟，再加10％硝酸铝溶液1.0ml，摇匀，放置6分钟，再加4％氢氧化钠溶液10.0ml，加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，在500nm的波长处测定吸光度，以吸光度(a)为纵坐标，芦丁质量m(mg)为横坐标，绘制标准曲线。芦丁在500nm处的标准曲线如说明书附图-图4所示。
31.对数据进行归一化处理，在500nm波长下，相同质量的绿原酸、咖啡酸和菊苣酸分别是同质量的芦丁吸光度的1.73倍、3倍和2.1倍。
32.根据上述结果可以得出蒲公英植物及其提取物总黄酮计算公式为ω
总黄酮
＝ω总-(1.73ω
绿原酸
+3ω
咖啡酸
+2.1ω
菊苣酸
)。
33.对上述方法进行重复性检测，其rsd＜2.0％。
34.实施例2：蒲公英药材总黄酮的检测。
35.使用高效液相色谱法检测三酸的含量。(1)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈(a)-0.1％磷酸水(b)进
行梯度洗脱，梯度洗脱条件如下，0-15min，9％-12％a；15-16min，12％-18％a；16-30min，18％-20％a；30-42min，20％-50％a；42-55min，50％a。检测波长为323nm。流速为1ml/min，进样量为10μl。(2)对照品溶液的配制：精密称取绿原酸对照品3.0mg、咖啡酸对照品3.0mg、菊苣酸对照品10.0mg置25ml量瓶中，加入80％甲醇溶液20ml超声溶解30min，放冷，加80％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀即得。(3)供试品溶液的配制：取蒲公英药材(粉碎并过三号筛)0.50g，精密称定，置50ml量瓶中，加入80％甲醇适量，超声40min，取出，放冷至室温，定容至刻度，混匀，滤过，取续滤液，即得。(4)将对照品溶液和供试品溶液按照色谱条件注入高效液相色谱仪进行分析，得出蒲公英植物中绿原酸含量为0.05％，咖啡酸含量为0.01％，菊苣酸含量为0.82％。
36.使用紫外法检测蒲公英植物中总黄酮(含三酸)含量。
37.精密称定蒲公英药材粉末0.5g，置50ml容量瓶中，加适量60％乙醇溶液，超声溶解30min，放冷，用60％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，过滤。精密量取续滤液3.0ml,置于25ml容量瓶中，加水至6.0ml，加5％亚硝酸钠溶液1.0ml，摇匀，放置6分钟，再加10％硝酸铝溶液1.0ml，摇匀，放置6分钟，再加4％氢氧化钠溶液10.0ml，加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以不加样品的亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠溶液为空白对照，在500nm的波长处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含芦丁的质量(mg)，分析计算得出蒲公英植物中总黄酮(含三酸)含量4.04％。
38.代入实施例1中的蒲公英植物及其提取物总黄酮计算公式ω
总黄酮
＝ω总-(1.73ω
绿原酸
+3ω
咖啡酸
+2.1ω
菊苣酸
)。计算可得该蒲公英植物药材中总黄酮实际含量为2.20％。
39.比较得知按照紫外法检测的蒲公英植物中总黄酮含量比按照本发明方法检测的含量高45％。紫外法检测蒲公英植物中的总黄酮严重失真。
40.实施例3：蒲公英提取物中总黄酮的检测。
41.使用高效液相色谱法检测蒲公英提取物中三酸的含量。精密称取蒲公英提取物0.20g，供试品处理方式和检测方法与实施例2中高效液相色谱法相同，分析后可知蒲公英提取物中绿原酸含量为0.07％，咖啡酸含量为0.15％，菊苣酸含量为1.08％。
42.使用紫外法检测蒲公英提取物中总黄酮(含三酸)含量。精密称取蒲公英提取物0.20g，供试品处理方式与实施例2中紫外法相同。经检测计算可知蒲公英提取物中含总黄酮(含三酸)量为10.53。
43.代入实施例1中的蒲公英植物及其提取物总黄酮计算方法。计算可得该蒲公英药材中总黄酮实际含量为7.69％。
44.比较得知按照紫外法检测的蒲公英提取物中总黄酮含量比按照本发明方法检测的含量高27％。紫外法检测蒲公英提取物中的总黄酮与真实总黄酮含量仍有很大差距。
45.本发明通过高效液相色谱法和紫外法联用，排除了蒲公英植物及其提取物中含量极其丰富的三酸对于总黄酮检测结果的干扰，使得检测结果更接近真实含量，有利于促进蒲公英植物及其提取物行业进一步的发展。