一种检测大麻二酚的时间分辨荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于试纸条制备与应用技术领域，具体是一种检测大麻二酚的时间分辨荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用。


背景技术：

2.大麻二酚即cbd，是一种从大麻中提取的植物大麻素，缺乏精神活性，具有镇痛、抗炎、抗肿瘤和化学预防活性。大麻二酚具有阻断某些多酚对人体神经系统的不利影响，并且具有阻断乳腺癌转移、治疗癫痫、抗类风湿关节炎、抗失眠等一系列生理活性功能，对治疗多发性硬化症也有良好的效果。
3.工业大麻是指四氢大麻酚(thc)含量低于0.3%的大麻，是大麻科(cannabaceae)大麻属(cannabis)一年生草本植物。工业大麻花叶提取物大麻二酚（cbd）具有广阔的市场前景， 工业大麻中大麻二酚含量的测定则有助于对工业大麻种植过程中cbd含量的监控以及工业大麻品种的优化。
4.目前常用的大麻二酚检测方法主要是仪器方法，如高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法，采用这些分析方法不仅需要昂贵的仪器和专业的技术人员，样品前处理过程复杂、周期长、成本高，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。基于抗原抗体特异性识别的免疫分析方法可以定性定量检测样品中的大麻二酚含量。
5.时间分辨荧光免疫层析技术采用聚苯乙烯纳米微球对稀土荧光离子进行包裹，通过荧光预增强技术，提升单个荧光离子的荧光强度。通过对包裹技术的优化和改良，包裹完荧光离子后，在微球表面再进行葡聚糖修饰，大大提升了微球的稳定性和对可逆环境的抗干扰性。在此基础上可开发出的荧光定量免疫层析技术灵敏度高于胶体金、有色乳胶和普通荧光免疫层析方法1-3个数量级，稳定性和精密度更好，线性范围更宽。因此，基于时间分辨荧光的免疫层析技术定量试纸条具有高灵敏度、高通量、简单快速的优点。


技术实现要素：

6.本发明的目的正是基于所述现有技术状况而提供一种检测大麻二酚的时间分辨荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法，并提供一种快速、简单、高效的适用于大批量样品的定性检测方法。
7.本发明的试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板；其中：结合物释放垫上喷涂有时间分辨荧光微球标记的大麻二酚单克隆抗体，反应膜上固定有检测线与质控线，检测线包被有大麻二酚半抗原-载体蛋白偶联物，质控线包被有山羊抗小鼠二抗，大麻二酚单克隆抗体是以大麻二酚半抗原与载体蛋白偶联物作为免疫原获得，大麻二酚半抗原由以下方法制备而成：由3,5-二甲氧基苯甲醛与三乙基-4-磷化物反应生成（2e，4e）-5-（3,5-二甲氧基苯基）-2,4-戊二烯酸乙酯，随后经pdc/h2还原，hbr/hoac脱甲基和皂化反应得到5-（3,5-二羟苯基）戊酸，最后再与(1s,4r)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-环己
烯-1-醇反应得到，所述大麻二酚半抗原的结构式如下：具体反应过程参见图4。
8.所述载体蛋白为血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或甲状腺蛋白。
9.所述山羊抗小鼠抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。
10.所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，所述结合物释放垫1/3~1/2被覆盖于样品吸收垫下。
11.所述底板可为pvc底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃纤维或聚酯纤维；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
12.所诉时间分辨荧光微球是直径为100 nm-500 nm的稀土离子作为包埋物的荧光微球，其表面修饰有功能基团，用于蛋白、抗体和核酸的共价偶联。
13.所述时间分辨荧光微球的激发波长为300-400 nm，发射波长为500-700 nm。
14.本发明的一种制备上述检测大麻二酚的试纸条的方法，包括以下步骤：1）制备喷涂时间分辨荧光微球标记的大麻二酚单克隆抗体释放垫；2）制备具有包被有大麻二酚半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有山羊抗小鼠二抗的质控线的反应膜。
15.3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。
16.具体地说，步骤包括：1）半抗原制备：3,5-二甲氧基苯甲醛与三乙基-4-磷化物反应生成（2e，4e）-5-（3,5-二甲氧基苯基）-2,4-戊二烯酸乙酯，随后经pdc/h2还原，hbr/hoac脱甲基和皂化反应得到5-（3,5-二羟苯基）戊酸，最后再与(1s,4r)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇反应得到大麻二酚半抗原；2）将大麻二酚半抗原与载体蛋白偶联，得到大麻二酚半抗原-载体蛋白偶联物；3）用大麻二酚半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和sp2/0骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到大麻二酚杂交瘤细胞株；4）提取小鼠igg免疫健康山羊，得到山羊抗小鼠二抗；5）将步骤3）制备的大麻二酚单克隆抗体与时间分辨荧光微球共价偶联；6）将时间分辨荧光微球标记的大麻二酚单克隆抗体喷涂在结合物释放垫上，37℃烘12h后取出，置于干燥环境中保存备用；8）将大麻二酚半抗原-载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线，将山羊抗小鼠二抗包被在反应膜上构成质控线；9）将样品吸收垫用含0.2%tween20、0.5%pvp k30、0.5%牛血清白蛋白、ph为7.4、
0.02mol/l磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干24h，置于干燥环境中保存备用；10）在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸收垫盖住结合物释放垫，最后切成4mm宽的小条，放入干燥剂，置于铝箔袋中密封，4~30℃条件下可保存12个月。
17.本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测工业大麻中大麻二酚的方法，它包括步骤：（1）将待测样本进行前处理，得到待测样本溶液；（2）用试纸条进行检测；（3）将检测卡插入免疫荧光分析仪，分析仪可通过内置的标准曲线计算出样品中大麻二酚的浓度，分析检测结果。
18.本发明的大麻二酚快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将时间分辨荧光微球大麻二酚抗体固定于结合物释放垫上，样品中的大麻二酚在流动过程中，与结合物释放垫上的时间分辨荧光微球标记的大麻二酚单克隆抗体结合，形成大麻二酚-抗体-时间分辨荧光微球标记物。样本中的大麻二酚与反应膜检测线上的大麻二酚半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合时间分辨荧光微球标记的大麻二酚单克隆抗体，根据检测线与质控线上荧光比值来确定大麻二酚的浓度。
19.本发明与现有技术相比，有如下优点：（1）本发明能够准确定量待测样本中的大麻二酚的含量。
20.（2）本发明采用独立的质控线和检测线的反应系统，互不干扰和影响，并采用t/c值的方式进行标定，保证了测试结果的准确性。
21.（3）本发明采用时间分辨荧光微球，由于其stokes位移大(＞150nm)且荧光寿命比本底物质荧光寿命高5～6个数量级，能够有效地消除各种非特异性荧光的干扰，提高检测的灵敏度。
22.（4）填补了目前尚未有用于检测大麻二酚的时间分辨荧光微球试纸条的空白。
23.（5）本发明采用的的大麻二酚半抗原不仅最大程度上保留了大麻二酚的特征结构，而且与载体蛋白偶联存在合适结构的连接臂，尽可能让大麻二酚特征结构充分暴露于机体，增强免疫效果，提高抗体的特异性，降低与其他大麻二酚类似物的交叉反应；（6）本发明制备的大麻二酚半抗原在原有结构上引入羧基，有利于制备大麻二酚人工抗原；本发明提供的大麻二酚人工抗原具有强的免疫原性，有利于刺激机体完成免疫应答，从而获得高质量的单克隆抗体，为大麻二酚免疫分析方法的建立提供核心试剂。
24.（7）本发明采用的半抗原与待测物大麻二酚的骨架结构重叠度高，有效的提高了大麻二酚人工抗原的免疫原性。半抗原与载体蛋白偶联存在合适结构的连接臂，降低了空间位阻，尽可能让大麻二酚特征结构充分暴露于机体，增强免疫效果，进一步提高抗体亲和力。
25.（8）本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、不受检测设备限制、储存简单、保质期长的优点。
附图说明
26.图1：本发明试纸条测试数值与色谱仪测试结果比较-线性回归图，
图2：本发明的一种检测大麻二酚的试纸条的结构示意图，图中： 1、样品吸收垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、底板；6、检测线；7、质控线。
27.图3：试纸条样品检测结果示意图；图4：大麻二酚半抗原的合成路线图；图5：大麻二酚半抗原核磁共振氢谱；图6：大麻二酚半抗原核磁共振碳谱；图7：大麻二酚完全抗原紫外吸收光谱。
具体实施方式
28.下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内可能会对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰同样应落入发明的保护范围。
29.实施例1 大麻二酚试纸条的制备该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：1）制备喷涂有时间分辨荧光微球标记的大麻二酚单克隆抗体释放垫；2）制备具有包被有大麻二酚半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有山羊抗小鼠二抗的质控线的反应膜。
30.3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。
31.下面分布详细叙述：1、大麻二酚半抗原的制备取氢化钠0.87g（22mmol），加20ml干燥无水的四氢呋喃搅拌形成悬浮液，冰浴下逐滴加入含有5g三乙基-4-磷化物（20mmol）的无水的四氢呋喃50ml，搅拌反应30min。随后逐滴加入含有2.77g 3,5-二甲氧基苯甲醛的无水的四氢呋喃50ml，移除冰浴，并在室温下搅拌反应1h，然后加热到60℃反应1h。tlc确定反应结束后，将反应液冷却至室温，并用120ml水淬灭反应，用120ml乙酸乙酯萃取水相3次，合并有机相，饱和食盐水反萃有机相，无水硫酸钠干燥过夜，旋蒸得到4.0g中间体1。
32.将3.6g中间体1和10% pd-c（0.74g）加入至75ml甲醇中，在室温下加(通)氢气搅拌反应2h，过滤pd-c，将滤液浓缩，得到3.5g淡黄色油状液体（中间体2）。
33.在中间体2中加入50ml 40%氢溴酸，50ml冰醋酸，60℃回流反应4h。tlc确定反应结束后，将反应混合物冷却至室温并添加冰水150ml。反应混合物用150ml乙酸乙酯萃取3次，饱和食盐水反萃有机相，无水硫酸钠干燥过夜，浓缩有机相得到黑色油状粗产物。粗产物通过柱层析（乙酸乙酯/己烷1：2）纯化，得到2.50g中间体3。
34.取1g中间体3（4.75mmol），0.18g p-tsoh（0.95mmol）加入50ml thf：dcm（1：4）混合液中，搅拌混匀，逐滴加入1.08g (1s,4r)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇，室温下搅拌反应30min，tlc确定反应的进程，最后加入50ml乙酸乙酯来终止反应，并用nahco3溶液调节溶液的ph值至3-4，分离有机相，用饱和食盐水洗涤两次，干燥浓缩得到油状粗产物2.3g，经柱层析简单纯化后再制备hplc进一步纯化，得到大麻二酚半抗原220mg。
35.大麻二酚半抗原的1h nmr，
13
c nmr如图5-6所示。
36.2、抗原的制备免疫源的制备：大麻二酚半抗原与牛血清白蛋白偶联得到免疫抗原。
37.取20mg半抗原，edc 23mg，nhs 14mg加入1ml二氧六环溶解完全得到a液，室温搅拌反应4h。取50mg 牛血清白蛋白用5ml 10mm pbs搅拌溶解完全得到b液。将a液逐滴加入至b液中，4℃搅拌反应过夜。反应结束后将蛋白溶液用10mm pbs透析3天，每6h换液一次，得到大麻二酚-牛血清白蛋白偶联物即得免疫抗原cbd-bsa。
38.包被源的制备：大麻二酚半抗原与卵清蛋白偶联得到包被抗原。
39.取10mg半抗原，edc 12mg，nhs 7mg加入1ml无水dmf溶解完全得到a液，室温搅拌反应4h。取20mg 卵清蛋白用5ml 10mm pbs搅拌溶解完全得到b液。将a液逐滴加入至b液中，4℃搅拌反应过夜。反应结束后将蛋白溶液用10mm pbs透析3天，每6h换液一次，得到大麻二酚-卵清蛋白偶联物即得包被抗原cbd-ova。
40.大麻二酚完全抗原的鉴定完全抗原采用紫外光谱法鉴定其偶联结果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。大麻二酚半抗原-载体蛋白的最大吸收峰与大麻二酚半抗原、载体蛋白的最大吸收峰相比发生了明显的变化，表明大麻二酚-载体蛋白的制备是成功的（参见图7）。经计算，半抗原与bsa的偶联比为25：1，与ova的偶联比为16：1。
41.3、大麻二酚单克隆抗体的制备动物免疫：选用6-8周龄的balb/c雌鼠，将免疫抗原与弗氏佐剂混合乳化，按照100ug/只的免疫剂量，使小鼠产生抗血清。
42.细胞融合与亚克隆：取免疫成功的balb/c小鼠脾细胞，将骨髓瘤细胞sp2/0和免疫鼠脾细胞比例调至1:5~1:10的融合，采用竞争elisa法测定细胞培养上清液，筛选出合适的阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
43.单克隆抗体的制备与纯化：选用10~11周龄的balb/c雌鼠，将佐剂注射balb/c小鼠腹腔，每只0.3~0.5ml处理腹腔7~15天左右，将筛选出来的杂交瘤细胞株扩大培养后接种到balb/c小鼠腹腔内。小鼠脱颈椎处死抽取后小鼠腹水，3000rpm离心10min。腹水先用硫酸铵沉淀法初纯后，再用protein g柱纯化得到最终的单克隆抗体。
44.单克隆抗体的效价测定elisa法测定抗体的效价为1：600000。
45.竞争elisa:大麻二酚-ova包被酶标板，加入大麻二酚标准品、大麻二酚单克隆抗体37℃孵育2h后，洗涤，加入hrp标记的羊抗鼠二抗，再次洗涤加入tmb显色液，酸终止反应，在酶标仪上测定450nm处的吸光度值。
46.单克隆抗体特异性测定抗体的特异性是指与相应抗原或近似抗原物质的识别能力。抗体的特异性高，它的识别能力就强。衡量特异性通常以交叉反应率来表示。交叉反应率可用竞争抑制试验测定。以不同浓度抗原和近似抗原分别做竞争抑制曲线，计算各自的结合率，求出各自在 ic50 时的浓度，并按下列公式计算交叉反应率。
47.交叉反应率=按照上式计算，本发明测试了抗体对大麻其他主要成分的交叉反应率：四氢大麻酚（thc）＜1%、大麻环萜酚（cbc）＜1%、大麻酚（cbn）＜1%、大麻萜酚（cbg）＜1%， 本发明抗体对四氢大麻酚（thc）、大麻环萜酚（cbc）、大麻酚（cbn）、大麻萜酚（cbg）基本无交叉反应，说明抗体特异性较好。
48.4、山羊抗小鼠二抗的制备以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到山羊抗小鼠二抗。
49.5、荧光微球标记物的制备取1mg荧光微球15000 rpm离心10 min，收集沉淀，用1ml偶联缓冲液（50mm硼酸ph8.5）重悬沉淀。然后各按1:2-1:20的摩尔比加入edc和nhs，涡旋震荡后室温孵育20-30 min，15000 rpm离心10min，收集沉淀。加入偶联缓冲液（50mm硼酸ph8.5）重悬微球，向该溶液中加入40-150ug 8大麻二酚单克隆抗体，充分混匀后，室温搅拌反应2-4 h，10000 rpm离心10 min去上清，加入1 ml封闭缓冲液，混匀后室温反应1-2h，用封闭缓冲液离心洗涤3次后，用0.02m ph7.4的pbs（含0.1-1% bsa和0.1-5%海藻糖）重悬沉淀，即为制备好的时间分辨荧光微球标记的大麻二酚单克隆抗体，放置于4℃备用。
50.6、时间分辨荧光微球结合物释放垫的制备：将结合物释放垫垫用含0.1-0.5%牛血清白蛋白（质量分数）、ph 7.4的0.01-0.05m tris-hcl（含0.1-5 %的海藻糖和0.01-1 % tween-20）缓冲液浸泡2 h，37℃下烘干2 h备用。用喷膜仪将时间分辨荧光微球标记的大麻二酚单克隆抗体均匀喷涂至结合物释放垫上，每1 cm结合物释放垫喷涂1-9ul荧光微球标记的大麻二酚抗体，37℃干燥1-2h，置于干燥环境中备用。
51.7、反应膜的制备将大麻二酚半抗原-载体蛋白偶联物和山羊抗小鼠二抗分别包被于反应膜上：用0.02m ph7.4的pbs将大麻二酚半抗原-载体蛋白偶联物调节至0.1-2mg/ml，包被在nc膜上形成检测线，包被量为0.5-3ul/cm；用0.01m ph7.4的pbs将山羊抗小鼠二抗调节至0.02-1.0mg/ml，包被在反应膜上形成质控线，包被量为0.5-3ul/cm。将包被好的反应膜置于37℃干燥1-2 h，置于干燥环境中备用。
52.8、样品吸收垫的制备将样品吸收垫用含0.2%tween20、0.5%pvp k30、0.5%牛血清白蛋白、ph为7.4、0.02mol/l磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干24h，置于干燥环境中保存备用。
53.9、试纸条的组装在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸收垫盖住结合物释放垫，最后切成4mm宽的小条，放入干燥剂，置于铝箔袋中密封，4~30℃条件下可保存12个月。
54.实施例2 工业大麻中大麻二酚含量的检测1、大麻二酚标准曲线的建立用样品稀释液配制大麻二酚标准品至终浓度为0、0.05ug/ml、0.10ug/ml、0.25ug/
ml、0.50ug/ml、1.00ug/ml、2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml，取试纸条进行检测，每个样品重复测定五次。将测定的五次重复结果取平均值后，在免疫荧光分析仪上进行标定。
55.2、工业大麻样品大麻二酚含量检测前处理：称取10mg工业大麻样品至5ml研磨管中，加入1ml甲醇，研磨四分钟，静置取上清50ul加入至950ul 复溶液中，充分混匀，取100ul用于分析。
56.用移液器或者小滴管取稀释后的样品液100ul（滴管4-5滴）垂直滴于加样孔中；液体流动时开始计时，层析10min，采用免疫层析分析仪读取检测线和质控线的荧光强度，并给出t/c值，分析仪可通过内置的标准曲线计算出样品中大麻二酚的浓度，并给出检测结果。
57.本发明试纸条测试数据与色谱仪测试结果比较参见图1。
58.工业大麻样本色谱结果与试纸条定量结果如下：