鉴别IgG4相关胰腺炎与胰腺癌的诊断生物标志物及其应用

鉴别igg4相关胰腺炎与胰腺癌的诊断生物标志物及其应用
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及鉴别igg4相关胰腺炎与胰腺癌的诊断生物标志物及其应用。


背景技术：

2.现有技术中，igg4相关疾病(igg4-related disease，igg4-rd)是近年来新被定义的一种由免疫介导的慢性炎症伴纤维化的自身免疫性疾病，主要病理特征为受累组织中以igg4+浆细胞为主的淋巴浆细胞性浸润，常伴有一定程度的纤维化、闭塞性静脉炎和嗜酸性粒细胞增多，大约2/3的患者伴有血清igg4水平升高。该病可累及全身各个部位，单个器官受累的患者少见，多数患者常伴有多器官病变，通过引发受累器官的肿胀和硬化，导致器官功能障碍。igg4-rd根据受累器官不同，可被分为多种亚型，包括igg4相关性胰腺炎(igg4-rp)、igg4相关性硬化性胆管炎、igg4相关性涎腺炎、igg4相关性肾脏疾病等。由于不同器官受累的患者临床表现差异较大，且肿块样病变易被误诊为肿瘤，部分患者确诊前往往需辗转3个以上科室，导致患者接受不必要的治疗，加重了患者的经济负担和医疗资源的浪费。
3.目前，igg4-rd的国际通用诊断标准有2020年igg4-rd修订综合诊断标准(日本)以及2019年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟分类标准。igg4-rd的诊断需要基于患者的临床症状、影像学、病理学以及实验室指标的联合运用。其中，血清igg4是唯一一项被推荐使用的诊断生物标志物。
4.胰腺癌(pancreatic cancer，pc)是恶性肿瘤，患者死亡率极高，而igg4-rp患者预后良好。ca19-9对pc的敏感性为70％-92％，特异性为68％-92％。不过，敏感性与肿瘤大小密切相关。ca19-9水平对小肿瘤的敏感性不高。将igg4-rp误诊为pc会给患者带来巨大心理负担和手术切除等过度医疗措施。igg4-rp也被称为1型自身免疫性胰腺炎，其特征是胰腺在横截面成像上呈“香肠状”肿大。然而，igg4-rp也可表现为局灶性胰腺炎，约占igg4-rp病例的28-41％。由于形成igg4-rp的局灶性肿块和pc的影像学和临床特征经常重叠，因此很难将这两个实体分开，也就不能很好区分是igg4-rp还是pc。
5.约三分之二的igg4-rd患者出现血清igg4水平升高，并且与受累器官的数量相关。然而，血清igg4的升高具有较差的诊断效用，并且在很大程度上是非特异性的，因为它也可能发生在广谱的临床表现相似的疾病(尤其是肿瘤)中。血清igg4水平和ca19-9对igg4-rp和pc的鉴别诊断有一定价值。然而，7-10％的pc患者的血清igg4水平也会升高。此外，ca199在pc患者中可能不会增加，尤其是在一些肿瘤直径较小的pc患者中。
6.因此，新的生物标志物的研发对于鉴别igg4-rp和pc仍有重要临床价值，迫切需要用于igg4-rd诊断和鉴别诊断的生物标志物。


技术实现要素：

7.为了解决上述技术问题，本发明提供用于鉴别igg4相关胰腺炎与胰腺癌的诊断生物标志物及其应用，其解决了现有生物标志物中鉴别igg-rp和pc临床效能的的不足，发掘
用于鉴别诊断igg4-rp与pc的代谢物，达到进一步提升鉴别igg4-rp与pc诊断能力的目的。
8.为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
9.鉴别igg4相关胰腺炎与胰腺癌的诊断生物标志物，其包括d-谷氨酸(d-glutamic acid)和1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
10.鉴别igg4相关胰腺炎与胰腺癌的诊断生物标志物在制备检测试剂中的应用，诊断生物标志物包括d-谷氨酸和1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
11.如上所述的应用，通过检测血液中的d-谷氨酸和1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱的含量来判定是否为igg4相关胰腺炎或胰腺癌。
12.本发明通过大量研究发现，血液中的d-谷氨酸(d-glutamic acid)和1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱的含量在igg4相关胰腺炎患者较高，而在胰腺癌患者中较低。当患者怀疑胰腺癌或者igg4相关胰腺炎时，通过检测这两种代谢物的含量，如果含量升高，则说明可能不是胰腺癌，而是igg4相关胰腺炎。如果血液中这两种代谢物的含量较低，则说明患者可能是患有胰腺癌，而不是igg4相关胰腺炎。
13.如上所述的应用，优选地，将d-谷氨酸和1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱的含量代入计算方程(1)中获得logit(p)值，其中，logit(p)＝-78.997386+0.000726*d-谷氨酸+0.000079*1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1)；再将logit(p)值代入方程(2)中获得p值，(2)，若p≥0.5时，则判断为igg4-rp患者；若p＜0.5，则判断为pc患者。
14.如上所述的应用，采用液相色谱法-质谱联用检测d-谷氨酸(d-glutamic acid)和1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱这两种代谢物的含量。
15.本发明的有益效果在于：
16.本发明提供的用于鉴别igg4相关胰腺炎与胰腺癌的诊断生物标志物，包括d-谷氨酸(d-glutamic acid)和1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱。根据检测其在疑似igg4-rp患者或pc患者血样中的含量，通过逻辑回归方程计算p值来判定igg4-rp与pc，进一步提升鉴别igg4-rp与pc诊断能力，操作方便、实用，具有较好的应用价值。通过本发明的方法进行判断，可有效减轻患者的医疗负担，可减少不必要病理活检检测，并可为患者及临床缩短确诊时间。
附图说明
17.图1为igg4-rp和pc在esi-模式的opls-da图；
18.图2为igg4-rp和pc在esi+模式的opls-da图；
19.图3为igg4-rd和pc之间不同表达代谢物的累积auc；
20.图4为igg4-rd和pc之间每种不同表达代谢物和选定代谢物的重要性评分；
21.图5为igg4-rd和pc之间选定代谢物的roc曲线。
具体实施方式
22.以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
23.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本发明所用试剂均为分析纯或以上规格。
24.实施例1
25.对来自性别和年龄匹配的未经治疗的igg4-rp(n＝33)和pc(n＝33)患者的血浆样本进行非靶向液相色谱-串联质谱代谢组学分析。随机森林机器学习模型用于验证识别的代谢物在两种疾病鉴别诊断中的效能。根据2019年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟分类标准诊断igg4-rp。患有其他自身免疫性疾病、传染病或恶性肿瘤的患者被排除在本研究之外。pc是由病理学家根据组织学检查(切除或胰腺细针抽吸标本)诊断的。
26.将患者的整体血液收集在含有edta抗凝管中。要求每个参与者在样本采集前至少禁食8小时。然后将样品离心15分钟(1500g，4℃)。血浆样品在4℃下解冻，将100μl等分试样与400μl冷甲醇/乙腈(1:1,v/v)混合以去除蛋白质。然后将混合物离心15分钟(14000g，4℃)。在真空离心机中干燥上清液。将样品重新溶解在100μl乙腈/水(1:1，v/v)溶剂中进行液相色谱法-质谱联用(lc-ms)分析。
27.使用uhplc(1290infinitylc，agilenttechnologies，paloalto，ca，usa)与q-tof-ms(tripletof6600，absciex，framingham，ma，usa)进行分析。对于亲水相互作用液相色谱分离，使用2.1-mm
×
100-mmacquiyuplcbeh1.7-μm色谱柱(waters，ireland)分析样品。在电喷雾电离(esi)的正负模式中，流动相含有a＝25mm乙酸铵和25mm氢氧化铵水溶液，b＝乙腈。梯度为85％b1min，11min内线性降低至65％，然后0.1min内降至40％，并保持4min。然后在0.1分钟内增加到85％，再平衡时间为5分钟。
28.对于反相液相色谱分离，使用2.1-mm
×
100-mmacquiyuplchsst31.8-μm色谱柱(waters)。在esi正模式下，流动相包含a＝含有0.1％甲酸的水，b＝含有0.1％甲酸的乙腈。在esi负模式下，流动相含有a＝0.5mm氟化铵水溶液，b＝乙腈。梯度为1％b持续1.5分钟，并在11.5分钟内线性增加到99％并保持3.5分钟。然后在0.1分钟内降至1％，再平衡时间为3.4分钟。梯度流速为0.3ml/min，柱温保持在25℃。注入每个样品的2μl等分试样。esi源条件设置如下：离子源气体1(gas1)为60，离子源气体2(gas2)为60，帘式气体(cur)为30，源温度为600℃，离子喷雾电压浮动为
±
5500v。在仅ms采集中，仪器设置为在60
–
1000的m/z范围内采集da，tofms扫描的累积时间设置为0.20s/光谱。在自动ms/ms采集中，仪器设置为在25
–
1000da的m/z范围内采集，子离子扫描的累积时间设置为0.05s/光谱。产物离子扫描是在高灵敏度模式下使用信息相关采集获得的。参数设置如下：碰撞能量固定在35v，
±
15ev，去簇电位(dp)，60v(+)和-60v(-)，排除4da内的同位素，以及要监测的候选离子每个周期为10。
29.在导入免费提供的xcms软件之前，使用proteowizard msconvert将原始ms数据(wiff.scan文件)转换为mzxml文件。以下参数用于峰选取：centwave m/z＝25ppm，峰宽＝c(10，60)，预滤器＝c(10，100)。对于峰值分组，使用bw＝5、mzwid＝0.025和minfrac＝0.5。metabolite profile annotation的算法集合用于同位素和加合物的注释。在提取的离子特征中，仅保留至少一组中具有》50％的非零测量值的变量。通过将m/z值(《25ppm)和ms/ms谱图的准确性与使用可用的真实标准建立的内部数据库进行比较，对代谢物进行化合物鉴定。
30.质谱代谢物数据经过总和归一化和pareto-scaling后，进行多维统计分析：正交
偏最小二乘判别分析(opls-da)。计算opls-da模型中每个变量的投影(vip)值中的变量重要性以评估其对分类的贡献。进行学生t检验以确定两组独立样本之间差异的显着性。vip》1和p值《0.05用于筛选显着变化的代谢物。在随机森林分析中，使用r包randomforest构建了一千棵树，并进行了10倍交叉验证。这重复了100次。
31.原始数据最初按照7:3分为训练集和测试集。然后，在训练集中，为了减少数据随机性的影响，减少模型的过拟合，对训练集进行了10倍交叉验证。
32.模型建立后，以原始数据的30％作为测试集进行验证。对于每棵树，袋外样本的分类精度是在有和没有变量值的随机排列的情况下确定的。从排列前的预测准确度中减去排列后的预测准确度，然后对森林中的所有树木进行平均以获得重要性分数。重要性分数用于识别生物标志物并去除非信息变量。结果显示，为了表征差异，生成了opls-da图。如图1和图2为在igg4-rp(n＝33，蓝色)和pc(pc，n＝33，红色)之间的esi+和esi-模式opls-da图，opls-da图表所示，igg4-rp与pc患者样本在正负两种离子模式下均已分离。
33.在代谢组学谱中，许多代谢物发生了变化如表1所示。igg4-rp组与pc组有171种代谢物存在显着差异。
34.表1 igg4-rp和pc之间的差异代谢物
35.36.37.38.39.40.41.phosphocholine)。图5使用上述结果中得到的d-谷氨酸(d-glutamic acid)和1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-stearoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)在样本中中进行了验证，样本分为了训练集和测试集，此部分结果表明这两种代谢物在两个数据集中诊断鉴别能力良好(auc＝1)。结果显示联合d-谷氨酸和1-stearoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine可以充分区分igg4-rp和pc(auc＝1)。
44.为了进一步展示这两种代谢物具体联合参与鉴别诊断igg4-rp和pc的过程。本发明对igg4-rp和pc两组中d-谷氨酸(d-glutamic acid)和1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-stearoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)的含量结果(relative abundance)进行了logistic回归分析，建立了计算方程：
45.logit(p)＝-78.997386+0.000726*d-glutamic acid+0.000079*1-stearoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(1)；
46.再根据每个患者样本的logit(p)值，进行以下方程(2)的运算，得到每个患者的p值。
[0047][0048]
在对未经治疗的igg4-rp(n＝33)和pc(n＝33)患者的p值进行诊断效能分析后，结果显示当待测样本的p值最佳截断值大于等于0.5时，即p值大于等于0.5的样本为igg4-rp患者的样本，p值小于0.5的样本为pc患者的样本。两种代谢物鉴别诊断igg4-rp和pc的auc＝1，灵敏度和特异度都为100％。
[0049]
实施例2
[0050]
按实施例1中液相色谱法-质谱联用(lc-ms)分析的方法对igg4-rp与pc患者的血液样本分别进行d-谷氨酸(d-glutamic acid)和1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-stearoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)含量的检测。将测得的含量根据实施例1中建立的模型进行，按计算方程(1)：
[0051]
logit(p)＝-78.997386+0.000726*d-glutamicacid+0.000079*1-stearoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(1)，获得患者样本的logit(p)值，再根据每个患者样本的logit(p)值，进行方程(2)的运算，
[0052]
得到每个患者的p值。根据p值判断患者的类型，若p≥0.5时，则判断该患者为igg4-rp患者；若p＜0.5，该患者为pc患者。
[0053]
结果显示：通过检测d-谷氨酸(d-glutamic acid)，1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-stearoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)的含量，在鉴别诊断igg4-rp与pc时，诊断性能良好，受试者工作特征(roc)结果表明这两种代谢物的曲线下面积(auc)等于1，证实具有优良价值。表明了d-谷氨酸与1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱表现出非常高的诊断能力，能进行临床试剂盒的应用。