一种糖基化磁性类细胞识别受体的制备方法与流程

1.本发明涉及生物医学传感技术和医学检验技术领域，更具体的说是涉及一种糖基化磁性类细胞识别受体的制备方法。


背景技术：

2.抗原检测作为一种可靠性高，便捷易用且成本较低的方法，用于检测多种生物样品中特定抗原。这种基于配体和受体特异性结合的检测方法已广泛应用于生化研究、临床诊断等领域。
3.目前，检测新型冠状病毒(sars-cov-2)及其变异株的主要方法为pcr法。该方法具有耗时较长，专业技能要求较高等弊端。在众多的检测方法中，生物传感器具有快速、灵敏并准确的优点。电化学生物传感器检测具有灵敏度高、操作简单、易于微型化和批量化加工的优点，可以应用于蛋白质、病毒和细菌等的检测。
4.但是，目前筛选优异的选择性识别受体，通过化学或物理方法构建传感界面是发展电学生物传感器的关键技术瓶颈问题。针对sars-cov-2病毒检测鉴别的大部分的生物传感器均需依赖抗体为识别受体，这类生物传感器称为免疫生物传感器。
5.研究表明，s蛋白和宿主受体ace2均具有高水平糖基化的特征。聚糖直接参与和调节病毒对宿主细胞的选择性结合、粘附、侵入以及免疫应答。
6.因此，能否提供一种新型识别受体，即基于糖基化磁性类细胞识别受体(glycosylated and magnetic cell-like recognition receptors，gmcr)，用于电化学传感器构建和sars-cov-2快速超灵敏检测是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供了一种糖基化磁性类细胞识别受体的制备方法。构建基于聚糖和ace2受体双重识别的电化学生物传感器，可以更加特异灵敏度地检测sars-cov-2病毒抗原。为sars-cov-2的快速检测提供了新的策略，为其诊断和监测提供新的可能。
8.该识别受体可选择性捕获新冠病毒表面刺突蛋白(spike protein，s蛋白)或其病毒颗粒。利用糖基化过表达ace2的细胞膜作为壳层，利用fe3o4纳米粒子核层，构建细胞膜包裹的fe3o4纳米粒子。将多糖—肝素修饰在细胞膜表面，构建了肝素和aec2的复合传感界面，用于选择性识别和捕获新冠病毒。由于fe3o4纳米粒子可稳定、大量吸附于磁性电极表面，所以该电化学传感器的构建非常简单，且可通过磁铁的吸引或释放，使得电极可以重复利用。由于肝素和ace2的双重识别，该识别受体捕获新冠病毒s蛋白或病毒颗粒的效率非常高。此方法的建立可为新冠病毒及其它多种病毒相关疾病的高灵敏度电化学抗原分析奠定基础。
9.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
10.一种糖基化磁性类细胞识别受体的制备方法，包括以下步骤：
11.(1)细胞膜修饰叠氮基；
12.(2)细胞膜提取；
13.(3)细胞膜包被fe3o4纳米粒子；
14.(4)二苯并环辛炔胺修饰肝素的合成；
15.(5)糖基化磁性类细胞识别受体的制备。
16.优选的：步骤(1)包括：将上皮细胞用含胎牛血清和青霉素-链霉素的dmem培养液培养；细胞保持在二氧化碳环境中；接种后，加入n-叠氮基乙酰甘露糖胺-四酰化，培养，离心收集细胞，洗涤得到叠氮基修饰的细胞。
17.进一步的，上皮细胞包括：人肾上皮细胞hek-293t细胞系、肠上皮细胞、口腔上皮细胞，即过表达ace2的所有细胞系均可；更进一步的购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司41107es03hek-293t-ace2过表达细胞株；
18.接种：接种于10cm细胞培养板中。
19.优选的：步骤(2)包括：将步骤(1)得到的叠氮基修饰的细胞重新悬浮在低渗裂解缓冲液中，然后对细胞破碎处理，取匀浆溶液离心，收集细胞膜，清洗得到叠氮基修饰的细胞膜，通过bca法对膜蛋白质量进行定量。
20.优选的：步骤(3)包括：将叠氮基修饰的细胞膜与fe3o4纳米粒子混合，然后超声处理，使用脂质体挤出器挤压，得到叠氮基修饰的细胞膜包被的纳米粒子。
21.优选的：步骤(4)包括：将肝素钠盐溶解在4-吗啉乙磺酸缓冲液中，加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺处理，得溶液；然后将dbco-nh2加入二甲基亚砜中，搅拌后滴加到所述溶液中；反应后，得二苯并环辛炔胺修饰肝素，透析纯化。
22.有益效果在于：使得肝素表面羧基得以活化。
23.优选的：步骤(5)包括：将叠氮基修饰的细胞膜包被的纳米粒子加入含二苯并环辛炔胺修饰肝素中，溶剂为1
×
pbs，得混合物，振荡反应后，离心，收集即得糖基化磁性类细胞识别受体。
24.有益效果在于：通过无铜点击化学反应将二苯并环辛炔胺修饰肝素(dbco-肝素)缀合到叠氮基修饰的细胞膜包被的磁性纳米粒子上来制备糖基化磁性类细胞识别受体(gmcr)。
25.优选的：步骤(1)所述胎牛血清含量为10％；青霉素-链霉素含量为1％；所述二氧化碳环境：37℃，浓度为5％；所述n-叠氮基乙酰甘露糖胺-四酰化终浓度50μm；接种的上皮细胞、dmem培养液的体积比为1：20；所述培养时间：72h；所述离心：800
×
g；所述洗涤：ph＝7.41
×
pbs洗涤3次；
26.步骤(2)所述低渗裂解缓冲液ph＝7.5，含有30mm tris-hcl、225mm d-甘露醇、75mm蔗糖、0.2mm乙二醇双(β-氨基乙基醚)-n，n，n
‘
，n
’‑
四乙酸乙二醇酯、蛋白酶和磷酸酶抑制剂；破碎处理：使用探头式超声破碎仪，功率25％～30％，直至溶液清亮；离心：4℃、20k
×
g条件下离心25min，取上清液在100k
×
g、4℃条件下离心35min；所述清洗：用0.2mm乙二胺四乙酸水洗2次；
27.步骤(3)所述fe3o4纳米粒子与叠氮基修饰的细胞膜中的膜蛋白的质量比为1：1；超声处理：频率20％～30％，时间为2～3min；挤压次数为20次，其中，使用的滤过膜孔径为100nm；
28.步骤(4)所述将肝素钠盐、4-吗啉乙磺酸缓冲液、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳
二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺的质量体积比为60mg：1ml：65mg：38.5mg，所述4-吗啉乙磺酸缓冲液：ph＝4.0，50nm；所述处理的时间：30分钟；dbco-nh2加入二甲基亚砜的终浓度：10mg/ml：所述反应时间24h；所述透析：用截留分子量10kd的微型透析杯和2l去离子水透析纯化3d，每12h换水一次；
29.步骤(5)所述1x pbs中叠氮基修饰的细胞膜包被的纳米粒子浓度：5mg/ml；所述叠氮基修饰的细胞膜包被的纳米粒子与二苯并环辛炔胺修饰肝素的的质量体积比：0.5mg：0.1ml；所述振荡反应：将混合物置于摇床50rpm，反应时间2小时；所述离心：20k
×
g，4℃，10min。
30.进一步的，步骤(2)低渗裂解缓冲液购自碧云天生物公司。
31.本发明还提供了一种包括上述任一制备方法制得到的糖基化磁性类细胞识别受体的试剂。
32.优选的：检测新型冠状病毒sars-cov-2及其变异株。
33.有益效果在于：由于fe3o4内核，gmcr很容易吸附在磁性电极表面；若样本中含有s蛋白，便可与gmcr充分结合，所述检测方法：循环伏安法(cv),差分脉冲伏安法(dpv),电化学阻抗法(eis)。
34.优选的：非诊断治疗目的的检测步骤包括：将糖基化磁性类细胞识别受体固定于磁性电极上，然后将样本孵育在电极上，孵育后，洗去未结合的物质；对电极进行检测。
35.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种糖基化磁性类细胞识别受体的制备方法，取得的技术效果为采用fe3o4纳米粒子作为类细胞识别受体的内核，可以使其直接吸附于磁性电极表面；以聚糖修饰的细胞膜为类细胞识别受体的壳层，类细胞识别受体选择性吸附和富集新冠病毒s蛋白或病毒颗粒；
36.提供基于糖基化磁性类细胞识别受体来识别新冠病毒s蛋白或病毒颗粒；
37.在磁性糖基化类细胞识别受体的基础上，将其与电化学检测结合，可以极大极高检测灵敏度，缩短检测时间；
38.利用蛋白结合前后电化学信号的差异针对目标抗原进行直接检测，目标抗原的浓度越高，电化学信号就越明显，即随着目标抗原浓度的升高，糖基化磁性类细胞识别受体作为电化学传感器的识别元件通过表面的肝素和ace2受体对不同浓度的新冠病毒s蛋白抗原进行特异性捕获，使得电极便面的电阻和电流等参数改变，通过测试不同浓度的s蛋白抗原，可以获得良好的检测性能；
39.只需利用便携式电化学工作站，无需复杂的仪器，操作简单，成本较低。
附图说明
40.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
41.图1附图为本发明提供的具有核壳结构的糖基化磁性类细胞识别受体tem图。
42.图2附图为本发明提供的利用spr测量的实验数据图。
43.图3附图为本发明提供的基于未连接肝素的磁性类细胞识别受体与连接了肝素的
磁性类细胞识别受体的电化学传感器对同一浓度的新冠病毒s抗原的响应信号差异(nyquist)图谱。
44.图4附图为本发明提供的标准化电化学阻抗值与孵育时间的关系图。
45.图5附图为本发明提供的不同蛋白测试后的电化学阻抗差异值柱状图。
46.图6附图为本发明提供的不同浓度的s蛋白溶液(1pg/ml，10pg/ml，100pg/ml，1ng/ml，10ng/ml,100ng/ml,1μg/ml)在电极上孵育后的eis nyquist图谱。
47.图7附图为本发明提供的不同浓度的s蛋白溶液(1pg/ml，10pg/ml，100pg/ml，1ng/ml，10ng/ml,100ng/ml，1μg/ml)在电极上孵育后的电阻抗标准化值柱状图及电阻抗与不同浓度的s蛋白的线性关系。
具体实施方式
48.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
49.本发明实施例公开了一种糖基化磁性类细胞识别受体的制备方法。
50.技术原理：通过生物学方法在培养细胞的过程中，在完全培养基中加入n-叠氮基乙酰甘露糖胺-四酰化试剂(dbco)。培养到一定程度后，提取细胞的细胞膜。通过超声和脂质体挤压的方法将细胞膜包被到fe3o4纳米粒子上。将包被好细胞膜的磁性纳米粒子与dbco化的肝素反应，使肝素连接在细胞膜的表面。由于fe3o4纳米粒子具有磁性，可被磁性电极吸附，若样本中含有s蛋白，便可与gmcr充分结合，检测方法：循环伏安法(cv),差分脉冲伏安法(dpv),电化学阻抗法(eis)。
51.实施例中，涉及实验材料为市售渠道获得，未提及的实验方法为常规实验方法，例如低渗裂解缓冲液购自碧云天生物公司，41107es03hek-293t-ace2过表达细胞株购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司，在此不再一一赘述。
52.实施例1
53.一种糖基化磁性类细胞识别受体的制备方法，包括以下步骤：
54.(1)细胞膜修饰叠氮基；
55.(2)细胞膜提取；
56.(3)细胞膜包被fe3o4纳米粒子；
57.(4)二苯并环辛炔胺修饰肝素的合成；
58.(5)糖基化磁性类细胞识别受体的制备。
59.为进一步优化技术方案：步骤(1)包括：将41107es03hek-293t-ace2过表达细胞株用含胎牛血清和青霉素-链霉素的dmem培养液培养；细胞保持在二氧化碳环境中；接种于10cm细胞培养板中，接种后，加入n-叠氮基乙酰甘露糖胺-四酰化，培养，离心收集细胞，洗涤得到叠氮基修饰的细胞。
60.为进一步优化技术方案：步骤(2)包括：包括：将步骤(1)得到的叠氮基修饰的细胞重新悬浮在低渗裂解缓冲液中，然后对细胞破碎处理，取匀浆溶液离心，收集细胞膜，清洗得到叠氮基修饰的细胞膜，通过bca法对膜蛋白质量进行定量。
61.为进一步优化技术方案：步骤(3)包括：将叠氮基修饰的细胞膜与fe3o4纳米粒子混合，然后超声处理，使用脂质体挤出器挤压，得到叠氮基修饰的细胞膜包被的纳米粒子。
62.为进一步优化技术方案：步骤(4)包括：将肝素钠盐溶解在4-吗啉乙磺酸缓冲液中，加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺处理，得溶液；然后将dbco-nh2加入二甲基亚砜中，搅拌后滴加到所述溶液中；反应后，得二苯并环辛炔胺修饰肝素，透析纯化。
63.为进一步优化技术方案：步骤(5)包括：将叠氮基修饰的细胞膜包被的纳米粒子加入含二苯并环辛炔胺修饰肝素中，溶剂为1
×
pbs，得混合物，振荡反应后，离心，收集即得糖基化磁性类细胞识别受体。
64.为进一步优化技术方案：步骤(1)胎牛血清含量为10％；青霉素-链霉素含量为1％；二氧化碳环境：37℃，浓度为5％；n-叠氮基乙酰甘露糖胺-四酰化终浓度50μm；接种的上皮细胞、dmem培养液的体积比为1：20；培养时间：72h；离心：800
×
g；洗涤：ph＝7.41
×
pbs洗涤3次；
65.步骤(2)低渗裂解缓冲液ph＝7.5，含有30mm tris-hcl、225mm d-甘露醇、75mm蔗糖、0.2mm乙二醇双(β-氨基乙基醚)-n，n，n
‘
，n
’‑
四乙酸乙二醇酯、蛋白酶和磷酸酶抑制剂；破碎处理：使用探头式超声破碎仪，功率25％～30％，直至溶液清亮；离心：4℃、20k
×
g条件下离心25min，取上清液在100k
×
g、4℃条件下离心35min；清洗：用0.2mm乙二胺四乙酸水洗2次；
66.步骤(3)fe3o4纳米粒子与叠氮基修饰的细胞膜中的膜蛋白的质量比为1：1；超声处理：频率20％～30％，时间为3min；挤压次数为20次，其中，使用的滤过膜孔径为100nm；
67.步骤(4)将肝素钠盐、4-吗啉乙磺酸缓冲液、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺的质量体积比为60mg：1ml：65mg：38.5mg，4-吗啉乙磺酸缓冲液：ph＝4.0，50nm；处理的时间：30min；dbco-nh2加入二甲基亚砜的终浓度：10mg/ml：反应时间24h；透析：用截留分子量10kd的微型透析杯和2l去离子水透析纯化3d，每12h换水一次；
68.步骤(5)1x pbs中叠氮基修饰的细胞膜包被的纳米粒子浓度：5mg/ml；叠氮基修饰的细胞膜包被的纳米粒子与二苯并环辛炔胺修饰肝素的的质量体积比：0.5mg：0.1ml；振荡反应：将混合物置于摇床50rpm，反应时间2小时；离心：20k
×
g，4℃，10min。
69.利用透射电子显微镜(tem)表征上述实验得到的糖基化磁性类细胞识别受体。
70.结果显示，其具有典型的核壳结构，如图1所示。
71.实施例2
72.一种包括将实施例1制备方法制得到的糖基化磁性类细胞识别受体的试剂，非诊断治疗目的的检测新型冠状病毒sars-cov-2及其变异株。
73.非诊断治疗目的的检测步骤包括：将糖基化磁性类细胞识别受体固定于磁性电极上，然后将样本孵育在电极上，孵育后，洗去未结合的物质；对电极进行检测。
74.对比实验1
75.进行对照试验，说明糖基化磁性类细胞识别受体及其电化学传感器的优势。
76.利用表面等离子体共振仪(spr)检测新冠病毒s抗原蛋白分别与各组纳米粒子的结合亲和力情况。
77.实验组步骤
78.1、用食人鱼溶液清洗金膜10min，用蒸馏水冲洗金膜并用氮气吹干；
79.2、将清洁的金片与11-巯基十一烷酸和6-巯基己醇的混合物以1：20的比例在室温下在黑暗中孵育14小时；
80.3、孵育后，用超纯乙醇和蒸馏水清洗金膜；
81.4、金膜层上的羧基用edc和nhs以1：1的比例活化20分钟；
82.5、用去离子水清洗金片；
83.6、将1μg/ml的s蛋白滴加到金膜表面反应4h；
84.7、用含有磁性纳米粒子的pbs缓冲液以200μl/分钟洗涤通道8～10分钟，建立稳定基线；
85.8、在样品通道中以150μl/min的速度将新冠病毒s抗原蛋白分别与black(空白磁性纳米粒子)、实施例1制备的肝素修饰的过表达ace2细胞膜包被的磁性纳米粒子(nps+overexpress ace2+heparin)、过表达ace2细胞膜包被的磁性纳米粒子(nps+overexpress ace2)，肝素修饰的普通ace2细胞膜包被的磁性纳米粒子(nps+ace2+heparin)和普通ace2细胞膜包被的磁性纳米粒子(nps+ace2)注入通道，获取数据(参见图2)。
86.实验结果表明：连接肝素的过表达ace2受体的细胞膜包被纳米粒子与s蛋白的亲和力最强。过表达ace2受体的细胞膜相对于普通细胞膜与s蛋白有更为明显的亲和力。普通细胞的细胞膜包被纳米粒子与s蛋白也有一定的相互作用，但效果不太明显。肝素连接细胞膜对s蛋白的识别和捕获有良好的的增强作用。
87.对比实验2
88.利用电化学阻抗(eis)检测新冠病毒s抗原蛋白分别与未连接肝素的磁性类细胞识别受体(相较于实施例1，省略步骤二苯并环辛炔胺修饰肝素的合成、糖基化磁性类细胞识别受体的制备两个步骤)和连接肝素的磁性类细胞识别受体(实施例1制备的糖基化磁性类细胞识别受体)的电化学信号改变情况。验证肝素在磁性类细胞识别受体中起到的促进作用。
89.运用三电极体系进行电化学阻抗法(eis)实验，三电极体系中的工作电极、对电极和参比电极分别为磁性电极、铂电极和饱和甘汞电极。
90.1.分别将10μl 0.1g/ml的未连接肝素的磁性类细胞识别受体和连接肝素的磁性类细胞识别受体固定到工作电极表面；
91.2.用去离子水清洗三次；
92.3.利用便携式电化学工作站检测其eis信号，作为空白电极信号；
93.4.再将10pg/μl的s蛋白溶液10μl滴加到磁性电极上，室温孵育20min，使s蛋白与识别受体结合；
94.5.用去离子水清洗三次，洗去未结合的s蛋白；
95.6.利用便携式电化学工作站检测其eis信号，对孵育s蛋白前后的电阻抗信号差异进行比较；
96.未连接肝素的磁性类细胞识别受体与连接了肝素的磁性类细胞识别受体对比，实验结果表明：连接了肝素的磁性类细胞识别受体对s蛋白结合亲和力更强，获得的eis nyquist图谱信号更加明显(参考图3)。
97.对比实验3
98.利用电化学阻抗(eis)检测新冠病毒s抗原蛋与实施例1制备的磁性类细胞识别受体的结合时间不同而导致的电化学信号改变情况。优化得到最短的有效孵育时间。
99.实验组步骤
100.运用三电极体系进行电化学阻抗法(eis)实验，三电极体系中的工作电极、对电极和参比电极分别为磁性电极、铂电极和饱和甘汞电极。
101.1.分别将10μl 0.1g/ml的未连接肝素的磁性类细胞识别受体和连接肝素的磁性类细胞识别受体固定到工作电极表面；
102.2.用去离子水清洗三次；
103.3.利用便携式电化学工作站检测其eis信号，作为空白电极信号；
104.4.再将10pg/μl的s蛋白溶液10μl滴加到磁性电极上，室温下分别孵育20min，使s蛋白与识别受体结合；
105.5.利用便携式电化学工作站检测其eis信号，对孵育s蛋白前后的电阻抗信号差异进行比较，并做柱状图(参考图4)；
106.4.再将10pg/μl的s蛋白溶液10μl滴加到磁性电极上，室温孵育10，20，30，40，50min，使s蛋白与识别受体识别结合；
107.5.用去离子水清洗三次，洗去未结合的s蛋白；
108.6.利用便携式电化学工作站检测其eis信号，对孵育s蛋白前后的电阻抗信号差异进行比较。
109.实验结果表明：在孵育10min时就产生了明显的电化学响应，20min时基本达到了稳定，所以在10min内即可获得明显的信号响应。
110.对比实验4
111.利用电化学阻抗(eis)检测新冠病毒s抗原蛋，a型流感病毒抗原蛋白(iva)，b型流感病毒抗原蛋白(ivb)与磁性类细胞识别受体的结合导致电化学信号改变情况。验证该磁性类细胞识别受体的特异性。
112.实验组步骤
113.运用三电极体系进行电化学阻抗法(eis)实验，三电极体系中的工作电极、对电极和参比电极分别为磁性电极、铂电极和饱和甘汞电极。
114.1.分别将10μl 0.1g/ml的未连接肝素的磁性类细胞识别受体和连接肝素的磁性类细胞识别受体固定到工作电极表面；
115.2.用去离子水清洗三次；
116.3.利用便携式电化学工作站检测其eis信号，作为空白电极信号；
117.4.再分别将10pg/μl的新冠病毒s蛋白溶液、a型流感病毒抗原蛋白溶液，b型流感病毒抗原蛋白溶液10μl滴加到磁性电极上，室温孵育20min，使各种类型的蛋白与识别受体识别结合；
118.5.用去离子水清洗三次，洗去未结合的s蛋白；
119.6.利用便携式电化学工作站检测其eis信号，对孵育s蛋白前后的电阻抗信号差异进行比较；
120.7.通过等效电路拟合eis电荷转移阻抗。通过计算标准化阻值(标准化阻抗值＝
(滴加s蛋白后阻抗值-空白阻抗值)/空白阻抗值)来达到定量的效果。
121.实验结果表明：该磁性类细胞识别受体只对s蛋白有为明显的响应，而对其他两种流感病毒抗原的识别识别能力很低，说明该受体可以有效抵御其他干扰物质的干扰。
122.实施例3
123.检测新型冠状病毒sars-cov-2及其变异株，线性和检测限(参考图6)
124.运用三电极体系进行电化学阻抗法(eis)和差分脉冲伏安法(dpv)实验，三电极体系中的工作电极、对电极和参比电极分别为磁性电极、铂电极和饱和甘汞电极。
125.1.分别将10μl 0.1g/ml的未连接肝素的磁性类细胞识别受体和连接肝素的磁性类细胞识别受体固定到工作电极表面；
126.2.用去离子水清洗三次；
127.3.利用便携式电化学工作站检测其eis信号，作为空白电极信号；
128.4.再将不同浓度的s蛋白溶液(1pg/ml，10pg/ml，100pg/ml，1ng/ml，10ng/ml,100ng/ml，1μg/ml)10μl滴加到磁性电极上，室温孵育20min，使s蛋白与mgcr结合；
129.5.用去离子水清洗三次，洗去未结合的s蛋白；
130.6.利用便携式电化学工作站检测其eis信号，对孵育s蛋白前后的电阻抗信号差异进行比较；
131.7.通过等效电路拟合eis电荷转移阻抗。通过计算标准化阻值(标准化阻抗值＝(滴加s蛋白后阻抗值-空白阻抗值)/空白阻抗值)来达到定量的效果。
132.实验结果表明：在s蛋白浓度在1pg/ml～1ng/ml时，电化学阻抗值值与s蛋白浓度呈线性关系y＝0.3273x-0.0189。检测限为1pg/ml(参考图7)。
133.本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
134.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。