糖蛋白二硫键的鉴定方法与流程

1.本发明涉及医药领域，特别是涉及一种糖蛋白二硫键的鉴定方法。


背景技术：

2.人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hcg)，是一种糖蛋白，由α和β两个亚基组成。两个亚基上各含一簇半胱氨酸结(cystine-knots，主要模式为cys-x-gly-x-cys)。这也增加了二硫键鉴定的复杂性。
3.二硫键的解析方法，包括差异烷基化法和多波长反常散射法(mad)。mad法是通过切除糖修饰后进行适当的还原以及修饰，获得晶体后测定蛋白质的构象，但是其对样品需求量大，并且程序繁多。差异烷基化法，其选择还原剂对蛋白首先进行部分还原，再对打开的半胱氨酸进行封闭，再加强还原条件，用可以与前者相区别的标记试剂对后续打开的二硫键进行修饰。例如mise等人的研究中：首先采用dtt对蛋白进行部分还原，用14c标记的碘乙酸对uhcg进行烷基化。之后，再完全还原，用未加标记的碘乙酸对打开的二硫键进行烷基化。通过edman降解，获得肽段信息，统计每个半胱氨酸位点的同位素标记含量，以标记含量一致的半胱氨酸作为一对二硫键(journal of biological chemistry,1980,255(18):8516-8522；journal of biological chemistry,1981,256(13):6587-6592)。作者用这种方法，鉴定结果与后期的hcg晶体结构研究数据(nature,1994,369(6480),455-461)多有不同，如mise等人报道的α-亚基中含有c10-c32、c28-c60二硫键，而晶体结构研究表明这两对二硫键的连接方式应为：c10-c60、c32-c28。
4.由此可见二硫键鉴定的复杂性，特别是复杂糖蛋白中二硫键的鉴定十分困难。因此，一种准确、简单、高效地鉴定糖蛋白二硫键位点的方法仍然是目前亟待解决的技术难题。


技术实现要素：

5.基于此，本发明的目的是提供一种能解决上述难题，能准确、高效地鉴定糖蛋白中二硫键位点的方法。
6.具体技术方案如下：
7.一种糖蛋白中二硫键的鉴定方法，其包括tcep部分还原后嗜热菌蛋白酶切法，所述tcep部分还原后嗜热菌蛋白酶切法包括以下步骤：
8.(s1)取待测糖蛋白样品，进行变性处理；
9.(s2)用三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(即：tcep)溶液还原后，加入n-乙基马来酰亚胺(即：nem)溶液反应，脱盐；
10.(s3)加入去糖基化酶，脱盐后测定蛋白浓度；
11.(s4)加入嗜热菌蛋白酶(即：thermolysin)；
12.(s5)进行uplc-ms分析。
13.在其中一些实施方式中，所述糖蛋白为人绒促性腺素(即：hcg)。
14.在其中一些实施方式中，步骤(s1)所述变性处理所用试剂包括盐酸胍溶液，所述盐酸胍溶液的ph为(3
±
0.5)，所述盐酸胍溶液的浓度为1-10mol/l。
15.在其中一些实施方式中，步骤(s1)中，所述待测糖蛋白先浓缩后再进行变性处理；所述浓缩为使用超滤离心管进行浓缩。
16.在其中一些实施方式中，步骤(s2)中，所述三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液的浓度为30-50mm，所述三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液还原的条件包括：30-60℃反应10-30min。
17.在其中一些实施方式中，所述步骤(s2)中，所述n-乙基马来酰亚胺溶液反应的条件包括：室温避光反应20-40min。
18.在其中一些实施方式中，所述步骤(s3)中，所述去糖基化酶为deglycosylation mixⅱ；加入去糖基化酶后，室温静置，再升温至35-40℃下20-30小时，脱盐后测定蛋白浓度。
19.在其中一些实施方式中，步骤(s4)中，所述嗜热菌蛋白酶进行酶切的条件包括：60-70℃环境下酶切15-20小时。
20.在其中一些实施方式中，步骤(s5)中的uplc的流动相为：有机相为0.05-0.2wt％甲酸的水溶液；有机相为0.05-0.2wt％甲酸的乙腈溶液；uplc的洗脱梯度为：
21.0-60min：有机相的体积百分比由1-5％上升到35～40％；
22.60-63min：有机相的体积百分比由35～40％上升到98～100％；
23.63-65min：有机相的体积百分比为98～100％；
24.65-68min：有机相的体积百分比由98～100％降低至1-5％；
25.68-72min：有机相的体积百分比为1-5％。
26.本发明还提供另一种糖蛋白中二硫键的鉴定方法，其包括采用tcep部分还原后嗜热菌蛋白酶切法与差异烷基化法；其中，所述tcep部分还原后嗜热菌蛋白酶切法如上文所述；所述差异烷基化法包括以下步骤：
27.(1)样品制备：取待测糖蛋白样品进行变性处理；
28.(2)用三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液进行还原后，再与n-乙基马来酰亚胺溶液反应；
29.(3)脱盐、变性，再酶切除蛋白上的糖修饰，醇沉产物；
30.(4)盐酸胍溶解沉淀，用二硫代苏糖醇溶液还原后与碘乙酰胺溶液反应，再进行uplc-ms分析。
31.在其中一些实施方式中，步骤(1)中，所述变性处理所用试剂包括盐酸胍溶液，进一步所述盐酸胍溶液的浓度为1-10mol/l，所述盐酸胍溶液的ph为3
±
0.5。
32.在其中一些实施方式中，步骤(1)中，所述待测糖蛋白样品先浓缩后再进行变性处理；进一步地，所述浓缩为使用超滤离心管进行浓缩。
33.在其中一些实施方式中，步骤(2)所述三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液的浓度为0.01-1mol/l；所述待测糖蛋白样品与所述三(2-羰基乙基)磷盐酸盐的用量比为0.2mg：(0.001-0.005)mmol。
34.在其中一些实施方式中，步骤(2)所述还原时间为5-65min。
35.在其中一些实施方式中，步骤(2)所述n-乙基马来酰亚胺溶液的浓度为0.2-0.3mol/l，所述待测糖蛋白样品与所述n-乙基马来酰亚胺的用量比为0.2mg：(0.001-0.01)
mmol。
36.在其中一些实施方式中，步骤(2)所述n-乙基马来酰亚胺溶液反应是在室温避光环境下反应20-40min。
37.在其中一些实施方式中，步骤(3)所述脱盐为采用脱盐柱进行脱盐；步骤(3)所述变性包括添加变性裂解缓冲液进行变性。
38.在其中一些实施方式中，步骤(3)所述酶切除蛋白上的糖修饰所用试剂包括：np40、glycobuffer2和pngasef酶；步骤(3)所述酶切除蛋白上的糖修饰的时间为10-20小时。
39.在其中一些实施方式中，步骤(3)所述醇沉包括：用乙醇进行醇沉，静置，离心取沉淀。
40.在其中一些实施方式中，步骤(4)所述二硫代苏糖醇溶液还原的条件包括：30-60℃还原30-60min；所述二硫代苏糖醇溶液的浓度为1mol/l，所述待测糖蛋白样品与所述二硫代苏糖醇的用量比为：0.2mg：(0.002-0.006)mmol。
41.在其中一些实施方式中，步骤(4)碘乙酰胺溶液的浓度为1mol/l，所述糖蛋白样品与所述碘乙酰胺溶液的用量比为：0.2mg：(0.005-0.02)mmol。
42.在其中一些实施方式中，步骤(4)所述碘乙酰胺溶液反应的条件包括：室温避光反应10-40min。
43.在其中一些实施方式中，步骤(4)所述与碘乙酰胺溶液反应后，将反应产物进行脱盐，尿素处理，并用胰蛋白酶酶切，终止反应后进行uplc-ms分析。
44.在其中一些实施方式中，步骤(4)所述uplc-ms分析中，uplc的流动相为：有机相为0.05-0.2wt％甲酸的水溶液；有机相为0.05-0.2wt％甲酸的乙腈溶液。uplc的洗脱梯度条件为：
45.0min：有机相的体积百分比为2-4％；
46.0-26min：有机相的体积百分比由2-4％提高到8-12％；
47.26-30min：有机相的体积百分比由8-12％提高到18-22％；
48.30-60min：有机相的体积百分比由18-22％提高到28-31％；
49.60-70min：有机相的体积百分比由28-31％提高到31.5-34％；
50.70-72min：有机相的体积百分比由31.5-34％提高到98-100％；
51.72-75min：有机相的体积百分比为98-100％；
52.75-77min：有机相的体积百分比由98-100％降低到1-5％；
53.77-80min：有机相的体积百分比为1-5％。
54.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
55.本发明方法提供了一种tcep部分还原后嗜热菌蛋白酶切法，通过选择特定的嗜热菌蛋白酶，其针对hcg糖蛋白酶切位点合适，再结合其他优化条件，最终鉴定了3对二硫键：c9-c57、c23-c72、c26-c110；此外根据ms结果，鉴定到hcg蛋白β亚基同时含有剩余2对二硫键连接的肽段(ic＝agycpt＝lscqc)，其连接方式为c34-c88、c38-c90或c34-c90、c38-c88。
56.另外，本发明方法还通过将tcep部分还原后嗜热菌蛋白酶切法与差异烷基化法结合，其中的差异烷基化法鉴定了4对二硫键：位于α亚基的c7-c31、c59-c87；位于β亚基的c26-c110、c93-c100。最终本发明通过将优化后的差异烷基化法和tcep部分还原后嗜热菌
蛋白酶切法和ms法结合，两种方法高效互补，共鉴定了8对二硫键。
附图说明
57.图1为hcg蛋白的α亚基和β亚基二硫键的理论连接方式；a为hcg蛋白的α亚基二硫键的理论连接方式，b为hcg蛋白的β亚基二硫键的理论连接方式。
58.图2为人绒促性腺素β-亚基的理论二硫键连接方式及嗜热菌蛋白酶切位点。
59.图3为hcg蛋白的1:f1-2-1:f20-21(c9-c57)肽段二级图谱。
60.图4为差异烷基化法测定二硫键配对的原理图。
61.图5为hcg蛋白α亚基各半胱氨酸带nem修饰肽段的百分含量。
62.图6为hcg蛋白的β亚基各半胱氨酸带nem修饰肽段的百分含量。
具体实施方式
63.本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
64.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
65.本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
66.在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
67.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
68.本发明实施例所使用试剂，如无特别说明，则为常规市售产品，或常规方法制备得到。例如本发明的hcg蛋白，只要其氨基酸序列相同，并不限制hcg的来源或制备方法，其可以是尿源hcg或重组hcg。重组hcg例如艾泽或lzm003，或采用常规方法重组得到的重组hcg。
69.实施例1 tcep部分还原后thermolysin酶切法
70.1.1样品处理
71.还原、烷基化：取hcg蛋白(v20180601)1mg，使用3k超滤浓缩管进行浓缩，并置换溶液至ph3的6m盐酸胍溶液中，共置换3次。取54μl(约200μg蛋白)样品，加31μl 6m盐酸胍溶液(ph3)，混匀后，加入还原剂tcep至终浓度为40mm，在40℃水浴20min，另取与上述同样制备的样品一份，在65℃水浴还原30min。冷却，加入72μl的0.25m nem溶液，于室温避光30min进行烷基化。使用脱盐柱(spin-g25 column，ge)置换溶液至超纯水中。
72.切糖：加入10
×
deglycosylation mix buffer1(p6044s，neb)20μl，加入deglycosylation mixⅱ20μl，补加超纯水至终体积为200μl。按上述加样品后，于室温放置30分钟，再转移至37℃水浴孵育24小时。次日，取出，使用50mm tris-hcl溶液置换缓冲液4次(3k超滤浓缩管，每次加入400μl tris-hcl溶液)，测定蛋白浓度。
73.酶切：取40μg样品，加入50mm tris-hcl溶液至终体积为37.5μl，加入2.5μl thermolysin酶(货号，厂家)，于65℃水浴酶切17小时。
74.上样：加入5μl乙腈(含0.1％甲酸)终止反应。12000
×
g离心5min，取上清液，进uplc-ms(q-tof)分析。
75.1.2uplc-ms条件
76.色谱方法：
77.色谱柱：aquity uplc csh c18 1.7μm，2.1
×
150mm(序列号：01323527115721)
78.流动相：a.水+0.1％甲酸；b.乙腈+0.1％甲酸；
79.流速：0.2ml/min；进样量：2μl；柱温：40℃；
80.洗脱梯度：
81.time(min)06063656872％b3％38％100％100％3％3％
82.样品检测前，质谱的质量轴用碘化钠校正(范围：100-2500da)；检测的同时，用亮氨酸脑啡肽(leucine enkephalin，200pg/μl)做实时校正。检测模式：正离子灵敏度模式；锥孔电压(sampling cone)：20.0v；脱溶剂温度(desolvation temperature)：350；锥孔气流(cone gas flow)：50.0l/hr；脱溶剂气体(desolvation gas flow)：600.0l/hr；扫描范围(scan range)：100-2500da；扫描时间：2s；四极杆设置：300、600、900。
83.1.3数据处理
84.使用waters公司的biopharmalynx软件处理实验数据。hcg蛋白的氨基酸序列为基因序列推导得到的理论序列。选择“peptide mapping”模式，方法参数如下：instrument resolution:auto；lock mass for charge 1(da)：556.2771；lock mass tolerance：0.25；ms ion intensity threshold(counts)：100；ms
e ion intensity threshold(counts)：50；retention time range:5.0-26.0min；ms mass tolerance：30ppm；ms
e mass tolerance：30ppm；missed cleavages：2for thermolysin，thermolysin酶切位点：f、v、i、a、m、l-n端。
85.按照β-亚基的理论二硫键的连接方式对序列中的半胱氨酸选择连接(详见图1)，进行检索。软件通过对比相关二硫键连接肽段的精确质量数和碎片离子的理论值和实验值得出鉴定结果。数据经过计算和匹对后，再通过人工比对的方法确认ms/ms图谱质量。
86.1.4结果
87.根据thermolysin酶的理论酶切位点(图2中下划线标识的氨基酸)，β亚基会被酶切形成二硫键肽段。通过软件进行匹配，可检索到4种二硫键肽段和1种三硫键肽段，如图1及表1所示。对鉴定结果进一步通过人工确认，在40℃还原20min中的样品中，可鉴定到c23-c72、c26-c110连接方式。通过进一步加强还原条件，对65℃还原30min的样品进行检索，可检索到c9-c57、c23-c72、c26-c110、c34-c88或c34-c90、c38-c88或c38-c90共五种二硫键配对方式(图2中黄色高亮突出标识的肽段为检测到的二硫键连接肽段)。简述如下：肽段1:f1-2-1:f20-21和1:f2-1:f19-21都指向c9-c57的二硫键配对。以1:f1-2-1:f20-21二级图谱为例(图3)，其中不仅含有组成二硫键的每条肽段的b/y离子(如1b2、2y4)，还含有二硫键肽段的b/y离子碎片，例如1240.56da(1/y3-2/y7)、1636.81da(1/b10-2/b4)，为确认这条二硫键肽段提供了明确的数据支持(见表2)。以同样的方式，我们鉴定到了上述所有含一对二
硫键的肽段。此外，c34-c90、c38-c88(或c38-c88或c38-c90)连接肽段是由三条肽段组成的两条二硫键连接肽段，其二级b/y离子较少，仅检测到1y2离子的存在，所以无法通过二级图谱判断其具体的连接方式。
88.表1经40mm tcep还原后的thermolysin酶切肽段检索结果
[0089][0090][0091]
表2. 1f2-1f19-21(c9-c57)肽段二级b/y离子归属
[0092][0093]
实施例2 tcep部分还原后thermolysin酶切法与差异烷基化法组合鉴定hcg的二硫键
[0094]
2.1 tcep部分还原后thermolysin酶切法
[0095]
同实施例1。
trypsin。检索的必选修饰见下表3所示。软件通过对比相关肽段的精确质量数和碎片离子的理论值和实验值得出鉴定结果。数据经过计算和匹对后，再通过人工比对的方法确认ms/ms图谱质量。
[0110]
表3软件检索添加的修饰
[0111][0112]
2.2.4肽段鉴定
[0113]
使用20mm tcep在ph3的环境中于40℃分别还原样品5min、20min、35min、50min、65min后，使用nem对打开的巯基进行烷基化。之后，通过脱盐以及切糖后的醇沉法，除却了多余的nem试剂。再用dtt完全还原蛋白，通过iam进行烷基化。nem和iam烷基化修饰在质量数上存在差异(nem修饰使肽段质量数增加125.0477da，iam修饰使肽段质量数增加57.0215da)，因此，可以用来区分某一位点的半胱氨酸所带的烷基化修饰类型。
[0114]
通过lc-esi-ms采集上述样品的酶解肽段，应用biopharmalynx 1.3.4软件，检索并匹配酶切肽段。匹配的肽段覆盖了hcg蛋白中的所有半胱氨酸。结合每条肽段的二级(b/y)离子图，对这些半胱氨酸所在的肽段再次进行人工确认(确认烷基化修饰类型及位点)。经鉴定，在α亚基上带部分nem修饰的半胱氨酸有c7、c31、c59、c60、c87，其他半胱氨酸均带cam修饰；在β亚基上带部分nem修饰的半胱氨酸包括c9、c26、c57、c72、c93、c100、c110，其他半胱氨酸均带cam修饰，显示如表4。
[0115]
表4 hcg蛋白部分还原烷基化肽段检索
[0116]
[0117]
[0118][0119]
注：“modifiers”一栏中camc为半胱氨酸经iam烷甲基化产生的修饰(carbamidomethyl c)；deam n为天冬酰胺的脱酰胺修饰(deamidation n)；nem为半胱氨酸经nem修饰引入的烷基化，在表中以下划线标识的红色半胱氨酸表示发生nem修饰的位点，后缀数字表示在序列中的位置。对于一些nem修饰肽段有多个出峰时间，是因为nem作用引入的烷基化会存在空间异构，从而在多个保留时间出峰。
[0120]
2.2.5含量测定
[0121]
根据上述肽段鉴定结果，对各半胱氨酸位点的nem修饰百分含量进行统计：首先汇总肽段的峰面积。然后针对同一半胱氨酸，将其发生nem修饰肽段的峰强度加和，再与这一位点的所有烷基化肽段的峰强度总和作比值。计算公式如下所示，计算结果详见表1-2、5-6所示。理论上，组成同一对二硫键的半胱氨酸在被tcep部分还原后，这两个位点的半胱氨酸所携带的nem烷基化修饰的机会是相同的，引入的nem修饰肽段的百分比应基本一致，其原理详见图4所示，通过这一原理对二硫键进行配对。
[0122]
公式：
[0123][0124]
注：x表示半胱氨酸位点，nem表示nem烷基化引入的修饰；cam表示iam烷基化引入的修饰；nem或cam后的数字表示相应的烷基化修饰肽段的编号，因为同一烷基化修饰可能会引入空间异构体，从而在不同时间出峰，形成两条或多条肽段。
[0125]
经计算，在hcg蛋白的α亚基中，c7、c31、c59、c87-nem修饰含量会随着部分还原时间的延长发生变化，c60-nem修饰肽段的含量较少，约0-3.8％。α亚基上其他位点的半胱氨酸均带cam修饰，说明这些位点在前期的部分还原过程中未被打开。仅c7、c31、c59、c87组成的二硫键较易打开。这四个半胱氨酸带nem修饰的百分含量统计见表3-4，对部分还原时间作图(图5)，从图中可见，在还原的各时间点，c7和c31-nem修饰肽段的百分含量变化趋势基本一致，均明显高于c59和c87-nem修饰含量。如hcg蛋白样品在还原65min时，c7和c31-nem均约30-50％左右，而c59和c87-nem约为20％及以下。说明c7和c31为一对二硫键，c59和c87组成一对二硫键。其鉴定结果与文献报道一致(nature,1994,369(6480),455-461.；structure,1994,2(6):545-558.)。c59和c87-nem修饰在每个时间点的含量以及平行之间的含量稍有差异，推测可能是肽段中的n-糖修饰阻碍了烷基化试剂与半胱氨酸的结合，从而显示出不同的烷基化含量。此外，c7-c31这对二硫键在hcg蛋白中随着还原时间延长打开
的含量要明显高于其他二硫键，说明c7-c31二硫键均是位于hcg蛋白的分子空间的外部，或是在变性后处于暴露的亲水区。这也间接说明了二者的α亚基在空间结构上具有一定的相似性。
[0126]
表5.hcg蛋白α-亚基中各位点半胱氨酸的nem修饰百分含量
[0127][0128]
注：1.还原条件中的数字表示三个平行样品的编号；2.因为51.0min色谱峰为c7-nem和c31-nem肽段的共流出峰，所以，在对c7和c31-nem含量分别进行计算时，都有将这条肽段的峰面积计入；3.*标数据在三个平行样本中相比较出现极低或极高的情况，暂不确定其误差的类型，统计时一并体现在趋势分析图中。
[0129]
经计算，在hcg蛋白的β-亚基中，c26、c93、c100、c110-nem修饰含量会随着部分还原时间的变化而变化，c9、c57、c72-nem修饰肽段的含量较少，在大部分时间点均小于1％，难以被还原打开，且个别时间点如在40℃35min的个别平行样中含量偏高，不具有代表性。此外，β-亚基中的c34、c38、c88、c90组成一个半胱氨酸结(cysteine knot)结构，在部分还原过程中均未被打开，检索结果中这四个半胱氨酸均只带cam修饰，未鉴定到带nem修饰。所以，只取2c26、2c93、2c100、2c110-nem的含量进行分析，将其含量对部分还原时间作图(图6)，从图中可见，在hcg蛋白中，c93和c100-nem修饰肽段的百分含量均要明显高于c26和c110，变化的趋势基本一致，含量基本在25％以上。据此推测c93和c100组成一对二硫键。c26和c110的nem修饰百分含量随时间变化量较少，在65min时，也仅达到约3％-7％左右。所以，推测c26和c110为一对二硫键。综上所述，在hcg蛋白的β亚基中，c93-c100，c26-c110这两对二硫键相较于其他二硫键，被还原时打开的含量相对较高，说明它们可能位于分子结构的外部或是在变性后暴露于外部的亲水区。
[0130]
表6.hcg蛋白β-亚基中各位点半胱氨酸的nem修饰百分含量
[0131][0132]
注：1.还原条件中的数字表示三个平行样品；2.对2c100-nem修饰含量在计算时进行了修正。修正原因为2c100-cam修饰肽段2t11*出峰时间在1.6min左右，此处有较多的盐峰干扰，抑制了肽段的强度，所以，导致峰强度极低，据此计算的2c100-nem修饰含量偏高。而在包含2c100的漏切肽段2t11-12*肽段中，则肽段均是带cam修饰，nem修饰的含量相当于0。所以，考虑将2t11*及其2t11-12*肽段中的2c100-nem百分含量加合后取均值，作为该位点的nem百分含量；3.*标数据在三个平行样本中相比较出现极低或极高的情况，暂不确定其误差的类型，统计时一并体现在趋势分析图中。
[0133]
本发明通过改进的差异烷基化法，对hcg蛋白中的二硫键进行分阶段的还原，并分别使用nem和iam对部分还原和完全还原后的半胱氨酸进行区分标记，经lc-esi-ms采集其酶解肽段，获得了部分半胱氨酸的nem修饰含量，从而量化了二硫键打开的速率，并根据其含量的一致性来确认二硫键的匹配。通过这种方法，已对hcg蛋白中的α-亚基和β-亚基的二硫键进行了确认。在α亚基中，c7和c31为一对二硫键，c59和c87组成一对二硫键；在β亚基中，c26和c110为一对二硫键，c93和c100为一对二硫键。与文献报道一致。其他半胱氨酸因为在本次的部分还原条件中打开的含量极低，随还原时间延长无明显变化，所以未进行匹配。
[0134]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0135]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。