一种含有红花药物制剂的指纹图谱检测方法与流程

1.本发明涉及一种含有红花药物制剂的指纹图谱检测方法，属于中成药质量检测方法领域。


背景技术：

2.本发明所述的红花药物制剂为谷红注射液，该产品是通化谷红制药的独家品种。国家药品监督管理局批准文号为国药准字h22026637(20ml)、h22026582 (5ml)、h22026638(10ml)、其主要由乙酰谷酰胺和中药材红花组配而成配伍组成，本技术人对该产品布局多件专利申请，其申请号为：200310102230.0、200410086213.7，上述专利技术保护主题主要为：该谷红注射液的组方配比、制备工艺等。目前谷红注射液的现行质量标准为ws-11419(zd-1419)-2002，该标准中以羟基红花素a不得少于1.0％山奈素含量不得少于0.050％。但现有的该产品检测方法仅检测两个单一指标成分，却不能满足中药复方提取液中含有众多的有效成分更高的质量标准要求。
3.然而中药指纹图谱技术作为评价与控制中药质量与活性的重要手段之一，是一种可量化鉴定技术，已广泛应用于中药质量控制。中药指纹图谱的建立，它从药材的生产、粗加工、贮存、制剂的原料、中间品、成品、流通样品等各角度和方面，建立全面反映所含药物中有效成分的指纹图谱，通过相似性和相关性对比，更加有效地体现中药成分的复杂性，发现质量变异和缺陷，从而全面、特异地控制中药的质量。
4.又因中国国家药品监督管理局于2000年发布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》。但是指纹图谱主要是针对小分子成分，对于大分子多糖的指纹图谱研究较少，这是由于大多数糖类成分无紫外吸收，分子量大，结构复杂多样的特点决定的。本发明开发了糖类指纹图谱方法，控制药物的安全性和疗效。传统的中药注射剂是复杂混合物，具有生物提取物特征，根据分子量可分为小分子物质和大分子物质。有效成分只可能是小分子物质，而大分子物质必然属于杂质，即使某些大分子具有某些活性，但也不应属于中药的传统功效。中药注射剂的产品质量仍是主要矛盾，且主要与大分子物质有关，严控大分子物质则有可能显著提高中药注射剂的安全性。因此谷红注射液在原有单一成分基础上，建立多指标成分指纹图谱控制模式，进行较全面的质量控制，显得非常有必要。


技术实现要素：

5.本发明提供一种含有红花药物制剂的指纹图谱检测方法，该检测方法在 265nm下，检测标定出27个色谱峰。并指认出：确定16号峰为羟基红花黄色素 a，保留时间适中、分离度好且峰面积较大，又是谷红注射液中的主要有效成分。该指纹图谱检测方法具有检测指标成分全面、操作步骤简便、专属性强、准确性高、重复性和稳定性好的优点。该指纹图谱检测方法可用于本发明药物制剂的内在质量评价。
6.本发明提供的技术方案如下：
7.一种含有红花药物制剂的指纹图谱检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
8.⑴
、供试品溶液的制备：取红花药物制剂，置量瓶中，加10～30％甲醇稀释并定容，混匀，以离心5～15分钟，取上清液，即得；
9.⑵
、对照品溶液的制备：称取羟基红花黄色素a对照品，称定，加10～30％甲醇制成对照品溶液，混匀，离心，取上清液，即得；
10.⑶
、色谱检测条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为 0.08～0.12％甲酸水溶液(a)
–
60～80％乙腈(b)，梯度洗脱比例为：0～12min， 100～96％a；12～20min，96％～82％a；20～30min，82％～81％a；30～43min， 81％～66％a；43～47min，66％～52％(a)；47～56min，52％～0；进样量：1～20 μl；流速：0.3～1.2ml/min；柱温：25～38℃；检测波长：250～300nm；
11.⑷
、指纹图谱构建：分别取步骤
⑴
供试品溶液和步骤
⑵
对照品溶液，按照上述步骤
⑶
色谱条检测件测定，再以步骤
⑴
方法制备多批次供试品溶液，并分别测定记录多批次供试品溶液的hplc色谱图，导入中药指纹图谱相似度评价系统，并进行相似度评价，对指纹图谱数据进行分析，选择中位数法作为对照指纹图谱，计算红花药物制剂与对照指纹图谱之间的相似度。
12.优选的，所述检测方法步骤
⑴
供试品溶液的制备中加甲醇的浓度为20％。
13.优选的，所述检测方法步骤
⑴
供试品溶液的制备中，所述离心时间为：10min。
14.优选的，所述检测方法步骤
⑶
色谱检测条件中，所述色谱柱型号为watersaltantis@t3。优选的，所述检测方法步骤
⑶
色谱检测条件中，所述流动相为0.1％甲酸水溶液(a)
–
70％乙腈(b)。
15.优选的，所述检测方法步骤
⑶
色谱检测条件中，流速：0.9ml/min，柱温： 35℃，检测波长：265nm。
16.优选的，所述检测方法步骤
⑷
中的多批次供试品溶液的指纹图谱相似度≥ 0.90。
17.本发明所述指纹图谱检测方法在含有红花药物制剂质量检测中的应用。
18.本发明所述含有红花药物制剂可以为含有红花提取物的中药组合物，如谷红注射液，红花注射液等药物制剂。
19.在本发明技术指纹图谱研究方案中，本技术的发明人经过大量的试验摸索，终于获得最佳本发明技术方案。
20.本发明检测方法的有益效果表现在：
21.⑴
、本发明建立红花药物制剂指纹图谱检测方法，该检测方法在265nm下标记出27个共有峰，各特征色谱峰分离度好，该检测方法可用于工艺化大生产检验，用于本发明药物制剂全面的质量评价。
22.⑵
、本发明经过大量的优选，获得最佳的流动相色谱条件。其测定本发明药物制剂中27种有效物质成分，经方法验证。
①
、仪器精密度结果表明，供试液中峰面积占总峰面积≥0.5％的色谱峰的相对保留时间rsd小于0.67％，峰面积占总峰面积≥5％的色谱峰的相对峰面积rsd小于0.91％，说明仪器精密度良好；
②
、重复性试验结果表明，供试液中峰面积占总峰面积≥0.5％的色谱峰的相对保留时间rsd小于0.55％，峰面积占总峰面积≥5％的色谱峰的相对峰面积rsd小于1.00％，表明该方法的重现性良好；
③
、稳定性试验结果表明，供试液中峰面积占总峰面积≥0.5％的色谱峰的相对保留时间和峰面积rsd小于0.68％，峰面积占总峰面积≥5％的相对峰面积rsd小于0.80％，表明供试品溶液24h内基本稳定。上述
指纹图谱检测结果表明，该检测方法稳定，可靠，重现性好，能满足本发明药物制剂质量控制要求，为谷红注射液的内在质量控制提供更加科学合理的参考。
23.⑶
、经过12批次的谷红注射液结果可知谷红注射液与生成的对照指纹图谱之间的相似度在0.972～1，因此，本发明药物制剂的相似度均大于0.95，符合质量检测要求。
附图说明
24.此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
25.图1为对照品溶液色谱图(a)，谷红注射液供试品溶液色谱图(b)；
26.图2为12批谷红注射液指纹图谱(r为对照指纹图谱)。
具体实施方式
27.为了更加充分理解本发明的实施，下面列举一个实验例，下面通过典型的实施例对本发明做进一步的说明。
28.实施例1本发明含有红花药物制剂指纹图谱检测方法
29.1仪器与材料
30.1.1仪器
31.agilent 1260高效液相色谱仪(美国agilent公司)；dl720b超声波清洗器； ms105du十万分之一电子天平(瑞士mettler-toledo公司)；me204万分之一电子天平(瑞士mettler-toledo公司)；milli-q超纯水仪(美国millipore公司)； tgl-16c台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。
32.1.2试药
33.谷红注射液(通化谷红制药有限公司)；甲醇、乙腈(均为色谱纯，merck贸易有限公司)；甲酸(色谱纯，roe公司)；超纯水(实验室自制)。
34.谷红注射液样品信息见表1。
35.表1谷红注射液样品信息
[0036][0037]
2实验方法
[0038]
具体实验方法基于红花提取液指纹图谱方法建立。
[0039]
2.1色谱条件
[0040]
色谱柱：waters altantis@t3(4.6
×
250mm，5μm)；流动相：0.1％甲酸水溶液(a)
–
70％乙腈(b)，梯度洗脱程序见表2；进样量：10μl；流速：0.9ml/min；柱温：35℃；检测波长：265nm。
[0041]
表2流动相梯度洗脱程序
[0042]
[0043][0044]
2.2供试品溶液的制备
[0045]
精密量取谷红注射液1ml，置5ml量瓶中，加20％甲醇稀释并定容，以每分钟10000rpm，离心10分钟，取上清液，即得。
[0046]
3谷红注射液指纹图谱方法学研究
[0047]
3.1仪器精密度
[0048]
按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积占总峰面积≥0.5％的色谱峰的保留时间和峰面积占总峰面积≥5％的色谱峰的峰面积，并以16号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间(表3) 和相对峰面积(表4)。结果表明，供试液中峰面积占总峰面积≥0.5％的色谱峰的相对保留时间rsd小于0.67％，峰面积占总峰面积≥5％的色谱峰的相对峰面积 rsd小于0.91％，说明仪器精密度良好。
[0049]
表3谷红注射液供试品溶液的精密度考察结果(相对保留时间)
[0050]
[0051][0052]
表4谷红注射液供试品溶液的精密度考察结果(相对峰面积)
[0053][0054]
3.2重复性试验
[0055]
按照“2.2”项下方法制备供试品溶液6份，按照“2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积占总峰面积≥0.5％的色谱峰的保留时间和峰面积占总峰面积≥5％的色谱峰的峰面积，并以16号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间(表5)和相对峰面积(表6)。结果表明，供试液中峰面积占总峰面积≥0.5％的色谱峰的相对保留时间rsd小于0.55％，峰面积占总峰面积≥5％的色谱峰的相对峰面积rsd 小于1.00％，表明该方法的重现性良好。
[0056]
表5谷红注射液供试品溶液的重复性考察结果(相对保留时间)
[0057]
[0058][0059]
表6谷红注射液供试品溶液的重复性考察结果(相对峰面积)
[0060][0061]
3.3稳定性试验
[0062]
按照“2.2”项下方法制备一份供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件分别于0、 3、6、12、18、24h进样，记录峰面积占总峰面积≥0.5％的色谱峰的保留时间和峰面积占总峰面积≥5％的色谱峰的相对峰面积，并以16号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间(表7)和相对峰面积(表8)。结果表明，供试液中峰面积占总峰面积≥0.5％的色谱峰的相对保留时间和峰面积rsd小于0.68％，峰面积占总峰面积≥5％的相对峰面积rsd小于0.80％，表明供试品溶液24h内基本稳定。
[0063]
表7谷红注射液供试品溶液的稳定性考察结果(相对保留时间)
[0064][0065][0066]
表8谷红注射液供试品溶液的稳定性考察结果(相对峰面积)
[0067][0068]
4谷红注射液指纹图谱构建和相似度分析
[0069]
选取12批谷红注射液hplc色谱图中共有的、稳定性较好且峰面积占总峰面积大于0.5％、分离度较好的色谱峰作为共有峰，共27个(参见色谱图1)。通过与对照品色谱图比对，确定16号峰为羟基红花黄色素a，保留时间适中、分离度好且峰面积较大，又是谷红注射液中的主要有效成分，故选择16号峰作为谷红注射液指纹图谱的参照峰(s峰)。
[0070]
对12批谷红注射液的hplc色谱图进行分析，记录峰面积占总峰面积≥0.5％的色谱峰的保留时间和峰面积占总峰面积≥5％的色谱峰的峰面积，以16号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间(表9)和相对峰面积(表10)。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对指纹图谱数据进行分析，选择中位数法作为对照指纹图谱生成方法，时间窗宽度设为0.1，采用多点校正法对色谱峰进行匹配，得到对照指纹图谱(参见附图2)计算12批谷红注射液与对照指纹图谱之间的相似度(表11)，12批谷红注射液与对照指纹图谱之间的相似度均大于 0.95。由此可见，12批谷红注射液总体相似度较高，说明本实验使用的12批谷红注射液质量较为稳定。
[0071]
表9 12批谷红注射液指纹图谱测定结果(相对保留时间)
[0072]
[0073][0074]
表10 12批谷红注射液指纹图谱测定结果(相对峰面积)
[0075][0076]
表11 12批谷红注射液相似度分析结果
[0077][0078]
最后应说明是：本发明所并不局限于上述具体实施方案，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下，但凡在本发明的精神和实质范围内，所作的任何改变、等同替换和改进，均在本发明的保护范围之内。