孤独症诊断标志物MDSCs及其应用

孤独症诊断标志物mdscs及其应用
技术领域
1.本发明属于医学检验技术领域，具体涉及孤独症诊断标志物mdscs及其应用。


背景技术：

2.孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder,asd)是一种复杂的神经发育障碍(ndd)，出现于幼儿期，临床表现为沟通障碍、社交互动障碍和运动刻板印象等异常行为。asd具有高度异质性，其缺陷和行为的程度可能差异很大，这给准确治疗带来了极大挑战。根据全球疾病负担(gbd)纳入的国家中的流行病学研究估计，世界上有0.76％的儿童患有孤独症。孤独症严重影响学习和社会功能，并可能持续到成年，这对个人、家庭和公共卫生的影响都是巨大的。
3.自1943年孤独症被kanner首次描述以来，人们对孤独症的认识已经有了极大的提升，包括孤独症的环境风险因素、遗传因素、神经生物学、分子病理生理学等，但对于孤独症的明确致病机制尚不清楚。孤独症的诊断标准是基于dsm-5(diagnostic and statistical manual of mental disorders-fifth edition)的行为学诊断。临床工作中有许多结构化的诊断访谈和观察性评估可用于孤独症的早期识别、筛查和诊断，但相较于专家临床医生判断的“金标准”，只有有限的工具经过严格的诊断准确性测试。但工具和培训的费用、完成这些评估所需的时间以及需要大量的培训才能可靠地使用这些工具等因素限制了它们的广泛使用。因此，寻找一种快速、方便地辅助孤独症的方法对于孤独症的早期识别、筛查和诊断具有重要的价值。
4.髓系抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,mdscs)是一群由转录活性，分化状态各异的不成熟髓系细胞(immature myeloid cell，imc)组成的异质性群体。研究证实，mdscs可通过不同机制抑制t细胞、b细胞和nk细胞介导的免疫反应，从而参与调控机体的免疫系统。目前暂无mdscs与孤独症的相关报道。


技术实现要素：

5.基于此，本发明的目的在于提供一种孤独症诊断标志物mdscs及其应用。孤独症患者外周血中mdscs的含量明显升高，可作为辅助孤独症诊断的标志物。
6.实现上述目的的具体技术方案如下。
7.mdscs在制备孤独症检测试剂中的应用。
8.本发明还提供了mdscs在筛选孤独症检测试剂中的应用。
9.本发明还提供了检测mdscs在生物样本中含量的试剂在制备孤独症检测产品中的应用。
10.在一些实施例中，所述试剂为流式细胞术检测试剂。
11.在一些实施例中，所述试剂为流式细胞术检测抗体。
12.在一些实施例中，所述mdscs的流式细胞术分析标记为hla-dr-cd11b
+
。
13.本发明还提供了一种孤独症检测试剂盒，所述试剂盒包含检测mdscs在生物样本
中含量的试剂。
14.在一些实施例中，所述试剂盒包含检测mdscs流式细胞术分析标记的抗体。
15.在一些实施例中，所述试剂盒包含修饰有不同荧光基团的以下抗体：抗hla-dr抗体和抗cd11b抗体。
16.在一些实施例中，所述试剂盒还包括淋巴细胞分离液、红细胞裂解液和pbs缓冲液。
17.本发明经过研究创新性地发现，与健康志愿者相比，孤独症患者外周血中mdscs的含量明显升高，差异具有统计学意义。进一步分析mdscs对孤独症的诊断价值，结果表明，诊断的灵敏度为97.73％，特异性为60％，auc为0.8295。说明mdscs可作为特异性生物标志物用于孤独症的辅助诊断，具有较高的诊断准确性。因此，mdscs可用于制备和/或筛选孤独症检测试剂，检测mdscs在生物样本中含量的试剂即可作为孤独症的检测试剂。
18.本发明首次证实mdscs可作为孤独症的辅助诊断标志物，其检测样本采集方便，检测方法简单、快速，操作者无需经过漫长和专业的培训，只需掌握基本的细胞分析技术即可，具有实用性强和易于推广等优点。
附图说明
19.图1为健康志愿者和孤独症患者外周血中mdscs含量统计分析结果图。
20.图2为mdscs用于诊断孤独症的roc曲线分析图。
具体实施方式
21.本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
22.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
23.本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
24.在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
25.实施例1
26.采集来自44例asd患者新鲜外周血样本，这些患者均满足asd的诊断标准，同时未经历任何药物治疗和行为干预，作为验证组；平行收集34名年龄、性别匹配的健康志愿者(td)新鲜外周血样本作为对照。我们使用流氏细胞术分析样本中mdscs的比例。
27.一、样本信息
28.本研究纳入44例临床确诊的asd患者和34名健康志愿者。所有参与者的相关信息如表1和表2所示：
29.表1人口统计学资料
[0030][0031]
表2相关检查结果
[0032][0033]
二、实验方法
[0034]
1、外周血单个核细胞(pbmc)分离
[0035]
(1)向外周血样本中加入血液3倍体积的pbs溶液，混合均匀获得稀释的血液样本；
[0036]
(2)将与稀释的血液样本等体积的淋巴细胞分离液加入离心管中，然后用吸管将稀释后的血液样本沿着离心管的管壁缓慢地加至淋巴细胞分离液的上层，于18℃下600g(升5，降0)条件下离心25min；
[0037]
(3)离心后可看到白膜层，小心地将中间白膜层吸出放于干净的离心管中，加入10ml预冷的pbs溶液，混匀；室温2000rpm/min离心5min，弃上清，收集细胞沉淀；
[0038]
(4)像细胞沉淀中加入3ml红细胞裂解液(ack)，室温裂解5min后，加入10ml预冷的pbs进行终止裂解；然后室温2000rpm/min离心5min，弃上清，收集细胞沉淀；
[0039]
(5)用pbs重悬细胞沉淀，计数备用。
[0040]
2、流式细胞术染色
[0041]
(1)每个样本取1million的pbmc单细胞悬液加入流式管中，然后加入5ml pbs混匀，2000rpm/min离心5min，弃上清，收集细胞沉淀；
[0042]
(2)取用于分析人mdscs的流式细胞抗体：apc-cyanine7 anti-human hla-dr(tonbo，25-9952-t100)和buv395 mouse anti-human cd11b(bd，563839)，按1:200的比例使用pbs缓冲液对抗体进行稀释得到抗体稀释液(上述2种抗体同时加入同一离心管中进行稀释，得到抗体稀释液)；
[0043]
(3)分别取100μl抗体稀释液加入每个样本对应的流式管中，将流式管置于涡旋振荡器上振荡，充分混匀，然后于4℃冰箱避光染色30min；
[0044]
(4)向流式管中加入4ml预冷的pbs缓冲液，然后于2000rpm/min离心5min，弃上清；加入300μl预冷pbs重悬细胞，然后使用流式分析仪(bd canto ii，usa)进行上机检测，获取数据，并用flowjo10软件进行分析。
[0045]
3、统计学分析
[0046]
利用graphpad 9.2.0计算各组数据中位数和计算p值，以p＜0.05视为差异具有统计学意义。
[0047]
三、实验结果
[0048]
对所有的样本进行分析，得到各外周血样本中mdscs的比例，并对健康志愿者(tds)和孤独症患者(asd)外周血中mdscs的比例进行统计分析，结果如图1所示，与健康志愿者相比，孤独症患者外周血中mdscs的比例显著上调，差异具有统计学意义，提示mdscs可作为孤独症潜在的诊断标志物。
[0049]
进一步进行roc曲线分析，结果显示(图2)，mdscs在用于孤独症诊断时，auc为0.829，灵敏度为97.73％，特异性为60％，具有较高的诊断准确性。
[0050]
综上所述，本发明首次证实mdscs可作为孤独症的辅助诊断标志物，其检测样本采集方便，检测方法简单、快速，操作者无需经过漫长和专业的培训，只需掌握基本的细胞分析技术即可，具有实用性强和易于推广等优点。
[0051]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0052]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。