用于微流控荧光免疫检测的组合物、芯片及其制备方法与流程

1.本发明涉及一种用于微流控荧光免疫检测的组合物、芯片及其制备方法，属于微流控荧光免疫检测技术领域。


背景技术：

2.免疫诊断是应用免疫学的理论、技术和方法诊断疾病和测定免疫状态，是确定疾病的病因和病变部位，机体免疫状态是否正常的重要方法。免疫诊断广泛应用于医院、血站、体检中心，主要用于心肌疾病、肿瘤、传染病等检测，在现代医学领域发挥越来越大的作用。微流控荧光免疫检测技术是一种新型的快速诊断技术，其原理是将特异性的抗原或者抗体先固定于微流控通道中，将特异性抗体与荧光物质连接的复合物干燥于反应区，再配备滤血膜以及上盖，焊接制备成微流控检测芯片，后续检测时，样本流经反应区将荧光抗体冲刷下来，流至微流控通道中的包被位点进行特异性反应，最后通过测定包被位点的荧光强度并通过线性曲线，计算出待测物质的浓度，从而实现疾病的快速诊断。制作微流控荧光免疫检测芯片时，需要将荧光抗体干燥固定于微流控芯片反应区固相表面，在后续使用时，随着样本或者缓冲液流过，荧光抗体释放出来，以此来检测对应抗原。若荧光抗体直接与微流控芯片固相表面直接接触，由于微流控芯片一般是大分子有机物制成，会吸附蛋白物质，且在静电吸附、疏水作用力的作用下，荧光抗体很容易大量吸附在微流控芯片固相表面上，样本难以将其带入检测位点，进行免疫识别反应，从而影响检测结果的准确性；后续使用时，还容易引起荧光抗体现释放不充分、不均匀，使检测位点出现荧光不均匀等问题，影响检测结果；同时还会引起荧光抗体团聚等问题。这些问题，也是一直困扰微流控荧光免疫检测产品开发的技术难题。


技术实现要素：

3.本发明是提供一种用于微流控荧光免疫检测的组合物，可使得荧光抗体在进行荧光免疫检测时，均匀充分地释放，同时避免荧光抗体的团聚。
4.为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种用于微流控荧光免疫检测的组合物，包含质量浓度百分比为0.5％～5％的牛血清白蛋白、0.2％～5％的聚乙烯吡咯烷酮、0.5％～12％的糖类、0.05％～0.5％的吐温20以及缓冲液。
5.优选地，所述糖类为浓度百分比为0.5％～6％蔗糖和0.5％～6％海藻糖的混合溶液。
6.优选地，包含质量浓度百分比为1％的牛血清白蛋白、1％的聚乙烯吡咯烷酮、0.5％的蔗糖、2％的海藻糖和0.05％的吐温20。
7.优选地，所述缓冲液包括tris-hcl缓冲液或taps缓冲液，浓度为20～50mm。
8.一种用于微流控荧光免疫检测的组合物的制备方法，包括以下步骤：步骤一，按照权利要求1中所述质量浓度百分比，称取对应重量的牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和糖类加入缓冲液后溶解；步骤二，称取吐温20加入至步骤一的溶液后，再次搅拌溶解。
9.一种用于微流控荧光免疫检测的芯片，包含上述的组合物。
10.一种用于微流控荧光免疫检测的芯片的制备方法，包括以下步骤：将上述制备好的组合物加入芯片的反应区；待所述组合物干燥后，再将荧光抗体添加至已干燥的组合物上。
11.优选地，每片芯片上所述组合物的使用量为0.5μl～5μl。
12.优选地，采用点样仪将制备好的组合物加入芯片的反应区；采用点样仪/移液器将荧光抗体添加至已干燥的组合物上。
13.优选地，所述组合物的干燥方法包括晾干、烘干、风干或冻干，其中，烘干温度可为37℃，自然晾干、风干的时间为15min～30min。根据糖含量不同晾干时间不同，糖含量越高晾干时间越长。
14.本发明的组合物，可使得荧光抗体在进行荧光免疫检测时，均匀充分地释放，同时避免荧光抗体的团聚。由于其制备过程简单，原料来源简单，便于在免疫诊断中广泛地应用。
15.本发明的芯片其反应区荧光抗体形状规整，芯片间差异小。组合物中的蛋白物质能够有效封闭微流控芯片上的有机大分子位点(因所述位点与组合物中的蛋白物质之间具有静电吸附和疏水作用力)，从而避免了荧光抗体与芯片表面发生吸附，有效降低荧光抗体残留率，使得抗原的检测结果更加准确。
附图说明
16.图1为本发明实施例提供的一种用于微流控荧光免疫检测的芯片的结构示意图；
17.图2为本发明实施例1至6中反应区荧光抗体残留的结果，(a)为实施例1中反应区荧光抗体残留的结果；(b)为实施例2中反应区荧光抗体残留的结果；(c)为实施例3中反应区荧光抗体残留的结果；(d)为实施例4中反应区荧光抗体残留的结果；(e)为实施例5中反应区荧光抗体残留的结果；(f)为实施例6中反应区荧光抗体残留的结果；
18.图3为本发明对照组中反应区荧光抗体残留的结果。
19.其中，1-干燥后的组合物，2-荧光抗体。
具体实施方式
20.为了更好的理解本发明的实质，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的阐述。
21.本发提供的一种用于微流控荧光免疫检测的组合物，其组分包括：牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、糖类、吐温20以及缓冲液。其中牛血清白蛋白(bsa)的质量浓度百分比为0.5％～5％，聚乙烯吡咯烷酮(pvp)的质量浓度百分比为0.2％～5％，吐温20的质量浓度百分比为0.05％～0.5％，糖类的质量浓度百分比为0.5％～12％。
22.糖类可为蔗糖与海藻糖混合溶液，其中，蔗糖的质量浓度百分比为0.5％～6％，海藻糖的质量浓度百分比为0.5％～6％。缓冲液包括tris-hcl缓冲液或taps缓冲液，配制浓度一般为20～50mm。
23.牛血清白蛋白在质量浓度百分比为0.5％～5％时有一定成膜性，起到固形作用，且为惰性蛋白，能够起到封闭位点，消除非特异性吸附的作用。牛血清白蛋白用量过低，成
膜性差；过高导致体系粘稠，不利于溶解。
24.聚乙烯吡咯烷酮作为高分子量的分散剂和助溶剂，其大分子骨架能够有助于荧光抗体与样本反应过程中均匀分散；该物质极易溶于水，能够帮助荧光抗体在样本中溶解。聚乙烯吡咯烷酮用量过低，起不到助溶和分散的作用；过高，会影响牛血清白蛋白的成膜性。
25.糖类物质作为热稳定剂，能够保护抗原抗体活性，在一定浓度范围内，能够起到增加免疫反应特异性的作用。糖类物质含量过低，起不到保护体系中生物大分子的作用，含量过高，会增大体系黏度，影响流动性。
26.吐温20作为表面活性剂，能够改善流动性，具有辅助分散性和流动性的作用。吐温20含量过低，起不到改善流动性的作用；过高，会导致样本流动速度太快，或者延边流动现象，影响荧光抗体的均一释放，且吐温20浓度过了高，会影响反应灵敏度。
27.通过本发明所得到的组合物具有阻断吸附、可固形和可水溶的特点。因为其溶解性，能够保证荧光抗体在样本冲刷过程中，均匀释放，且充分分散荧光抗体避免荧光抗体团聚。
28.本发明中实施例所采用的各组分百分比如表1所示：
29.表1
30.成分实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5实施例6bsa0.5％0.5％1％1％0.5％5％pvp1％5％1％5％0.5％5％海藻糖1％2％2％6％0.5％6％蔗糖0.5％2％0.5％2％0.5％6％吐温200.05％0.1％0.05％0.1％0.05％0.5％
31.实施例1
32.一种用于微流控荧光免疫检测的组合物的制备方法，包括以下步骤：
33.步骤一，按照表1中的比例，称取0.5g的bsa、1.0g的pvp、1.0g的海藻糖、0.5g的蔗糖于250ml的烧杯中。烧杯内加入100ml的20mm的tris-hcl缓冲液后放于磁力搅拌器上，搅拌溶解10min后取下。
34.步骤二，称取0.050g的吐温20加入至步骤一的烧杯溶液后，将烧杯放于磁力搅拌器上，再次搅拌溶解5min后得到本发明所述用于微流控荧光免疫检测的组合物1。
35.实施例2
36.按照实施1中的制备步骤，制备组合物2。与实施例1的区别在于，称取0.5g的bsa、5.0g的pvp、2.0g的海藻糖、2.0g的蔗糖、0.10g的吐温20。
37.实施例3
38.按照实施1中的制备步骤，制备组合物3。与实施例1的区别在于，称取1.0g的bsa、1.0g的pvp、2.0g的海藻糖、0.5g的蔗糖、0.05g的吐温20。
39.实施例4
40.按照实施1中的制备步骤，制备组合物4。与实施例1的区别在于，称取1.0g的bsa、5.0g的pvp、6.0g的海藻糖、2.0g的蔗糖、0.10g的吐温20。
41.实施例5
42.按照实施1中的制备步骤，制备组合物5。与实施例1的区别在于，称取0.5g的bsa、
0.5g的pvp、0.5g的海藻糖、0.5g的蔗糖、0.05g的吐温20。
43.实施例6
44.按照实施1中的制备步骤，制备组合物6。与实施例1的区别在于，称取5.0g的bsa、5.0g的pvp、6.0g的海藻糖、6.0g的蔗糖、0.50g的吐温20。
45.实施例7
46.一种用于微流控荧光免疫检测的芯片，包含上述的组合物，其制备方法，包括以下步骤：
47.步骤1，将组合物通过点样仪点加于芯片反应区后，37℃烘箱晾干。其中组合物的使用量：每片芯片用量为0.5μl-5μl；
48.步骤2，通过点样仪将荧光抗体点加在已完成步骤1的芯片上的反应区内，37℃烘箱晾干，此时点加的荧光抗体会固形干燥。组合物中的蛋白物质能够有效封闭微流控芯片上的有机大分子位点(因所述位点与组合物中的蛋白物质之间具有静电吸附和疏水作用力)，从而避免了荧光抗体与芯片表面发生吸附，有效降低荧光抗体残留率，
49.步骤3，采用点样仪将包被抗体点加在芯片的检测区后对芯片装膜封片即可。
50.采用点样仪均匀点加可保证成品干燥后形状规整、厚度均匀，以便样本均匀冲刷荧光抗体。组合物的干燥方法包括晾干、烘干、风干或冻干，干燥时长为15min～30min。
51.实施例8
52.采用上述实施例中的组合物，分别对其制得的芯片进行荧光抗体残留检测：使用点样仪将预先制备好的组合物按4*6*8*10*12程序分别点加于芯片的反应区上，形成梯形状如图1所示，每滴0.06μl，每片总共2.4μl，将上述芯片放于37度烘箱中干燥15min，然后各加入2μl浓度为0.2％的荧光抗体，放于37度烘箱中干燥15min，配备滤血膜和上盖后进行焊片。在制备好的芯片上加入280μl样本，15min后于荧光显微镜上进行拍照，记录反应区荧光抗体残留情况，结果如表2所示。
53.表2荧光抗体残留率
[0054][0055]
糖和蛋白的浓度越高越，点样难度越大；而pvp含量、吐温含量越高，分散性越好，点样难度降低。同时糖含量还会影响检测重复性cv，糖含量越高，检测重复性cv降低。
[0056]
由表2和图2、图3的结果可知，在采用实施例1-6所制备的组合物制作检测芯片，可大大降低芯片上荧光抗体残留率，也就是说本发明中的组合物可使得荧光抗体均匀充分地释放，同时避免了荧光抗体的团聚，从而提高抗原检测的准确性。
[0057]
以上仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在申请待批的本发明的权利要求范围之内。