一种佛手外果皮和内果皮的HPLC指纹图谱构建方法及其指标成分含量的测定方法与流程

本发明涉及药物分析，具体为一种佛手外果皮和内果皮的hplc指纹图谱构建方法及其指标成分含量的测定方法。

背景技术：

1、佛手为芸香科植物佛手(citrus medica l.var.sarco-dactylis swingle)的干燥果实，具有疏肝理气、和胃止痛等功效，主治用于胃脘痞满、胸胁胀痛、食少呕吐、咳嗽痰多等症。《中国药典》2020年版规定佛手在秋季果实尚未变黄或变黄时采收。据文献报道，以四川和广东的佛手种植面积广，产量高。川佛手因为产量大、质量好，在国内外市场畅销，形成了川佛手道地品牌，作为四川道地中药材和药食同源的传统名药材，具有较大的经济价值。

2、指纹图谱在中药质量评价中被广泛地应用，可充分地体现中药中各成分分布的状况。目前现有技术大都采用指纹图谱的方法评价佛手的成分及含量，但对佛手的外果皮和内果皮的化学成分及含量之间的差异，还未见有报道。

技术实现思路

1、本发明为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种佛手外果皮和内果皮的hplc指纹图谱构建方法及其指标成分含量的测定方法，对比分析了佛手的外果皮和内果皮的化学成分与含量，以找出外果皮和内果皮的化学成分与含量的区别，同时对佛手的外果皮6种成分和内果皮的2种成分进行含量测定，为佛手资源的充分开发利用提供技术支撑，为完善佛手的质量评价提供科学依据。

2、为实现上述目的，采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种佛手外果皮和内果皮的hplc指纹图谱构建方法，包括以下步骤：

4、制备混合对照品储备液：

5、分别称取东莨菪内酯、滨蒿内酯、橙皮苷、香叶木苷、5，7-二甲氧基香豆素、佛手苷内酯的对照品，加甲醇溶解，得到东莨菪内酯、滨蒿内酯、橙皮苷、香叶木苷、5，7-二甲氧基香豆素、佛手苷内酯的对照品溶液；将所述各对照品溶液混合后用甲醇稀释，得到混合对照品储备液；

6、制备供试品：

7、取烘干后的佛手外果皮和内果皮适量，加入甲醇回流，放冷，用甲醇补足减少的重量，摇匀，过滤，即得；

8、制备阴性对照溶液：

9、按所述制备供试品的方法制备不含佛手外果皮和内果皮的阴性对照溶液；

10、佛手外果皮和内果皮的hplc指纹图谱的测定：

11、分别精密吸取混合对照品储备液、供试品、阴性对照溶液，用hplc进行检测，得到佛手外果皮和内果皮的hplc指纹图谱，将得到的指纹图谱导入相似度评价系统软件进行相似度评价；其中，hplc条件为：c18色谱柱；流动相为甲醇-乙酸铵；梯度洗脱；检测波长：320nm。

12、优选的，在所述制备混合对照品储备液的过程中，各对照品溶液的浓度分别为：东莨菪内酯对照品0.4649mg/ml、滨蒿内酯对照品0.4190mg/ml、橙皮苷对照品0.5218mg/ml、香叶木苷对照品0.5057mg/ml、5，7-二甲氧基香豆素对照品0.4677mg/ml、佛手苷内酯对照品0.1706mg/ml；

13、在得到的所述混合对照品储备液中，东莨菪内酯14.8768μg/ml、滨蒿内酯对照品13.4096μg/ml、橙皮苷对照品166.976μg/ml、香叶木苷对照品161.8176μg/ml、5，7-二甲氧基香豆素对照品149.6496μg/ml、佛手苷内酯对照品6.8241μg/ml。

14、具体地，所述混合对照品储备液的配制过程为：依次精密吸取所述对照品溶液0.8ml、0.8ml、8.0ml、8.0ml、8.0ml、1.0ml，置同一25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得混合对照品储备液。

15、优选的，所述制备供试品的具体过程为：取鲜佛手并将其外果皮和内果皮分离，于烘箱中60℃烘至水分低于10.0％，分别取外果皮和内果皮各0.5g，粉碎成50目，精密称定，置100ml锥形瓶中，精密加入25ml甲醇，回流1小时，放冷，用甲醇补足减少的重量，摇匀，过滤，即得。按照同样方法制备不含供试品的阴性对照溶液。

16、优选的，所述hplc条件为：

17、色谱柱为kromasil 100-5-c18，4.6×250mm，5μm；流动相a为甲醇，流动相b为0.1mol/l乙酸铵；梯度洗脱为：0～60min，5％a→90％a；60～62min，90％a→5％a；62～68min，5％a；检测波长：284nm、320nm、350nm；流速：1ml·min-1；柱温：30℃～40℃；进样量：10μl。

18、第二方面，本发明提供一种上述佛手外果皮和内果皮的hplc指纹图谱构建方法所构建的指纹图谱：所述佛手外果皮的指纹图谱标定了18个共有峰，所述佛手内果皮的指纹图谱标定了8个共有峰；佛手外果皮中同时指认了6个峰，其中峰8、11、13、14、15、16分别为东莨菪内酯、滨蒿内酯、橙皮苷、香叶木苷、5，7-二甲氧基香豆素、佛手苷内酯；佛手内果皮中同时指认了8个共有峰，其中峰6、7分别为橙皮苷、香叶木苷；外果皮色谱图中的峰1、5、13、14为外果皮和内果皮的共有峰。

19、具体地，佛手外果皮中5,7-二甲氧基香豆素的含量最高，佛手内果皮中橙皮苷含量最高；外果皮与内果皮的相似度为0.10～0.35。

20、为进一步比较佛手的外果皮与内果皮化学成分含量的变化，本发明在建立的指纹图谱基础上对佛手的外果皮与内果皮中的指标性成分进行含量测定：

21、第三方面，本发明提供一种佛手外果皮和内果皮的指标成分含量的测定方法，包括以下步骤：

22、根据所述的佛手外果皮和内果皮的hplc指纹图谱构建方法，对混合对照品储备液、供试品、阴性对照溶液中的东莨菪内酯、滨蒿内酯、橙皮苷、香叶木苷、5，7-二甲氧基香豆素、佛手苷内酯等6个指标性成分进行hplc测定，以外标法计算所述6个指标性成分在佛手外果皮和内果皮中的含量。

23、具体地，将混合对照品储备液过程中得到的各对照品溶液，加甲醇稀释成不同浓度，在所述色谱条件下进样测定，以溶液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，分别建立6个指标成分东莨菪内酯、滨蒿内酯、橙皮苷、香叶木苷、5，7-二甲氧基香豆素、佛手苷内酯的标准曲线，得到线性回归方程；根据所述供试品的hplc色谱图中所述6个指标成分的峰面积，以及所述线性回归方程计算得到所述6个指标成分的含量。

24、优选的，所述含量测定中，选择284nm作为橙皮苷的检测波长；320nm作为5，7-二甲氧基香豆素、佛手苷内酯的检测波长；350nm作为东莨菪内酯、滨蒿内酯、香叶木苷的检测波长。

25、本发明的有益效果是：

26、本发明首先通过分别建立佛手外果皮与内果皮的hplc指纹图谱，并将色谱峰数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版)》，得到相似度计算结果，结果显示乐山市内的佛手的外果皮与内果皮与各自的对照图谱相似度均大于0.90，表明乐山本地区不同批次间相似度较好，而外省佛手的外果皮对照图谱相似度除云南地区的偏低外，福建与肇庆的都在0.90以上；外省佛手的内果皮对照图谱相似度除肇庆地区的偏低外，福建与云南的都在0.90以上。由于本研究选取的外省佛手样本量低，也不能很好地反应当地佛手的质量。从佛手的外果皮与内果皮的对照指纹图谱可知，佛手的外果皮的图谱标定的色谱峰数目较多，包含内果皮中标定的4个峰，更直观表明外果皮与内果皮所含化学成分种类及含量的不一致。

27、本发明在研究过程中发现，在波长320nm条件下，色谱峰较多，各峰吸收值良好，故选择320nm作为指纹图谱的检测波长。多成分含量测定要求检测波长为最大吸收波长，波长为284nm时，橙皮苷有最大吸收；波长为320nm时，5,7--二甲氧基香豆素、佛手苷内酯吸收最大；波长为350nm时，东莨菪内酯、滨蒿内酯、香叶木苷吸收最大；所以含量测定中选择284nm作为橙皮苷的检测波长；320nm作为5，7-二甲氧基香豆素、佛手苷内酯的检测波长；350nm作为东莨菪内酯、滨蒿内酯、香叶木苷的检测波长。

28、为进一步比较佛手的外果皮与内果皮化学成分含量的变化，本发明在建立的指纹图谱基础上对16批次佛手的外果皮与内果皮中的6个指标性成分进行含量测定，结果发现橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素的含量在佛手的外果皮与内果皮中存在显著差异；橙皮苷含量在内果皮中较高，而5,7-二甲氧基香豆素的含量在外果皮中较高；测定结果还发现，同一产地的黄果外果皮中5,7-二甲氧基香豆素的含量明显高于青果的(约3～5倍)；而青果内果皮中橙皮苷的含量明显高于黄果的(约0.5～3倍)。

29、橙皮苷为二氢黄酮苷类化合物，经被证明具有多种药理活性如抗炎镇痛、抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等]，那么为了提高佛手在这方面的治疗作用，可以选取佛手的内果皮，且宜选用青果。5，7-二甲氧基香豆素属于香豆素类化合物，具有抗病毒、抗感染、抗肿瘤、抗血栓生成、抗氧化、抗菌等药理活性，香豆素类化合物抗肿瘤等作用已成为研究热点，具有很高的药用价值；另外，香豆素类化合物具有芳香气味，可作为增香剂及香料等，也应用于食品、塑料制品等产品中，前景很可观，那么要让佛手在这些领域能发挥很好的价值，就可以选取佛手的外果皮，且宜选用黄果。

30、本研究建立的hplc指纹图谱和多成分进行同时定量分析的方法，可用于佛手的质量控制，并为合理充分利用佛手的药用价值提供了数据支撑。