一种血浆中原苏木素b-3-o-β-d-葡萄糖苷及其代谢物的定性定量分析方法
技术领域：
：1.本发明属于药物分析
技术领域：
：，具体涉及一种血浆中原苏木素b-3-o-β-d-葡萄糖苷及其代谢物的定性定量分析方法。
背景技术：
：：2.云实皮为豆科植物云实caesalpiniadecapetala(roxb.)alston的干燥根或根皮，具有祛风除湿、解毒消肿的功效，常用于治疗感冒发热、咳嗽、风湿痹痛等症。云实皮中主要含有香豆素类、黄酮类和萜类等成分，具有良好的抗炎、抗病毒和抗疟疾等活性，比如儿茶素、苏木查尔酮和原苏木素b(protosappaninb，ptb)都能下调tnf-α和il-6的分泌，从而发挥抗炎作用。原苏木素d(protosappanosided，ptd)是一种在云实皮提取物中首次发现的二苯并氧辛类化合物，见图10。3.药代动力学研究药物在机体内吸收、分布、代谢、排泄等体内过程，对新药的研究和开发具有重要的意义。在某种情况下，天然产物可充当前药，通过代谢转化为其他具有药理作用的活性产物。例如，黄芩苷和黄芩素是黄芩中的主要化学成分，研究发现黄芩苷可通过酶催化反应、超声提取等方法脱掉糖苷键转化为药理活性和生物利用度良好的黄芩素。经鉴定，ptd脱掉糖苷键后可转化为ptb，而ptb具有抗肿瘤、抗氧化和抗炎等明显的药理活性。因此，对ptd的体内代谢产物和体内过程进行全面研究具有重大意义。在复杂的生物样品中需要有效的分析方法进行测定，因此，在本研究中采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨技术(uhplc/qexactiveplusms)检测ptd在血浆中的代谢产物，同时建立了一种简单、快速和灵敏的超高效液相色谱-串联质谱(uplc-ms/ms)方法研究ptd及其主要代谢产物在体内的药动学过程。技术实现要素：4.针对上述问题，本发明的目的是提供一种有效的血浆中原苏木素b-3-o-β-d-葡萄糖苷及其代谢物的定性定量分析方法。5.为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：6.一种血浆中原苏木素b-3-o-β-d-葡萄糖苷及其代谢物的定性定量分析方法，包括以下步骤：7.采用uhplc/qexactiveplusms分析技术结合compounddiscoverer3.2数据分析平台快速分析大鼠血浆中原苏木素b-3-o-β-d-葡萄糖苷及其代谢物；所述代谢物包括m1、m2、m3、m4。8.优选地，所述uhplc/qexactiveplusms分析技术的条件包括色谱条件和质谱条件；9.所述色谱条件包括：10.lc系统：vanquishhorizon；色谱柱：hypersilgold；柱温：35℃；进样体积：2μl；流速：0.30ml/min；流动相组成：b相：0.1％甲酸-水，a相：0.1％甲酸-乙腈，洗脱梯度设置如下：0-2min，5％a；2-3min，5～25％a；3-6min，25～40％a；6-13min，40～95％a；13-14min，95～95％a；14-5min，95～5％a；15-18min，5～5％a；11.所述质谱条件包括：ms系统：orbitrapexploris240；扫描范围:150-1000m/z；电喷雾电压：2.5kv(-)，3.5kv(+)；去溶剂气流速：8l/min，去溶剂气温度：320℃；使用xcalibur4.2和compounddiscoverer3.2软件进行采集和处理。12.优选地，包括样品前处理；所述样品前处理包括代谢产物研究、药动学研究、对照品和qc样品的制备；13.所述代谢产物研究包括以下步骤：取大鼠血浆600μl置于5ml离心管中，依次加入2％甲酸水溶液300μl，甲醇溶液2.4ml，涡混2min，超声10min，低温12000rpm离心10min，取上清液置离心管中，37℃氮气吹干，残留物加入50％甲醇200μl复溶，涡混2min，超声10min，低温12000rpm离心10min，取上清液进qe仪器分析；14.所述药动学研究包括以下步骤：取大鼠血浆100μl，置于1.5ml离心管中，加入2％甲酸水50μl，涡混30s，加入50μl葛根素内标，加入甲醇400μl，涡混2min，超声10min，低温12000rpm离心10min，取上清液置离心管中，37℃氮气吹干，残留物加入50％甲醇200μl复溶，涡混2min，超声10min，低温12000rpm离心10min，取上清液进行uplc-ms/ms分析；15.所述对照品和qc样品的制备方法包括以下步骤：分别称取适量的ptd、ptb和is，放置于10ml棕色容量瓶中，加入少量甲醇超声溶解并定容，获得ptd、ptb、is的储备液；用甲醇稀释储备液，获得4套工作标准溶液；取适量的内标储备液至100ml容量瓶中，用50％甲醇定容至刻度，配制成20ng/ml的内标溶液，在-20℃条件下置冰箱保存，备用；将工作标准溶液和is溶液的混合物添加到空白大鼠血浆中，以制备ptd、ptb和is的最终浓度范围分别为1-30000、1-1000和4ng/ml的校准标准溶液；以相同方式制备含有ptd和ptb的qc血浆样品。16.优选地，还包括动物研究；所述动物研究中选用的动物为spf级sd大鼠，雌雄各半，体重为230±10g；所述sd大鼠的饲养条件为：动物房照明充足，空调通风良好，相对湿度50±10％，室温22±2℃，定期对实验室进行消毒，以普通颗粒大鼠饲料饮食，分笼饲养，自由饮水；17.还包括代谢产物研究；所述代谢产物研究的步骤如下：将健康sd大鼠，随机分为给药组和空白组，每组6只；给药组连续灌胃ptd27.3mg/kg3天，每天2次，于末次给药后2h股动脉取血，4℃下6000rpm离心6min，分离100μl血浆于-20℃冰冻保存直至分析；18.还包括药动学实验；将健康sd大鼠随机分为两组，每组6只；灌胃组：给药剂量27.3mg/kg，静脉注射组：给药剂量9.1mg/kg，分别于给药后0.083、0.167、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、9、12和24h尾静脉取血0.3ml，置有肝素的离心管中；4℃下6000rpm离心6min，分离100μl血浆于-20℃冰冻保存直至分析。19.本发明的有益效果：20.采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(uhplc/qexactiveplusms)和超高效液相色谱-串联质谱(uplc-ms/ms)分别研究ptd在血浆中的代谢产物和体内药动学过程，并计算其生物利用度。在ptd的代谢产物研究中，共鉴定出四种代谢产物，体内主要代谢途径包括ptd的去饱和、氧化、甲基化、烷基化、脱水、降解和去糖等过程；药动学研究中，口服和静脉注射两种给药方式都能测到ptd及其主要代谢产物院苏木素b(ptb)，discoverer3.2软件进行采集和处理。39.1.3uplc-ms/ms条件40.1.3.1色谱条件41.色谱柱：watersbehc18(2.1mm×100mm，1.7μm)柱；保护柱：watersvanguardbehc18(2.1mm×5mm，1.7μm)；)柱，流速：0.30ml/min，柱温：40℃，进样器的温度：15℃，流动相组成为：b相：0.2％甲酸-水，a相：0.2％甲酸-乙腈；梯度洗脱设置如下：0～0.5min，10％a；0.5-3min，10～90％a；3-4min，90～90％a；4-4.5min，90～10％a；4.5-5min，10～10％a。42.1.3.2质谱条件43.采用电喷雾电离源(esi)，正、负模式同时扫描，毛细管电离电压：2.5kv，离子源温度：150℃；喷雾气与反吹气：n2，去溶剂气流速：800l/hr，去溶剂气温度：400℃，扫描方式为选择离子监测(mrm)，质谱数据采集及处理软件为masslynx4.1质谱工作站工作站。ptd等2种成分及内标用于定量分析的监测离子见表1。44.表1二种成分及内标的质谱条件45.table1massspectrometryconditionsforthetwocomopentsandinternalstandards[0046][0047][0048]1.4样品前处理[0049]1.4.1代谢产物研究[0050]取大鼠血浆600μl置于5ml离心管中，依次加入2％甲酸水溶液300μl，甲醇溶液2.4ml，涡混2min，超声10min，低温12000rpm离心10min，取上清液置离心管中，37℃氮气吹干，残留物加入50％甲醇200μl复溶，涡混2min，超声10min，低温12000rpm离心10min，取上清液进qe仪器分析。[0051]1.4.2药动学研究[0052]取大鼠血浆100μl，置于1.5ml离心管中，加入2％甲酸水50μl，涡混30s，加入50μl葛根素内标(20ng/ml)，加入甲醇400μl，后续处理方法参考“2.4.1”项下方法操作，取上清液进uplc-ms/ms分析。[0053]1.4.3对照品和qc样品的制备[0054]分别称取适量的ptd、ptb和is，放置于10ml棕色容量瓶中，加入少量甲醇超声溶解并定容，获得ptd(1.002mg/ml)、ptb(1.004mg/ml)、is(0.495mg/ml)的储备液。用甲醇稀释储备液，获得4套工作标准溶液。取适量的内标储备液至100ml容量瓶中，用50％甲醇定容至刻度，配制成20ng/ml的内标溶液，置冰箱(-20℃)保存，备用。将工作标准溶液(100μl)和is溶液(50μl)的混合物添加到空白大鼠血浆(100μl)中，以制备ptd、ptb和is的最终浓度范围分别为1-30000、1-1000和4ng/ml的校准标准溶液。以相同方式制备含有ptd(5.01、250.5和15030ng/ml)和ptb(2.51、20.08和251ng/ml)的qc血浆样品。[0055]1.5动物研究[0056]spf级sd(sprague-dawley)大鼠，雌雄各半，体重为230±10g，由长沙天勤生物技术有限公司提供(许可证号：scxk(湘)2014-0010)。饲养条件：动物房照明充足，空调通风良好，相对湿度50±10％，室温22±2℃，定期对实验室进行消毒，以普通颗粒大鼠饲料饮食，分笼饲养，自由饮水。[0057]代谢产物研究：将健康sd大鼠，随机分为给药组和空白组，每组6只。给药组连续灌胃ptd27.3mg/kg3天，每天2次，于末次给药后2h股动脉取血，4℃下6000rpm离心6min，分离100μl血浆于-20℃冰冻保存直至分析。[0058]药动学实验：将健康sd大鼠随机分为两组，每组6只。灌胃组：给药剂量27.3mg/kg，静脉注射组：给药剂量9.1mg/kg，分别于给药后0.083、0.167、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、9、12和24h尾静脉取血0.3ml，置有肝素的离心管中。4℃下6000rpm离心6min，分离100μl血浆于-20℃冰冻保存直至分析。[0059]1.6数据处理[0060]使用compounddiscoverer3.2用于ptd代谢物的分析；winnonlin用于药代动力学参数分析，并使用graphpad8.2绘制图。通过spss22.0软件进行统计学分析，实验结果用means±sd表示，组间比较采用单因素方差分析，并根据he等人报告的方程式计算生物利用度(f)[19]。[0061]代谢产物鉴定[0062]1、ptd的质谱分析[0063]为了鉴定代谢物，有必要全面了解母体化合物的特征产物离子和裂解途径。在本研究中，用ptd优化了色谱和质谱条件。[0064]在负离子模式下，提取到ptd对照品(c22h26o11)的离子流色谱图，其产生m/z465.1402[m-h]-的准分子离子峰，tr为4.32min(见图1)，并获得ptd的高碰撞能质谱以及一系列的碎片离子峰。m0的tr＝4.32min，m/z465.1402，将m0鉴定为ptd原型。ptd发生反应脱掉葡萄糖苷后，在m/z303.0871(c16h16o6-)处产生离子。损失h2o和ch2o后，在侧链自由基和八元环骨架上发生了大量碎裂。m/z285.0767处的离子(c16h13o5-，由于h2o的损失)形成双键。m/z303.0871处的离子进一步失去了ch2o的一个中性片段，打开了八元素环，在m/z273.0768(c15h13o5-)处产生了一个离子。然后，该离子进一步失去一个h2o分子以在m/z255.0660(c15h11o4-)处生成该离子，并失去一个c2h3o分子在m/z243.0659(c14h11o4-)处生成该离子。m/z273.0768(c15h13o5-)处的离子失去了一个中性c2h2o片段，在m/z231.0758(c13h11o4-)处生成了离子，并进一步失去了一个o原子，在m/z215.0704(c13h11o3-)处生成了离子。ptd碎片离子产生的拟裂解途径如(图2)所示，这可以很好地用于ptd代谢产物的筛选和鉴定。[0065]2、ptd的代谢产物鉴定[0066]对大鼠血浆中的代谢产物进行鉴定分析。所有样本进行正离子模式下的全扫描和离子扫描，结合给药前后生物样本质谱图的差异，共鉴定出四种代谢物。表2总结了代谢物的质谱数据，计算质量与测量质量之间的误差范围为-3.4至3.1ppm，表示相对准确。通过比较对照品、空白血浆、大鼠给药血浆和扣除空白血浆的色谱图(图3-4)，并检索相关文献，结果发现，在m/z303.0874处的离子为ptb，且其响应很高。而目前已有研究表明ptb具有抗肿瘤和抗炎活性，因此有必要对ptd及其代谢产物ptb的药代动力学进行研究。[0067]表2ptd(m0)及其代谢物(m1-m4)的质谱数据[0068][0069]m1：m1的准分子离子峰为m/z303.0874(c16h16o6+，误差为3.1ppm)，tr为4.55min。其分子式比原型少162m/z，结合在esi-ms2谱中，产生的主要碎片离子m/z159.0442，猜测m1是ptd发生脱糖反应后得到的代谢产物。[0070]m2：m2的准分子离子峰为m/z287.0906(c16h15o5+，误差为-3.4ppm)，tr为4.33min。其分子式比原型少178m/z，结合在esi-ms2谱中，产生的主要碎片离子m/z257.0801和m/z239.0696，猜测m2是ptd发生烷基化和脱水反应后得到的代谢产物。[0071]m3：m3的准分子离子峰为m/z285.0750(c16h13o5+，误差为-2.5ppm)，tr为4.60min。其分子式比原型少180m/z，结合在esi-ms2谱中，产生的主要碎片离子m/z269.0801、m/z257.0801和m/z239.0696，猜测m3是ptd发生烷基化、脱水和降解反应后得到的代谢产物。[0072]m4：m4的准分子离子峰为m/z495.1484(c23h27o12+，误差为-2.6ppm)，tr为4.49min。其分子式比原型多30m/z，结合在esi-ms2谱中，产生的主要碎片离子m/z301.0695、m/z283.0595和m/z255.0641，猜测m4是ptd发生烷基化、脱水和降解反应后得到的代谢产物。[0073]药动学研究[0074]1、uplc-ms/ms方法验证[0075]1.1专属性[0076]在选定的色谱和质谱条件下，空白血浆、空白血浆加ptd、ptb、is和灌胃ptd30分钟后的含药血浆样品色谱图见图5，ptd、ptb和is的保留时间分别为0.74、1.46和1.42分钟。各成分间分离良好，血浆中内源性物质不干扰各个成分的测定。[0077]1.2标准曲线和线性范围[0078]大鼠血浆中ptd和ptb两种成分的标准曲线、线性范围、相关系数和lloq如表3所示。两种成分在线性范围内线性关系良好，标准曲线相关系数(r2)在0.9958～0.9998之间。[0079]表3ptd等2种成分的回归曲线方程[0080][0081]1.3准确度和精密度[0082]日内和日间精密度和准确度结果如表4所示。结果表明，日内和日间测量的rsd小于15％，准确度范围约为86.06～109.38％。这些结果提示该方法准确、可靠、重现性好，符合生物样品分析方法要求。[0083]1.4提取回收率和基质效应[0084]ptd和ptb的基质效应和萃取回收率的结果见表5。两种分析物的萃取回收率范围为87.65～103.25％；基质效应范围为88.83～105.08％。实验结果说明提取回收率良好，不存在明显的基质效应，均满足生物样品分析方法要求。[0085]1.5稳定性[0086]样品稳定性结果如表6所示。结果表明，三种成分血浆样品在室温24h、冷藏24h和经3次冻融循环均比较稳定，所有样品在上述条件下的rsd均在15％以内。[0087]表4大鼠血浆中两种分析物的准确度和精密度(n＝5)[0088][0089][0090]表5大鼠血浆中两种分析物的提取回收率和基质效应(n＝5)[0091][0092]表6两种分析物在大鼠血浆中的稳定性(n＝5)[0093][0094][0095]3.4.2药动学研究[0096]采用上述方法测定ptd在大鼠体内的药代动力学。血浆浓度-时间曲线如图6-9所示，药代动力学参数如表7所示。灌胃和静脉给药均可检测ptd及其代谢产物ptb。口服ptd后，大鼠达到最大血浆浓度约0.49h，口服和静脉给药的t1/2z分别为3.47±0.78h和3.65±1.26h，而mrt(0-t)分别为3.06±0.63h和2.07±0.57h，表明其吸收速率快，停留时间短。因此，它能迅速被血液循环吸收，并迅速从体内排出。口服ptd后的auc(0-t)为382.17±211.15ng/ml*h，静脉注射后的auc(0-t)为19364.32±10497.34ng/ml*h。静脉注射ptd后的auc(0-t)远大于口服给药后的auc(0-t)。其生物利用度约为0.65％。口服给药后，ptd的auc(0-t)为382.17ng/ml*h，ptb的auc(0-t)为179.33ng/ml*h。体内ptb含量约为ptd的一半。[0097]表7灌胃ptd(27.3mg/kg)和静脉注射ptd(9.3mg/kg)后大鼠血浆中ptd和ptb的药代动力学参数(n＝5)[0098][0099]ptd是首次在云实皮提取物中发现的一种化合物，为二苯并含氧八元杂环的三环母核。[0100]本研究通过口服和静脉注射两种方式给予ptd，以探究ptd在体内的动力学过程和转化过程。在代谢研究中发现，ptd主要代谢途径为去饱和、氧化、甲基化、烷基化、脱水、降解和去糖等过程，而化学成分成分的体内有效性在很大程度上取决于其血液浓度及其代谢产物的活性。因此对ptd的代谢产物进行研究具有重大的意义。前期预实验比较了这些代谢产物的体内动力学过程，结果显示，ptb为ptd的主要活性代谢产物，不仅仅因为含量较高，且唯有ptb在体内动力学过程较为完整。ptb为其发生去糖反应得到的化合物，且有相关报道ptb具有抗炎和抗癌活性，具有较大的利用价值。因此，ptd有作为前药的潜力，通过结构修饰和改造从而充分发挥其价值。[0101]为进一步考察ptd及其主要代谢产物在体内的动力学过程，在药动实验中，首次建立了uplc-ms/ms测定生物样品中ptd和ptb的体内含量测定分析方法，该方法快速、简单、灵敏、稳定。采用正、负模式同时扫描，扫描方式为选择离子监测(mrm)，分析时间为3min，较大程度的提高实验效率。实验各项方法学考察结果均符合生物样品分析测定要求，且操作简单、选择性好、灵敏度高，并成功将该方法用于研究ptd和ptb的药代动力学过程，并获取了相关药代动力学参数。实验结果显示，ptd经口服给药在大鼠体内的tmax、t1/2z和mrt(0-t)分别为0.49h、3.47h和3.06h，表明其在体内吸收速度快，可迅速吸收到血液循环中，同时停留时间较短可迅速被转化为ptb和其他代谢物。生物利用度是衡量药物在生物体内的吸收程度，药物的生物利用度越高越好。结果显示，ptd静注后的auc(0-t)显著高于口服后的，其绝对生物利用度较低仅约为0.65％，表明ptd经口服方式给药后进入体循环的总量明显减少，推测有部分药物受首过效应的影响而不被吸收，导致ptd的绝对生物利用度低，但这并不意味着没有意义，如果一个药物的生物利用率低但治疗暴露量高，也是具有较高的开发意义，我们应采取其他方法对其进行修饰或改造，以充分利用其价值。基于公式：cl＝kv，t1/2＝0.693/k。而ptd口服和静注后的t1/2接近，说明两种给药后的k接近，证明cl主要受到v的影响。ptd口服给药后的cl和v远大于静注后的，猜测的是ptd口服给药经过胃肠道吸收，受到胃肠道代谢酶的作用，使口服后v远大于静注后的从而导致口服后的cl远大于静注后的。口服给药后，ptd的auc(0-t)为382.17ng/ml*h，ptb的auc(0-t)为179.33ng/ml*h，ptb在体内的含量约为ptd的一半，表明ptd主要转化为ptb，且两种给药方式后ptb的mrt(0-t)都显著高于ptd，猜测ptd在体内的药效可能归功于ptb和其他代谢产物的作用，此猜测需要进一步的实验进行验证。[0102]ptd是首次从云实皮提取物中分离提取出来的一种新化合物，经结构鉴定命名为原苏木素b-3-o-β-d-葡萄糖苷。在代谢产物研究中，总的鉴定出4中代谢产物，主要的代谢途径为去饱和、氧化、甲基化、烷基化、脱水、降解和去糖等过程；药动学结果显示，ptd在体内可快速被吸收并且转化也很快，其生物利用度为0.65％。本文将首次报道ptd的结构鉴定、药理活性、代谢产物鉴定以及药代动力学研究，这对ptd的开发和利用具有重要意义。[0103]在本研究中，采用uhplc/qexactiveplusms技术结合compounddiscoverer3.2数据分析平台快速分析大鼠血浆中ptd的代谢物，并在正离子模式下进行数据采集。根据保留时间、ptd对照品的特征裂解规律，代谢产物的精确分子质量及特征碎片离子等共鉴定出四种代谢产物物。结果表明ptd在大鼠体内主要发生烷基化、脱水、去饱和、氧化、甲基化、降解和去糖等反应。当前第1页12当前第1页12