试剂盒及其制备方法与流程

1.本发明涉及医药检测技术领域，尤其涉及一种试剂盒及其制备方法。


背景技术：

2.阿尔兹海默症(alzheimer disease，ad)，俗称老年痴呆，是一种起病隐匿的，进展性的中枢神经退行性疾病。阿尔兹海默症典型的组织病理学改变为β淀粉样蛋白(aβ)沉积导致的老年斑，tau蛋白异常磷酸化引起的神经纤维缠结，以及神经元和突触的丢失。根据淀粉样蛋白级联假说，aβ病理是ad的上游事件，驱动着新皮质tau病理与神经变性的发生，aβ1-42、aβ1-40、t-tau、p-tau是目前国内外被广泛认可的ad生物标志物。研究表明，ad患者的血浆中aβ1-42与aβ1-42/aβ1-40表达下调、而t-tau和p-tau-181的表达升高。
3.aβ1-42和aβ1-40是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，app)经bace和γ-分泌酶水解后产生，可在膜外逐渐积聚形成aβ蛋白聚合物，并对神经元产生毒性作用，导致神经元变性。与aβ1-40相比，aβ1-42的凝集性非常高，在老人斑形成早期就已经逐渐积累。血浆aβ1-42含量与aβ1-42/aβ1-40比率反映了大脑中的aβ病理情况，能用于早期评估ad痴呆和轻度认知功能障碍(mild cognitive impairment,mci)的患病风险。其中aβ1-42甚至会在aβ正电子发射计算机断层显像(amyloid-βpositron emission tomography，aβ-pet)异常之前就发生下降。
4.tau蛋白是微管相关蛋白(microtubule-associated proteins，maps)，在中枢神经系统的神经元中含量很高，主要功能是调节轴突微管的稳定性。它同时也是一种磷蛋白，具有多个磷酸化位点，其中研究最多的主要有p-tau-181、p-tau-217等。磷酸化的tau会与微管蛋白竞争结合正常tau蛋白及其他微管相关蛋白，导致微管解聚，在神经元内形成成对螺旋丝(phf)，影响tau蛋白的正常生理功能。研究表明，血浆t-tau浓度在克罗伊茨费尔特-雅各布病(creutzfeldt-jakob disease，cjd)和额颞叶痴呆(frontotemporal lobar dementia，ftd)中也会升高，是cjd的重要预测因子；而血浆p-tau-181水平可以反应ad中aβ与tau的病理情况，区分阿尔茨海默病与其他神经退行性疾病(如帕金森病和血管性痴呆等等)，并在整个临床进程中监测ad患者的病情进展。
5.α-突触核蛋白(α-synuclein)是一种大小为14kda的可溶性蛋白质，主要在大脑的突触前末梢表达，具有调节神经元膜的稳定性、影响突触前信号传导和膜运输等作用。与tau蛋白类似，α-synuclein也容易发生病理性的错误折叠和聚集，导致一些神经退行性疾病的发生，如帕金森病(pd)、路易体痴呆(dlb)和多系统萎缩(msa)等，这些疾病又统称为α-突触核蛋白病，其与ad生物标志物联合检测可以进一步区分ad与α-突触核蛋白病。
6.综上可知，aβ1-42、aβ1-40、t-tau和p-tau-181的联合检测可提高ad判定的准确性，而通过α-synuclein的加入可排除α-突触核蛋白病。故通过联合检测人体血浆中aβ1-42、aβ1-40、t-tau、p-tau-181和α-synuclein的浓度，可用于ad的辅助诊断。
7.目前，市面上定量检测aβ1-42、aβ1-40、t-tau、p-tau-181、α-synuclein、的产品主要方法学有酶联免疫法。酶联免疫法法手工操作步骤繁琐，结果重复性差。免疫透射比浊操
作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，不足的是灵敏度和精密度欠佳，所需的血浆量大，检测的周期较长。目前aβ1-42、aβ1-40、t-tau、p-tau-181、α-synuclein检测技术中一般都是单独检测，试剂灵敏度、精密度等性能欠佳，且检测时间长、操作复杂；因此亟需一种能够同时检测出几种ad标志物的性能优良的试剂。
8.因此，有必要提供一种新型的试剂盒及其制备方法以解决现有技术中存在的上述问题。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供一种试剂盒及其制备方法，能够在同一样品中同时完成至少3种阿尔兹海默症相关蛋白的检测，可降低试剂和人工的成本。
10.为实现上述目的，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒用于检测人血浆中阿尔兹海默症相关蛋白，所述试剂盒包括抗体蛋白和检测抗体，所述抗体蛋白包括aβ1-40抗体、aβ1-42抗体和p-tau-181抗体，所述检测抗体包括抗人aβ1-40抗体、抗人aβ1-42抗体和抗人p-tau-181抗体。
11.本发明的试剂盒的有益效果在于：能够在同一样品中同时完成阿尔兹海默症至少3种相关蛋白的检测，可降低试剂和人工的成本，而且特异性强、灵敏度高、重复性好，具有较好的应用前景。
12.优选的，所述抗体蛋白还包括t-tau抗体、p-tau231抗体、p-tau217抗体、α-synuclein抗体中的至少一种，所述检测抗体还包括抗人t-tau抗体、抗人p-tau231抗体、抗人p-tau217抗体、抗人α-synuclein抗体中的至少一种。
13.优选的，所述抗体蛋白和所述检测抗体为以下组合中的至少一种：
14.所述抗体蛋白为aβ1-40抗体、aβ1-42抗体和p-tau-181抗体，所述检测抗体为抗人aβ1-40抗体、抗人aβ1-42抗体和抗人p-tau-181抗体；
15.所述抗体蛋白为aβ1-40抗体、aβ1-42抗体、p-tau-181抗体和α-synuclein抗体，所述检测抗体为抗人aβ1-40抗体、抗人aβ1-42抗体、抗人p-tau-181抗体和抗人α-synuclein抗体；
16.所述抗体蛋白为aβ1-40抗体、aβ1-42抗体、p-tau-181抗体、t-tau抗体和α-synuclein抗体，所述检测抗体为抗人aβ1-40抗体、抗人aβ1-42抗体、抗人p-tau-181抗体、抗人t-tau抗体和抗人α-synuclein抗体；
17.所述抗体蛋白为aβ1-40抗体、aβ1-42抗体、p-tau-181抗体、t-tau抗体、α-synuclein抗体和p-tau231抗体，所述检测抗体为抗人aβ1-40抗体、抗人aβ1-42抗体、抗人p-tau-181抗体、抗人t-tau抗体、抗人α-synuclein抗体和抗人p-tau231抗体；
18.所述抗体蛋白为aβ1-40抗体、aβ1-42抗体、p-tau-181抗体、t-tau抗体、α-synuclein抗体、p-tau231抗体和p-tau217抗体，所述检测抗体为抗人aβ1-40抗体、抗人aβ1-42抗体、抗人p-tau-181抗体、抗人t-tau抗体、抗人α-synuclein抗体、抗人p-tau231抗体和抗人p-tau217抗体。
19.优选的，所述试剂盒还包括固相载体，所述抗体蛋白固定于所述固相载体上。
20.优选的，所述固相载体包括酶标板微孔、磁珠、亲和膜或液相芯片，所述液相芯片包括微球。
21.优选的，所述试剂盒采用的信号检测方法包括可见光显色法、化学发光法或荧光发光法。
22.优选的，所述试剂盒还包括微球和生物素，每个所述微球与一种抗体蛋白结合形成抗体偶联的微球，每份所述生物素与一种所述检测抗体偶联形成生物素偶联的抗体。
23.优选的，所述试剂盒还包括荧光试剂，所述荧光试剂为链霉亲和素与藻红蛋白偶联物。
24.优选的，所述抗体偶联的微球中微球与抗体包被比例为每106个微球上包被10-30ug抗体。
25.优选的，所述试剂盒还包括洗涤缓冲液、反应缓冲液、样本稀释液、校准品和质控品。
26.本发明还提供一种试剂盒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
27.在若干份不同的荧光微球中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺和不同抗体后，在室温下反应4-6小时，然后清洗得到的微球以去除多余抗体后加入脱脂奶粉封闭20-40分钟，然后去除所述脱脂奶粉，以分别得到不同微球，其中，控制向不同份荧光微球加入的不同抗体包括aβ1-40抗体、aβ1-42抗体和p-tau-181抗体，使得到的不同微球包括aβ1-40抗体偶联的微球、aβ1-42抗体偶联的微球和p-tau-181抗体偶联的微球；
28.将所述aβ1-40抗体偶联的微球、所述aβ1-42抗体偶联的微球和所述p-tau-181抗体偶联的微球混合，配制成抗体偶联的微球混合液；
29.在抗人aβ1-40抗体、抗人aβ1-42抗体和抗人p-tau-181抗体中分别加入生物素，分别控制抗体与生物素的摩尔比均在1:10-1:40之间，在室温下孵育4-6小时后，分别得到生物素偶联的抗人aβ1-40抗体、生物素偶联的抗人aβ1-42抗体和生物素偶联的抗人p-tau-181抗体；
30.将生物素偶联的抗人aβ1-40抗体、生物素偶联的抗人aβ1-42抗体和生物素偶联的抗人p-tau-181抗体混合，配制成生物素偶联抗体。
31.本发明试剂盒的制备方法的有益效果在于：本发明制备的试剂盒能够在同一样品中同时完成阿尔兹海默症至少3种相关蛋白的检测，可降低试剂和人工的成本，而且特异性强、灵敏度高、重复性好，具有较好的应用前景。
附图说明
32.图1为本发明实施例试剂盒的检测原理示意图；
33.图2为本发明实施例抗体偶联的微球的分布情况；
34.图3为本发明第三实施例的流式荧光检测aβ1-40、aβ1-42、t-tau、p-tau-181和α-synuclein的校准曲线；
35.图4为本发明实施例的aβ1-40的线性评价结果；
36.图5为本发明实施例的aβ1-42的线性评价结果；
37.图6为本发明实施例的t-tau的线性评价结果；
38.图7为本发明实施例的p-tau-181的线性评价结果；
39.图8为本发明实施例的α-synuclein的线性评价结果；
40.图9为本发明实施例中健康人与ad患者的aβ1-40检测量比对图；
41.图10为本发明实施例中健康人与ad患者的aβ1-42检测量比对图；
42.图11为本发明实施例中健康人与ad患者的t-tau检测量比对图；
43.图12为本发明实施例中健康人与ad患者的p-tau181检测量比对图；
44.图13为本发明实施例中健康人与ad患者的α-synuclein检测量比对图；
45.图14为本发明实施例中健康人与ad患者的aβ1-42/aβ1-40比值的检测量比对图。
具体实施方式
46.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
47.针对现有技术存在的问题，本发明的实施例提供了一种试剂盒，所述试剂盒用于检测人血浆中阿尔兹海默症相关蛋白，所述试剂盒包括抗体蛋白和检测抗体，所述抗体蛋白包括aβ1-40抗体、aβ1-42抗体和p-tau-181抗体，所述检测抗体包括抗人aβ1-40抗体、抗人aβ1-42抗体和抗人p-tau-181抗体。
48.本发明的试剂盒的有益效果在于：本发明试剂盒使用双抗体夹心检测方法，选取阿尔兹海默症的高相关性蛋白的组合进行检测，能够在同一样品中同时完成阿尔兹海默症至少3种相关蛋白的检测，提高了检测阿尔兹海默症相关蛋白的准确性，更方便了临床的检测应用，可降低试剂和人工的成本，而且特异性强、灵敏度高、重复性好，具有较好的应用前景。
49.一些实施例中，所述抗体蛋白还包括t-tau抗体、p-tau231抗体、p-tau217抗体、α-synuclein抗体中的至少一种，所述检测抗体还包括抗人t-tau抗体、抗人p-tau231抗体、抗人p-tau217抗体、抗人α-synuclein抗体中的至少一种。
50.一些实施例中，所述抗体蛋白和所述检测抗体为以下组合中的至少一种：
51.所述抗体蛋白为aβ1-40抗体、aβ1-42抗体和p-tau-181抗体，所述检测抗体为抗人aβ1-40抗体、抗人aβ1-42抗体和抗人p-tau-181抗体；
52.所述抗体蛋白为aβ1-40抗体、aβ1-42抗体、p-tau-181抗体和α-synuclein抗体，所述检测抗体为抗人aβ1-40抗体、抗人aβ1-42抗体、抗人p-tau-181抗体和抗人α-synuclein抗体；
53.所述抗体蛋白为aβ1-40抗体、aβ1-42抗体、p-tau-181抗体、t-tau抗体和α-synuclein抗体，所述检测抗体为抗人aβ1-40抗体、抗人aβ1-42抗体、抗人p-tau-181抗体、抗人t-tau抗体和抗人α-synuclein抗体；
54.所述抗体蛋白为aβ1-40抗体、aβ1-42抗体、p-tau-181抗体、t-tau抗体、α-synuclein抗体和p-tau231抗体，所述检测抗体为抗人aβ1-40抗体、抗人aβ1-42抗体、抗人p-tau-181抗体、抗人t-tau抗体、抗人α-synuclein抗体和抗人p-tau231抗体；
55.所述抗体蛋白为aβ1-40抗体、aβ1-42抗体、p-tau-181抗体、t-tau抗体、α-synuclein抗体、p-tau231抗体和p-tau217抗体，所述检测抗体为抗人aβ1-40抗体、抗人aβ1-42抗体、抗人p-tau-181抗体、抗人t-tau抗体、抗人α-synuclein抗体、抗人p-tau231抗体和抗人p-tau217抗体。
56.一些实施例中，所述试剂盒还包括固相载体，所述抗体蛋白固定于所述固相载体上。
57.一些实施例中，所述固相载体包括酶标板微孔、磁珠、亲和膜或液相芯片，所述液相芯片包括微球。
58.一些实施例中，所述试剂盒采用的信号检测方法包括可见光显色法、化学发光法或荧光发光法。
59.一些实施例中，所述试剂盒还包括微球和生物素，每个所述微球与一种抗体蛋白结合形成抗体偶联的微球，每份所述生物素与一种所述检测抗体偶联形成生物素偶联的抗体。
60.一些实施例中，所述抗体偶联的微球包括所述抗体蛋白为aβ1-40抗体偶联的微球、aβ1-42抗体偶联的微球和p-tau-181抗体偶联的微球，所述检测抗体为生物素偶联抗人aβ1-40抗体、生物素偶联抗人aβ1-42抗体和生物素偶联抗人p-tau-181抗体；
61.一些实施例中，所述抗体蛋白为aβ1-40抗体偶联的微球、aβ1-42抗体偶联的微球、p-tau-181抗体偶联的微球和α-synuclein抗体偶联的微球，所述检测抗体为生物素偶联抗人aβ1-40抗体、生物素偶联抗人aβ1-42抗体、生物素偶联抗人p-tau-181抗体和生物素偶联抗人α-synuclein抗体；
62.一些实施例中，所述抗体蛋白为aβ1-40抗体偶联的微球、aβ1-42抗体偶联的微球、p-tau-181抗体偶联的微球、t-tau抗体偶联的微球和α-synuclein抗体偶联的微球，所述检测抗体为生物素偶联抗人aβ1-40抗体、生物素偶联抗人aβ1-42抗体、生物素偶联抗人p-tau-181抗体、生物素偶联抗人t-tau抗体和生物素偶联抗人α-synuclein抗体；
63.一些实施例中，所述抗体蛋白为aβ1-40抗体偶联的微球、aβ1-42抗体偶联的微球、p-tau-181抗体偶联的微球、t-tau抗体偶联的微球、α-synuclein抗体偶联的微球和p-tau231抗体偶联的微球，所述检测抗体为生物素偶联抗人aβ1-40抗体、生物素偶联抗人aβ1-42抗体、生物素偶联抗人p-tau-181抗体、生物素偶联抗人t-tau抗体、生物素偶联抗人α-synuclein抗体和生物素偶联抗人p-tau231抗体；
64.一些实施例中，所述抗体蛋白为aβ1-40抗体偶联的微球、aβ1-42抗体偶联的微球、p-tau-181抗体偶联的微球、t-tau抗体偶联的微球、α-synuclein抗体偶联的微球、p-tau231抗体偶联的微球和p-tau217抗体偶联的微球，所述检测抗体为生物素偶联抗人aβ1-40抗体、生物素偶联抗人aβ1-42抗体、生物素偶联抗人p-tau-181抗体、生物素偶联抗人t-tau抗体、生物素偶联抗人α-synuclein抗体、生物素偶联抗人p-tau231抗体和生物素偶联抗人p-tau217抗体。
65.一些实施例中，所述试剂盒还包括荧光试剂，所述荧光试剂为链霉亲和素与藻红蛋白偶联物(sa-pe)。
66.一些实施例中，所述抗体偶联的微球中微球与抗体包被比例为每106个微球上包被10-30ug抗体。
67.一些实施例中，所述抗体偶联的微球中微球与抗体包被比例为每106个微球上包被20ug抗体。
68.一些实施例中，所述试剂盒还包括洗涤缓冲液、反应缓冲液、样本稀释液、校准品和质控品。
69.一些实施例中，所述样本稀释液包括三羟甲基氨基甲烷缓冲液、氯化钠和防腐剂。
70.一些实施例中，所述反应缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷缓冲液、氯化钠、牛血清白蛋白、阻断剂、防腐剂和吐温-20。
71.一些实施例中，所述洗涤缓冲液包括牛血清白蛋白和磷酸盐。
72.本发明还提供一种试剂盒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
73.在若干份不同的荧光微球中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺和不同抗体后，在室温下反应4-6小时，然后清洗得到的微球以去除多余抗体后加入脱脂奶粉封闭20-40分钟，然后去除所述脱脂奶粉，以分别得到不同微球，其中，控制向不同份荧光微球加入的不同抗体包括aβ1-40抗体、aβ1-42抗体和p-tau-181抗体，使得到的不同微球包括aβ1-40抗体偶联的微球、aβ1-42抗体偶联的微球和p-tau-181抗体偶联的微球；
74.将所述aβ1-40抗体偶联的微球、所述aβ1-42抗体偶联的微球和所述p-tau-181抗体偶联的微球混合，配制成抗体偶联的微球混合液；
75.在抗人aβ1-40抗体、抗人aβ1-42抗体和抗人p-tau-181抗体中分别加入生物素，分别控制抗体与生物素的摩尔比均在1:10-1:40之间，在室温下孵育4-6小时后，分别得到生物素偶联的抗人aβ1-40抗体、生物素偶联的抗人aβ1-42抗体和生物素偶联的抗人p-tau-181抗体；
76.将生物素偶联的抗人aβ1-40抗体、生物素偶联的抗人aβ1-42抗体和生物素偶联的抗人p-tau-181抗体混合，配制成生物素偶联抗体。
77.本发明试剂盒的制备方法的有益效果在于：本发明制备的试剂盒使用双抗体夹心检测方法，选取阿尔兹海默症的高相关性蛋白的组合进行检测，能够在同一样品中同时完成阿尔兹海默症至少3种相关蛋白的检测，提高了检测阿尔兹海默症相关蛋白的准确性，更方便了临床的检测应用，可降低试剂和人工的成本，而且特异性强、灵敏度高、重复性好，具有较好的应用前景。
78.一些实施例中，控制制备所述不同微球所使用的各荧光微球的荧光强度各不相同。
79.一些实施例中，任意一种所述荧光微球的制备方法包括：使用别藻蓝蛋白和聚苯乙烯微球进行配制；
80.控制制备不同荧光微球所使用的别藻蓝蛋白的浓度各不相同，或者，控制制备不同荧光微球所使用的聚苯乙烯微球的体积各不相同。
81.本发明还提供一种试剂盒的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：
82.s1：向样本管中依次加入所述反应缓冲液、抗体偶联的微球混合液和待测样本；
83.s2：向所述步骤s1所得混合物中加入生物素偶联抗体，将得到的混合物在2-8℃下避光孵育；
84.s3：向所述步骤s2所得混合物中加入荧光试剂，将得到的混合物在室温下避光孵
育，得到第一复合物；
85.s4：在流式细胞仪上检测所述第一复合物的荧光类型和荧光信号强度，计算得到所述待测样品中所述aβ1-40、aβ1-42、p-tau-181的含量。
86.本发明使用双抗体夹心检测方法，选取阿尔兹海默症的高相关性蛋白的组合进行检测，能够在同一样品中同时完成阿尔兹海默症至少3种相关蛋白的检测，提高了检测阿尔兹海默症相关蛋白的准确性，更方便了临床的检测应用，解决了当检测一个样本中的aβ1-40、aβ1-42和p-tau-181时，需要单独的用3种检测试剂分别对aβ1-40、aβ1-42、p-tau-181进行检测的问题，节约成本，缩短了检测时间，从而提高了检测效率，而且特异性强、灵敏度高、重复性好，具有较好的应用前景。
87.一些实施例中，所述步骤s1包括，向样本管中依次加入反应缓冲液、所述抗体偶联的微球混合液，将得到的混合液混合均匀后加入待测样本。
88.一些实施例中，所述步骤s3中，将得到的混合物在室温下避光孵育的步骤执行完毕后还包括，向避光孵育后所得混合物中加入洗涤缓冲液，通过涡旋将所得混合物中的所述微球重悬，然后离心，保留沉淀，向所得沉淀中加入洗涤缓冲液，通过涡旋将所得混合物中的所述微球重悬，然后得到第一复合物。所述第一复合物为抗体偶联的微球混合液、待测样本、生物素偶联抗体及荧光试剂复合物形成的复合物。
89.一些实施例中，所述步骤s2中，将得到的混合物在2-8℃下避光孵育的时间为17-19小时。
90.一些实施例中，所述步骤s3中，将得到的混合物在室温下避光孵育的时间为0.25-0.75小时。
91.图1为本发明实施例试剂盒的检测原理示意图。参照图1，抗体蛋白2偶联的聚苯乙烯微球1、待测样本3、生物素5偶联的检测抗体4、链霉亲和素6与藻红蛋白7偶联物结合形成免疫复合体，流式细胞仪发射的两束不同波长激发光照射免疫复合体，由不同抗体偶联的微球的荧光强度确定检测指标类型、由藻红蛋白的荧光强度确定各项检测指标含量。
92.一些实施例中，所述抗人aβ1-40抗体、抗人aβ1-42抗体、抗人t-tau抗体、抗人p-tau-181抗体、抗人α-synuclein抗体、抗人p-tau231抗体和抗人p-tau217抗体均为鼠源单克隆抗体。
93.另一些实施例中，所述抗人aβ1-40抗体、抗人aβ1-42抗体、抗人t-tau抗体、抗人p-tau-181抗体、抗人α-synuclein抗体、抗人p-tau231抗体和抗人p-tau217抗体为大鼠、羊、兔、骆驼的单克隆抗体或多克隆抗体。
94.一些实施例中，所述聚苯乙烯微球可用其他种类的载体如编码微球替代，或聚苯乙烯微球内部的apc荧光材料替换为其他种类的荧光素。
95.一些实施例中，所述荧光试剂可将藻红蛋白替换为其他种类的荧光素或标记物，如量子点。
96.本发明实施例的反应体系中各组分的加入量都可以等比例的调整或单独组分的单独调整。
97.本发明所述试剂盒使用方法步骤、各组分加入顺序、加样量、孵育条件都可以进行适当的调整。
98.以下通过第一至第十一实施例对本发明的技术方案进行详细阐述。
99.第一实施例
100.本实施例提供第一种试剂盒的具体组成，表1为第一种试剂盒的组成成分。
101.表1
[0102][0103]
第二实施例
[0104]
本实施例提供第二种试剂盒的具体组成。表2为第二种试剂盒的组成成分。
[0105]
表2
[0106]
[0107][0108]
第三实施例
[0109]
本实施例提供第三种试剂盒的具体组成，表3为第三种试剂盒的组成成分。
[0110]
表3
[0111]
[0112][0113]
第四实施例
[0114]
本实施例提供了试剂盒的制备方法。所述试剂盒的具体制备方法为：
[0115]
(1)制备抗体偶联的微球混合液
[0116]
取第一荧光微球、第二荧光微球、第三荧光微球，表4为制备抗体偶联的荧光微球中各原料的厂家、货号来源。
[0117]
表4
[0118]
微球厂家货号第一荧光微球biolegend740167第二荧光微球biolegend740168第三荧光微球biolegend740169
[0119]
制备aβ1-40抗体偶联的微球步骤：取第一荧光微球5
×
106个，加入pbst缓冲液清洗2次，在清洗后的所述第一荧光微球中加入100ug的edc和50ug的nhs放置30分钟以活化微球，加入100ug抗人aβ1-40抗体在室温旋转反应5小时以清洗微球去除多余抗体，清洗所述第一荧光微球去除多余所述抗人aβ1-40抗体后加入质量分数为5％的脱脂奶粉封闭30分钟，去除封闭液后加入ph为7.2的tirs缓冲液保存；
[0120]
制备aβ1-42抗体偶联的微球步骤：取第二荧光微球5
×
106个，加入pbst缓冲液清洗2次，在清洗后的所述第二荧光微球中加入100ug的edc和50ug的nhs放置30分钟以活化微球，加入100ug抗人aβ1-42抗体在室温旋转反应5小时以清洗微球去除多余抗体，清洗所述第二荧光微球去除多余所述抗人aβ1-42抗体后加入质量分数为5％的脱脂奶粉封闭30分钟，去除脱脂奶粉后加入ph为7.2的tirs缓冲液保存；
[0121]
制备p-tau-181抗体偶联的微球步骤：取第三荧光微球5
×
106个，加入pbst缓冲液清洗2次，在清洗后的所述第三荧光微球中加入100ug的edc和50ug的nhs放置30分钟以活化微球，加入100ug抗人p-tau-181抗体在室温旋转反应5小时以清洗微球去除多余抗体，清洗所述第三荧光微球去除多余所述抗人p-tau-181抗体后加入质量分数为5％的脱脂奶粉封闭30分钟，去除脱脂奶粉后加入ph为7.2的tirs缓冲液保存；
[0122]
取ph为7.2的tirs缓冲液98ml，分别加入aβ1-40、aβ1-42、p-tau-181抗体偶联的微
球各0.5ml，配制成所述抗体偶联的微球混合液。
[0123]
(2)制备生物素偶联抗体
[0124]
取抗人aβ1-40抗体、抗人aβ1-42抗体、抗人p-tau-181抗体各100ug，分别按照抗体与生物素的摩尔比为1:30添加生物素，在室温下孵育5小时后，得到所述生物素偶联的抗人aβ1-40抗体、所述生物素偶联的抗人aβ1-42抗体、所述生物素偶联的抗人p-tau-181抗体，用0.01mol/l的pbs溶液分别稀释所述生物素偶联的抗人aβ1-40抗体、所述生物素偶联的抗人aβ1-42抗体、所述生物素偶联的抗人p-tau-181抗体分别至4ug/ml；
[0125]
分别取上述浓度为4ug/ml生物素偶联的抗人aβ1-40抗体、所述生物素偶联的抗人aβ1-42抗体、所述生物素偶联的抗人p-tau-181抗体各25ml混合，并补充50ml 0.01mol/l的pbs溶液配制成所述生物素偶联抗体。则每种生物素标记抗体的浓度为0.8ug/ml。
[0126]
(3)sa-pe荧光试剂，采购自thermofisher，稀释至4ug/ml备用。
[0127]
(4)制备样本稀释液
[0128]
将9g氯化钠(nacl)、6.057g的三羟甲基氨基甲烷(tirs base)溶于1000ml纯水，加入质量浓度为1％的proclin300防腐剂，调节ph至7.4备用。
[0129]
(5)制备反应缓冲液
[0130]
取9g的nacl、6.057g的tirs base溶于1000ml纯水，加入质量浓度为1％的牛血清白蛋白(bsa)、质量浓度为5％的阻断剂、质量浓度为0.1％的proclin300防腐剂、质量浓度为0.1％的吐温-20，调节ph至7.4备用。
[0131]
(6)制备洗涤缓冲液(10
×
)
[0132]
将2.4g的磷酸二氢钾(kh2po4)、36.32g的十二水合磷酸氢二钾(na2hpo4·
12h2o)、8g的nacl、2g的kcl溶于1000ml纯水中，加入25g的bsa、质量浓度为1％的proclin300防腐剂、质量浓度为0.5％的吐温-20，混合备用。
[0133]
(7)制备校准品，不同浓度的aβ1-40、aβ1-42、p-tau-181蛋白，经样本稀释液稀释至不同浓度后分别冻干，组合得到校准品，用以建立检测时的校准曲线。表5为校准品蛋白aβ1-40、aβ1-42、p-tau-181的厂家、货号来源。
[0134]
表5
[0135]
校准品蛋白厂家货号aβ1-40abcamab120479aβ1-42abcamab120301p-tau-181abcamab269022
[0136]
(8)制备质控品，所述质控品由aβ1-40、aβ1-42、p-tau-181重组蛋白的高值和中值冻干品，以判断检测结果的可靠性。所述质控品蛋白的来源参照表5。
[0137]
第五实施例
[0138]
本实施例提供了又一种试剂盒的制备方法，与第四实施例制备方法的区别在于：
[0139]
(1)制备抗体偶联的微球混合液
[0140]
取第一荧光微球、第二荧光微球、第三荧光微球、第四荧光微球，表6为制备抗体偶联的荧光微球中各原料的厂家、货号来源。
[0141]
表6
[0142]
微球厂家货号
第一荧光微球biolegend740167第二荧光微球biolegend740168第三荧光微球biolegend740169第四荧光微球biolegend740170
[0143]
本实施例还包括制备α-synuclein抗体偶联的微球步骤。
[0144]
制备α-synuclein抗体偶联的微球步骤包括，取第四荧光微球5
×
106个，加入pbst缓冲液清洗2次，在清洗后的所述第四荧光微球中加入100ug的edc和50ug的nhs放置30分钟以活化微球，加入100ug抗人α-synuclein抗体在室温旋转反应5小时以清洗微球去除多余抗体，清洗所述第四荧光微球去除多余所述抗人α-synuclein抗体后加入质量分数为5％的脱脂奶粉封闭30分钟，去除脱脂内粉后加入ph为7.2的tirs缓冲液保存，制得α-synuclein抗体偶联的微球。
[0145]
取ph为7.2的tirs缓冲液98ml，分别加入aβ1-40、aβ1-42、p-tau-181和α-synuclein抗体偶联的微球各0.5ml，配制成所述抗体偶联的微球混合液。
[0146]
(2)制备生物素偶联抗体
[0147]
取抗人aβ1-40抗体、抗人aβ1-42抗体、抗人p-tau-181抗体、抗人α-synuclein抗体各100ug，分别按照抗体与生物素的摩尔比为1:30添加生物素，在室温下孵育5小时后，得到所述生物素偶联的抗人aβ1-40抗体、所述生物素偶联的抗人aβ1-42抗体、所述生物素偶联的抗人p-tau-181抗体和所述生物素偶联的抗人α-synuclein抗体，用0.01mol/l的pbs溶液分别稀释所述生物素偶联的抗人aβ1-40抗体、所述生物素偶联的抗人aβ1-42抗体、所述生物素偶联的抗人p-tau-181抗体和所述生物素偶联的抗人α-synuclein抗体分别至4ug/ml；
[0148]
分别取上述浓度为4ug/ml生物素偶联的抗人aβ1-40抗体、所述生物素偶联的抗人aβ1-42抗体、所述生物素偶联的抗人p-tau-181抗体和所述生物素偶联的抗人α-synuclein抗体各25ml混合，并补充25ml 0.01mol/l的pbs溶液配制成所述生物素偶联抗体。则每种生物素标记抗体的浓度为0.8ug/ml。
[0149]
(3)制备校准品，不同浓度的aβ1-40、aβ1-42、p-tau-181、α-synuclein蛋白，经样本稀释液稀释至不同浓度后分别冻干，组合得到校准品，用以建立检测时的校准曲线。表7为校准品蛋白aβ1-40、aβ1-42、p-tau-181、α-synuclein的厂家、货号来源。
[0150]
表7
[0151]
校准品蛋白厂家货号aβ1-40abcamab120479aβ1-42abcamab120301p-tau-181abcamab269022α-synucleinmilliporesigmas7820
[0152]
(4)制备质控品，所述质控品由aβ1-40、aβ1-42、p-tau-181、α-synuclein重组蛋白的高值和中值冻干品，以判断检测结果的可靠性。所述质控品蛋白的来源参照表7。
[0153]
(5)sa-pe荧光试剂、制备样本稀释液、制备反应缓冲液、制备洗涤缓冲液(10
×
)的步骤与第四实施例相同，在此不再赘述。
[0154]
第六实施例
[0155]
本实施例提供另一种试剂盒的制备方法，与第五实施例的区别在于：
[0156]
(1)制备抗体偶联的微球混合液
[0157]
取第一荧光微球、第二荧光微球、第三荧光微球、第四荧光微球、第五荧光微球，表8为制备抗体偶联的荧光微球中各原料的厂家、货号来源。
[0158]
表8
[0159]
微球厂家货号第一荧光微球biolegend740167第二荧光微球biolegend740168第三荧光微球biolegend740169第四荧光微球biolegend740170第五荧光微球biolegend740171
[0160]
还包括制备t-tau抗体偶联的微球步骤。
[0161]
制备t-tau抗体偶联的微球步骤：取第五荧光微球5
×
106个，加入pbst缓冲液清洗2次，在清洗后的所述第五荧光微球中加入100ug的edc和50ug的nhs放置30分钟以活化微球，加入100ug抗人t-tau抗体在室温旋转反应5小时以清洗微球去除多余抗体，清洗所述第五荧光微球去除多余所述抗人t-tau抗体后加入质量分数为5％的脱脂奶粉封闭30分钟，去除脱脂奶粉后加入ph为7.2的tirs缓冲液保存；
[0162]
取ph为7.2的tirs缓冲液98ml，分别加入aβ1-40、aβ1-42、t-tau、p-tau-181和α-synuclein抗体偶联的微球各0.5ml，配制成所述抗体偶联的微球混合液。
[0163]
(2)制备生物素偶联抗体
[0164]
取抗人aβ1-40抗体、抗人aβ1-42抗体、抗人t-tau抗体、抗人p-tau-181抗体、抗人α-synuclein抗体各100ug，分别按照抗体与生物素的摩尔比为1:30添加生物素，在室温下孵育5小时后，得到所述生物素偶联的抗人aβ1-40抗体、所述生物素偶联的抗人aβ1-42抗体、所述生物素偶联的抗人t-tau抗体、所述生物素偶联的抗人p-tau-181抗体和所述生物素偶联的抗人α-synuclein抗体，用0.01mol/l的pbs溶液分别稀释所述生物素偶联的抗人aβ1-40抗体、所述生物素偶联的抗人aβ1-42抗体、所述生物素偶联的抗人t-tau抗体、所述生物素偶联的抗人p-tau-181抗体和所述生物素偶联的抗人α-synuclein抗体分别至4ug/ml；
[0165]
分别取上述浓度为4ug/ml生物素偶联的抗人aβ1-40抗体、所述生物素偶联的抗人aβ1-42抗体、所述生物素偶联的抗人t-tau抗体、所述生物素偶联的抗人p-tau-181抗体和所述生物素偶联的抗人α-synuclein抗体各25ml混合，配制成所述生物素偶联抗体。则每种生物素标记抗体的浓度为0.8ug/ml。
[0166]
(3)制备校准品，不同浓度的aβ1-40、aβ1-42、t-tau、p-tau-181、α-synuclein蛋白，经样本稀释液稀释至不同浓度后分别冻干，组合得到校准品，用以建立检测时的校准曲线。表9为校准品蛋白aβ1-40、aβ1-42、t-tau、p-tau-181、α-synuclein的厂家、货号来源。
[0167]
表9
[0168]
校准品蛋白厂家货号aβ1-40abcamab120479aβ1-42abcamab120301t-taumilliporesigmat0576p-tau-181abcamab269022
α-synucleinmilliporesigmas7820
[0169]
(4)制备质控品，所述质控品由aβ1-40、aβ1-42、t-tau、p-tau-181、α-synuclein重组蛋白的高值和中值冻干品，以判断检测结果的可靠性。所述质控品蛋白的来源参照表9。
[0170]
(5)sa-pe荧光试剂、制备样本稀释液、制备反应缓冲液、制备洗涤缓冲液(10
×
)的步骤与第四实施例相同，在此不再赘述。
[0171]
第七实施例
[0172]
本实施例提供了第三实施例中试剂盒的具体使用方法，试剂盒的具体使用方法为：
[0173]
向样本管、校准曲线管和质控管中加入25μl反应缓冲液、25μl抗体偶联的微球混合液，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上；
[0174]
向样本管加入样本，向校准曲线管加入校准品，向质控管中加入质控品；
[0175]
向样本管、校准曲线管和质控管中加入25μl生物素偶联抗体；
[0176]
将样本管、校准曲线管和质控管在2-8℃冷藏避光孵育18小时；
[0177]
向样本管、校准曲线管和质控管中加入25ul的sa-pe，室温避光0.5小时；
[0178]
向样本管、校准曲线管和质控管中加入1000μl的1
×
洗涤缓冲液，通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上，然后在300g下离心5分钟，弃掉上清；
[0179]
向样本管、校准曲线管和质控管中加入150μl-300μl的1
×
洗涤缓冲液，通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上，在迈瑞公司生产的bricyte e6流式细胞仪上检测荧光类型和荧光信号强度，具体的检测过程为本领域技术人员的常规技术手段，在此不做赘述。
[0180]
本发明的试剂盒所需样本量少，需25μl血浆即可。
[0181]
图2为本发明实施例抗体偶联的微球的分布情况。参照图2，以侧向散射光(side scatter,ssc)为纵坐标，别藻蓝蛋白(apc)为横坐标。纵坐标确定微球复杂程度位置区间，横坐标区分不同微球所带apc荧光强度，图2可以区分四种结合了aβ1-40、aβ1-42、t-tau、p-tau-181、α-synuclein抗体偶联的微球，其中p1代表本发明实施例aβ1-40抗体偶联的微球的ssc和apc分布，p2代表本发明实施例aβ1-42抗体偶联的微球的ssc和apc分布，p3代表本发明实施例t-tau抗体偶联的微球的ssc和apc分布，p4代表本发明实施例p-tau-181抗体偶联的微球的ssc和apc分布，p5代表本发明实施例α-synuclein抗体偶联的微球的ssc和apc分布。
[0182]
第八实施例
[0183]
本实施例提供第三实施例的试剂盒检测样品中aβ1-40、aβ1-42、t-tau、p-tau-181、α-synuclein的性能评价方法。具体的性能评价方法为：
[0184]
(a)1
×
洗涤缓冲液的配制：
[0185]
①
将10
×
洗涤缓冲液稳定到室温；
[0186]
②
用纯化水将10
×
洗涤缓冲液按1：9比例(1份10
×
洗涤缓冲液加9份纯化水)稀释成1
×
洗涤缓冲液备用。
[0187]
(b)校准品的制备
[0188]
①
向校准品冻干粉中加入1ml样本稀释液，使冻干粉完全溶解；
[0189]
②
室温下静置15分钟，此溶液浓度为最高浓度，将其标记为c1；
[0190]
③
准备11只空管，分别标记为c10、c9、c8、c7、c6、c5、c4、c3、c2、c1、c0；
[0191]
④
每只管中加入75μl样本稀释液，并进行2倍倍比稀释，即取75μl c1溶液到c2中，充分混匀；
[0192]
⑤
同样的方法进行稀释，分别得到c10、c9、c8、c7、c5、c4、c3、c2、c1校准品。c0中只加入样品稀释液。
[0193]
(c)性能评价
[0194]
向样本管、校准曲线管和质控管中加入25μl反应缓冲液、25μl抗体偶联的微球混合液，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上；
[0195]
向样本管加入样本，向校准曲线管加入校准品，向质控管中加入质控品；
[0196]
向样本管、校准曲线管和质控管中加入25μl生物素偶联抗体；
[0197]
将样本管、校准曲线管和质控管在2-8℃冷藏避光孵育18小时；
[0198]
向样本管、校准曲线管和质控管中加入25ul的sa-pe，室温避光0.5小时；
[0199]
向样本管、校准曲线管和质控管中加入1000μl的1
×
洗涤缓冲液，通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上，然后在300g下离心5分钟，弃掉上清；
[0200]
向样本管、校准曲线管和质控管中分别加入150μl-300μl的1
×
洗涤缓冲液，通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上，在迈瑞公司生产的bricyte e6流式细胞仪上检测荧光类型和荧光信号强度。
[0201]
图3为本发明第三实施例的流式荧光检测aβ1-40、aβ1-42、t-tau、p-tau-181和α-synuclein的校准曲线。在流式细胞仪上分别检测aβ1-40、aβ1-42、t-tau、p-tau-181和α-synuclein的不同浓度的校准品，得到图3的校准曲线。
[0202]
(d)线性及空白限评价
[0203]
用接近线性范围上限的高浓度样本稀释成至少5个不同浓度(xi)的样本，每个浓度测试3次，分别求出检测结果的均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以检测结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程，计算线性回归的相关系数(r)。
[0204]
aβ1-40、aβ1-42、t-tau、p-tau-181和α-synuclein空白样本重复检测20次，计算测量结果平均值和标准差sd值，空白限为
[0205]
图4为本发明实施例的aβ1-40的线性评价结果，图5为本发明实施例的aβ1-42的线性评价结果，图6为本发明实施例的t-tau的线性评价结果，图7为本发明实施例的p-tau-181的线性评价结果，图8为本发明实施例的α-synuclein的线性评价结果。参照图4-8，aβ1-40线性回归方程为y＝25.451x+44.431，r2＝0.9988；aβ1-42线性回归方程为y＝1.0269x-2.1728，r2＝0.9994；t-tau线性回归方程为y＝0.9022x+10.331，r2＝0.9958；p-tau-181线性回归方程为y＝0.9944x+0.1521，r2＝0.9994；α-synuclein线性回归方程y＝1.0235x-3.448，r2＝0.9997。
[0206]
采用本发明的试剂盒，可以检测到的aβ1-40线性区间不窄于[9.77,1250]pg/ml，aβ1-42线性区间不窄于[4.88,625]pg/ml，t-tau线性区间不窄于[9.77，1250]pg/ml，p-tau-181线性区间不窄于[1.25,160]pg/ml，α-synuclein线性区间不窄于[250，32000]pg/ml线性区间内，线性相关系数∣r∣不小于0.990。
[0207]
表10为空白限试验(pg/ml)结果。参照表10，aβ1-40、aβ1-42、t-tau、p-tau-181、α-synuclein空白限分别为：1.41pg/ml、0.89pg/ml、0.97pg/ml、0.54pg/ml、21.32pg/ml。可
见，aβ1-40、aβ1-42、t-tau、p-tau-181、α-synuclein的空白限分别不高于2.5pg/ml、2.5pg/ml、1.5pg/mll、1pg/ml、100pg/ml，本发明试剂盒的检测灵敏度高。
[0208]
表10
[0209][0210]
(e)重复性与批间差评价
[0211]
重复性：分别检测高、低两个浓度水平样本的aβ1-40、aβ1-42、t-tau、p-tau-181和α-synuclein样本，各重复检测10次，计算10次结果的平均值x和标准差s，计算变异系数cv。
[0212]
表11为重复性试验(pg/ml)结果，参照表11，aβ1-40、aβ1-42、t-tau、p-tau-181和α-synuclein高值、低值校准品重复性变异系数cv均在10％以内。
[0213]
批间差：取三个批次的试剂盒，分别重复检测同1份参考品，各重复检测10次，计算30次测量结果的平均值x和标准差s，计算变异系数cv。
[0214]
表12为批间差(pg/ml)评价结果，参照表12，aβ1-40、aβ1-42、t-tau、p-tau-181和α-synuclein的3个批次批间差cv均在10％以内。
[0215]
表11
[0216][0217]
表12
[0218][0219][0220]
通过重复性与批间差评价可知，本发明试剂盒具有较好的重复性和批间差，批内实验的变异系数(cv)不大于15％，批间差cv不大于15％。
[0221]
由上述实例可知本发明提供的流式荧光技术的同时检测aβ1-40、aβ1-42、t-tau、p-tau-181、α-synuclein的试剂盒能够用于不同样本中aβ1-40、aβ1-42、t-tau、p-tau-181、α-synuclein浓度的测定，线性范围广、精密度高、特异性好，测定结果稳定。
[0222]
第九实施例
[0223]
本实施例用第一实例中的试剂盒检测ad患者样本与健康样本比对评价。分别选取60-80岁年龄段健康人样本、ad患者样本各20例进行比对分析，
[0224]
图9为本发明实施例中健康人与ad患者的aβ1-40检测量比对图，图10为本发明实施例中健康人与ad患者的aβ1-42检测量比对图，图12为本发明实施例中健康人与ad患者的p-tau181检测量比对图，图14为本发明实施例中健康人与ad患者的aβ1-42/aβ1-40比值的检测量比对图。参照图9、10、12、14，ad患者血液中aβ1-42、aβ1-42/aβ1-40比值的中值分别为：11.7(5.8,22.4)、0.06(0.02,0.11)，健康人血液中aβ1-42、aβ1-42/aβ1-40比值的中值分别为：17.5(11.4,45.6)、0.08(0.06,0.13)，ad患者血液中aβ1-42、aβ1-42/aβ1-40比值的中值较健康人有下降趋势。ad患者血液中p-tau181的中值2.6(0.8,6.6)较健康人血液中p-tau181的中值1.2(0,3.9)有上升趋势。本发明的试剂盒能够同时、且更准确地检测血液中aβ1-40、aβ1-42、p-tau181，更方便临床应用。
[0225]
第十实施例
[0226]
本实施例用第二实例中的试剂盒检测ad患者样本与健康样本比对评价。分别选取60-80岁年龄段健康人样本、ad患者样本各20例进行比对分析，
[0227]
图13为本发明实施例中健康人与ad患者的α-synuclein检测量比对图。参照图9、10、12、13、14，ad患者血液中aβ1-42、aβ1-42/aβ1-40比值的中值分别为：11.7(5.8,22.4)、0.06(0.02,0.11)，健康人血液中aβ1-42、aβ1-42/aβ1-40比值的中值分别为：17.5(11.4,45.6)、0.08(0.06,0.13)，ad患者血液中aβ1-42、aβ1-42/aβ1-40比值较健康人有下降趋势；ad患者血液中p-tau181的中值2.6(0.8,6.6)较健康人血液中p-tau181的中值1.2(0,3.9)有上升趋势，健康人血液中α-synuclein的中值9885.4(4565.6,14862.3)，ad患者血液中α-synuclein与健康人基本持平。本发明的试剂盒能够同时、且更准确地检测aβ1-40、aβ1-42、p-tau181、α-synuclein，更方便临床应用。
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第十一实施例
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图12为本发明实施例中健康人与ad患者的p-tau181检测量比对图，参照图9-14，对于aβ1-42、aβ1-42/aβ1-40比值，ad患者血液中aβ1-42、aβ1-42/aβ1-40比值的中值分别为：11.7(5.8,22.4)、0.06(0.02,0.11)，健康人血液中aβ1-42、aβ1-42/aβ1-40比值的中值分别为：17.5(11.4,45.6)、0.08(0.06,0.13)，ad患者血液中aβ1-42、aβ1-42/aβ1-40比值较健康人有下降趋势；对于p-tau181，ad患者血液中p-tau181的中值2.6(0.8,6.6)较健康人血液中p-tau181的中值1.2(0,3.9)有上升趋势，对于t-tau、α-synuclein，ad患者血液中t-tau、α-synuclein的中值分别为：5.6(2.5,9.8)、9763.1(4565.6,14667.7)，健康人血液中t-tau、α-synuclein的中值分别为5.3(2.6,7.9)、9885.4(4565.6,14862.3)，ad患者血液中t-tau、α-synuclein与健康人基本持平。本发明的试剂盒能够同时、且更准确地检测aβ1-40、aβ1-42、t-tau、p-tau181、α-synuclein，更方便临床应用。
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虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。