一种磷酸奥司他韦起始物料中有关物质检测方法与流程

1.本发明属于药物分析化学领域，涉及一种磷酸奥司他韦起始物料5-(戊烷-3-基氧基)7-氧代-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-羧酸乙酯(c10-sm1)及其杂质的检测方法。


背景技术：

[0002]
磷酸奥司他韦，化学名：(3r,4r,5s)-4-乙酰氨基-5-氨基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸乙酯磷酸盐，其化学结构式为：
[0003][0004]
磷酸奥司他韦(oseltamivir phosphate)是一种神经氨酸酶抑制剂，可通过抑制流感病毒神经氨酸酶的活性，阻止病毒从感染细胞中释放，从而达到控制目的，其对甲型、乙型流感、h5n1、h9n2等亚型流感病毒引起的流行性感冒有治疗和预防的作用。该药于1999年获得美国fda批准上市，商品名为达菲。磷酸奥司他韦是目前国际上预防和治疗流感的主选用药，主要适应症包括用于成人和1岁及1岁以上儿童的甲型和乙型流感治疗、用于成人和13岁及13岁以上青少年的甲型和乙型流感预防。同时，奥司他韦是fda批准的唯一一个可用于超过14天新生儿流感治疗药物。
[0005]
roche-basel公司工艺路线(organic process research&development 2004,8,86-91),以5-(戊烷-3-基氧基)7-氧代-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-羧酸乙酯(c10-sm1)为起始物料，用氯化镁作络合剂，叔丁胺开环，甲磺酰氯为活化剂活化后关环，二烯丙胺开环，上乙酰基，脱叔丁基，脱烯丙基后与磷酸成盐得到磷酸奥司他韦。
[0006][0007]
由以上路线可知，环氧化合物5-(戊烷-3-基氧基)7-氧代-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-羧酸乙酯为合成磷酸奥司他韦关键起始物料，其杂质成分及含量对磷酸奥司他韦药物的杂质影响较大，同时极大地影响用药安全；因此，通过定向制备5-(戊烷-3-基氧基)7-氧代-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-羧酸乙酯的目标杂质，建立相应分析方法，对原料药起始物料质量进行控制，能够保障磷酸奥司他韦原料及制剂质量，从而保障用药安全。


技术实现要素：

[0008]
5-(戊烷-3-基氧基)7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-羧酸乙酯(c10-sm1)目前的成熟工艺路线如下：
[0009][0010]
其可能引入的杂质主要为起始物料c10-sm1-zz4及中间体c10-sm1-zz1、c10-sm1-zz3；c10-sm1-zz3异构体杂质c10-sm1-zz2，c10-sm1的光学异构体c10-sm1-zz5，3-戊酮中可能存在2-丁酮从而衍生的杂质c10-sm1-zz9以及c10-sm1-zz1活化的磺酸酯的水解杂质c10-a-zz1。
[0011]
本发明提供了针对磷酸奥司他韦起始物料环氧化合物5-(戊烷-3-基氧基)7-氧代-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-羧酸乙酯(即c10-sm1)及其相关杂质的检测方法。特别是提供针对包含c10-sm1-zz9在内的7个工艺杂质的检测、定量测定的有效的方法；其中杂质c10-sm1-zz9衍生成原料药磷酸奥司他韦成品中的杂质c10-zzf(ep9.0中的杂质f)，故对其控制可有效控制成品质量。
[0012]
在本发明的技术方案中，本发明提供了磷酸奥司他韦起始物料环氧化合物5-(戊烷-3-基氧基)7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-羧酸乙酯(即c10-sm1)及其相关杂质(即有关物质)的检测方法，所述的检测方法包括如下步骤：
[0013]
(1)采用反相高效液相色谱法，并设置色谱条件如下：
[0014]
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶液相色谱柱(c8)；
[0015]
检测器：紫外检测器vwd；
[0016]
检测波长：195～215nm；
[0017]
流速：0.5～1.5ml/min；
[0018]
柱温：20～40℃；
[0019]
进样量：10～50μl；
[0020]
稀释剂：乙腈；
[0021]
流动相a：纯化水；
[0022]
流动相b：乙腈；
[0023]
洗脱方式为梯度洗脱，线性洗脱的程序如下：
[0024]
时间(分钟)流动相a(体积％)流动相b(体积％)0～1070～5530～4510～35554535～3655～2045～8036～412080
41～4220～7080～3042～487030
[0025]
(2)制备系统适用性溶液：分别取杂质c10-sm1-zz1、c10-sm1-zz2、c10-sm1-zz3、c10-sm1-zz4、c10-sm1-zz5、c10-sm1-zz9、c10-a-zz1对照品加稀释剂配制成杂质储备液，然后取供试品和杂质储备液用稀释剂配制成系统适用性溶液；
[0026]
(3)制备供试品溶液：取供试品(即磷酸奥司他韦起始物料环氧化合物5-(戊烷-3-基氧基)7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-羧酸乙酯(即c10-sm1))适量，加稀释剂溶解并制成供试品溶液；
[0027]
(4)制备自身对照溶液：取供试品溶液适量，用稀释剂稀释100～1000倍制成自身对照溶液；
[0028]
(5)测定方法：分别精密量取系统适用性溶液、供试品溶液和自身对照溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，从中读取杂质的以下至少一个信息：杂质数量、杂质种类，杂质各色谱峰之间的分离度、各色谱峰的峰面积；
[0029]
(6)按照步骤(5)读取的杂质信息，按照加校正因子的主成分自身对照法进行计算各杂质的含量；
[0030]
(7)各杂质含量计算公式为：步骤(3)供试品溶液中该杂质的峰面积/步骤(4)自身对照溶液的峰面积/步骤(4)供试品溶液的稀释倍数
×
各杂质校正因子；各杂质校正因子分别如下，c10-sm1-zz1：1.45，c10-sm1-zz2：1.22，c10-sm1-zz3：1.21，c10-sm1-zz4：1.07，c10-sm1-zz5：1.00，c10-sm1-zz9：0.96，c10-a-zz1：1.16；
[0031]
所述的稀释剂为乙腈。
[0032]
在本发明的技术方案中，所述c10-sm1有关物质或杂质如下表所示：
[0033][0034]
在上述技术方案步骤(3)中，所述供试品溶液其浓度为0.1mg/ml～10mg/ml，优选地为2～5mg/ml，更优选地为3mg/ml。
[0035]
在上述技术方案步骤(4)中，所述自身对照溶液浓度可使用供试品溶液稀释100倍或者1000倍进行配制，优选稀释100倍。
[0036]
在上述技术方案步骤(2)中，所述的系统适用性溶液c10-sm1浓度为3mg/ml，杂质c10-sm1-zz1，c10-sm1-zz2，c10-sm1-zz3，c10-sm1-zz4，c10-sm1-zz5，c10-sm1-zz9和c10-a-zz1浓度均为3μg/ml的溶液。
[0037]
在上述技术方案步骤(1)中，所述色谱柱柱温为20～40℃，优选柱温为25～35℃，更优选柱温为30℃。
[0038]
在上述技术方案步骤(1)中，所述高效液相色谱法中流动相的流速0.5ml/min～1.5ml/min，优选流速为0.8～1.2ml/min，更优选流速为1.0ml/min。
[0039]
在上述技术方案步骤(1)中，所述高效液相色谱法中检测器的检测波长为195nm～215nm，优选检测波长为207nm。
[0040]
在上述技术方案步骤(1)中，所述进样量为10～50μl，优选进样量为10μl。
[0041]
上述技术方案中，所述的c10-sm1的保留时间为20～28min，优选c10-sm1的保留时间为23～25min。
[0042]
本发明的有益效果主要体现在：本发明方法简单有效、重现性好、灵敏度高，能同时检测c10-sm1及其7个有关物质杂质，其中c10-sm1-zz9的检测可有效控制磷酸奥司他韦成品中杂质e含量，间接对磷酸奥司他韦原料药及相关制剂的质量控制具有重要意义。
附图说明
[0043]
图1系统适用性溶液的分离色谱图
[0044]
图2供试品的液相色谱图1
[0045]
图3供试品的自身对照色谱图
[0046]
图4供试品及各杂质的lod图
[0047]
图5供试品及各杂质的loq图
[0048]
图6精密度实验供试品的液相色谱图
[0049]
图7精密度实验供试品的自身对照色谱图
具体实施例
[0050]
通过以下实例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不仅仅限于此。
[0051]
以下各实施例使用的试剂可从市场上容易购得。
[0052]
检测方法参照高效液相法(中国药典2015年版四部通则0512)测定。
[0053]
实施例1供试品中主成分及其有关物质杂质的分离测定
[0054]
1、设备及方法：
[0055]
仪器：反相高效液相色谱仪
[0056]
检测器：紫外检测器，检测波长为207nm；
[0057]
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶液相色谱柱(agilent zorbax sb-c8，4.6
×
250mm，5μm)；
[0058]
流速：1.0ml/min
[0059]
柱温：30℃
[0060]
进样量：10μl
[0061]
稀释剂：乙腈
[0062]
流动相a：纯化水；流动相b：乙腈
[0063]
按下表进行梯度洗脱，洗脱条件：
[0064]
时间(分钟)流动相a(体积％)流动相b(体积％)07030105545
355545362080412080427030487030
[0065]
2、溶液配制：
[0066]
空白溶液：乙腈，即稀释剂。
[0067]
杂质储备液：称取各有关物质杂质对照品适量，置适当量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得0.3mg/ml杂质储备液。
[0068]
杂质混合溶液：取各杂质储备液5ml置同一50ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得30μg/ml杂质混合溶液。
[0069]
系统适用性溶液：称取供试品约30mg，置10ml量瓶中，精密加入杂质混合溶液1ml，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0070]
供试品溶液：称取供试品(磷酸奥司他韦起始物料环氧化合物5-(戊烷-3-基氧基)7-氧代-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-羧酸乙酯(即c10-sm1)，下同)约30mg，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得3mg/ml溶液。
[0071]
自身对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0072]
3、分离测定方法
[0073]
精密量取上述空白溶液、系统适用性溶液、供试品溶液、自身对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定结果见下表，色谱图分别如图1～图3所示。
[0074]
实验结果：
[0075]
杂质名称相对保留时间分离度理论塔板数c10-a-zz10.48\21745c10-sm1-zz40.555.8226827c10-sm1-zz90.739.7716496c10-sm1-zz20.823.9721249c10-sm1-zz10.913.5220015c10-sm11.003.3116035c10-sm1-zz51.133.8617449c10-sm1-zz31.202.1517387
[0076]
上述检测结果显示主峰与相邻杂质峰之间，各相邻已知杂质间的分离度大于1.5，空白溶液、c10-sm1及其他杂质不干扰检测，表明该方法专属性较好。
[0077]
实施例2
[0078]
设备及方法：
[0079]
仪器：反相高效液相色谱仪
[0080]
检测器：紫外检测器，检测波长为207nm；
[0081]
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶液相色谱柱(agilent zorbax sb-c8，4.6
×
250mm，5μm)；
[0082]
流速：1.0ml/min
[0083]
柱温：30℃
[0084]
进样量：10μl
[0085]
稀释剂：乙腈
[0086]
流动相a：纯化水；流动相b：乙腈
[0087]
按下表进行梯度洗脱，洗脱条件：
[0088]
时间(分钟)流动相a(体积％)流动相b(体积％)07030105545355545362080412080427030487030
[0089]
1、定量限和检测限
[0090]
杂质储备液2：分别量取实施例1下的各杂质储备液(0.3mg/ml)1ml置100ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得3μg/ml溶液。
[0091]
c10-sm1储备液：称取c10-sm1对照品适量，置适当量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得0.3mg/ml杂质储备液；精密量取1ml杂质储备液1置100ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得3μg/ml c10-sm1储备液。
[0092]
定量限溶液：精密量取上述杂质储备液2中的c10-sm1-zz1储备液6ml，c10-sm1-zz2储备液10ml，c10-sm1-zz3储备液6ml，c10-sm1-zz4储备液3ml，c10-sm1-zz5储备液6ml，c10-sm1-zz9储备液4ml，c10-a-zz1储备液2ml，c10-sm1储备液6ml，置同一50ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。(相当于供试品浓度的0.0045％～0.0152％)
[0093]
检测限溶液：精密量取8ml定量限溶液置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。(相当于供试品浓度的0.0018％～0.0061％)
[0094]
精密量取上述检测限、定量限溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定结果见下表，色谱图分别如图4和图5所示。
[0095]
杂质名称检测限信噪比(s/n)检测量(％)定量限信噪比(s/n)定量量(％)c10-a-zz18.10.001818.80.0045c10-sm1-zz416.20.002327.70.0058c10-sm1-zz910.60.003325.50.0084c10-sm1-zz214.90.006135.80.0152c10-sm1-zz17.70.004619.40.0116c10-sm111.00.005026.00.0124c10-sm1-zz59.20.004220.20.0105c10-sm1-zz38.10.005418.50.0136
[0096]
备注：检出量和定量量均使用相当于样品浓度的百分比计算。
[0097]
上述结果表明：各杂质的最低检出量为0.0061％，各杂质的定量限检出最低浓度
为0.0152％，杂质限度均为0.1％；故检测限、定量限能够满足要求。
[0098]
2、重复性实验
[0099]
空白溶液：乙腈，即稀释剂。
[0100]
供试品溶液：称取供试品约30mg，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得3mg/ml溶液。平行配制6份
[0101]
自身对照溶液：精密量取各供试品溶液1ml，分别置不同的100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0102]
精密量取上述空白溶液、各供试品溶液、各自身对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定结果见下表，色谱图分别如图2～3和图6～7所示。
[0103][0104]
备注：n.d表示未检出，n.a表示不适用。
[0105]
实施例3
[0106]
1、设备及方法：
[0107]
仪器：反相高效液相色谱仪
[0108]
检测器：紫外检测器，检测波长为207nm；
[0109]
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶液相色谱柱(agilent zorbax sb-c8，4.6
×
250mm，5μm)；
[0110]
流速：0.9ml/min
[0111]
柱温：30℃
[0112]
进样量：10μl
[0113]
稀释剂：乙腈
[0114]
流动相a：纯化水；流动相b：乙腈
[0115]
按下表进行梯度洗脱，洗脱条件：
[0116][0117][0118]
2、溶液配制：
[0119]
空白溶液：乙腈，即稀释剂。
[0120]
杂质储备液：称取各有关物质杂质对照品适量，置适当量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得0.3mg/ml杂质储备液；
[0121]
杂质混合溶液：取各杂质储备液5ml置同一50ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得30μg/ml杂质混合溶液。
[0122]
系统适用性溶液：称取供试品约30mg，置10ml量瓶中，精密加入杂质混合溶液1ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0123]
供试品溶液：称取供试品约30mg，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得3mg/ml溶液。
[0124]
自身对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0125]
3、分离测定方法
[0126]
精密量取上述空白溶液、系统适用性溶液、供试品溶液、自身对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；实验结果：空白溶液、c10-sm1及其他杂质均不干扰检测，各有关物质之间的分离度良好。
[0127]
实施例4
[0128]
1、设备及方法：
[0129]
仪器：反相高效液相色谱仪
[0130]
检测器：紫外检测器，检测波长为207nm；
[0131]
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶液相色谱柱(agilent zorbax sb-c8，4.6
×
250mm，5μm)；
[0132]
流速：1.1ml/min
[0133]
柱温：30℃
[0134]
进样量：10μl
[0135]
稀释剂：乙腈
[0136]
流动相a：纯化水；流动相b：乙腈
[0137]
按下表进行梯度洗脱，洗脱条件：
[0138][0139][0140]
2、溶液配制：
[0141]
空白溶液：乙腈，即稀释剂。
[0142]
杂质储备液：称取各有关物质杂质对照品适量，置适当量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得0.3mg/ml杂质储备液；
[0143]
杂质混合溶液：取各杂质储备液5ml置同一50ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得30μg/ml杂质混合溶液。
[0144]
系统适用性溶液：称取供试品约30mg，置10ml量瓶中，精密加入杂质混合溶液1ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0145]
供试品溶液：称取供试品约30mg，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得3mg/ml溶液。
[0146]
自身对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0147]
3、分离测定方法
[0148]
精密量取上述空白溶液、系统适用性溶液、供试品溶液、自身对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；实验结果：空白溶液、c10-sm1及其他杂质均不干扰检测，各有关物质之间的分离度良好。
[0149]
实施例5
[0150]
1、设备及方法：
[0151]
仪器：反相高效液相色谱仪
[0152]
检测器：紫外检测器，检测波长为207nm；
[0153]
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶液相色谱柱(agilent zorbax sb-c8，4.6
×
250mm，5μm)；
[0154]
流速：1.0ml/min
[0155]
柱温：25℃
[0156]
进样量：10μl
[0157]
稀释剂：乙腈
[0158]
流动相a：纯化水；流动相b：乙腈
[0159]
按下表进行梯度洗脱，洗脱条件：
[0160]
时间(分钟)流动相a(体积％)流动相b(体积％)07030
105545355545362080412080427030487030
[0161]
2、溶液配制：
[0162]
空白溶液：乙腈，即稀释剂。
[0163]
杂质储备液：称取各有关物质杂质对照品适量，置适当量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得0.3mg/ml杂质储备液；
[0164]
杂质混合溶液：取各杂质储备液5ml置同一50ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得30μg/ml杂质混合溶液。
[0165]
系统适用性溶液：称取供试品约30mg，置10ml量瓶中，精密加入杂质混合溶液1ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0166]
供试品溶液：称取供试品约30mg，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得3mg/ml溶液。
[0167]
自身对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0168]
3、分离测定方法
[0169]
精密量取上述空白溶液、系统适用性溶液、供试品溶液、自身对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；实验结果：空白溶液、c10-sm1及其他杂质均不干扰检测，各有关物质之间的分离度良好。
[0170]
实施例6
[0171]
1、设备及方法：
[0172]
仪器：反相高效液相色谱仪
[0173]
检测器：紫外检测器，检测波长为207nm；
[0174]
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶液相色谱柱(agilent zorbax sb-c8，4.6
×
250mm，5μm)；
[0175]
流速：1.0ml/min
[0176]
柱温：35℃
[0177]
进样量：10μl
[0178]
稀释剂：乙腈
[0179]
流动相a：纯化水；流动相b：乙腈
[0180]
按下表进行梯度洗脱，洗脱条件：
[0181]
时间(分钟)流动相a(体积％)流动相b(体积％)07030105545355545362080
412080427030487030
[0182]
2、溶液配制：
[0183]
空白溶液：乙腈，即稀释剂。
[0184]
杂质储备液：称取各有关物质杂质对照品适量，置适当量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得0.3mg/ml杂质储备液；
[0185]
杂质混合溶液：取各杂质储备液5ml置同一50ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得30μg/ml杂质混合溶液。
[0186]
系统适用性溶液：称取供试品约30mg，置10ml量瓶中，精密加入杂质混合溶液1ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0187]
供试品溶液：称取供试品约30mg，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得3mg/ml溶液。
[0188]
自身对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0189]
3、分离测定方法
[0190]
精密量取上述空白溶液、系统适用性溶液、供试品溶液、自身对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；实验结果：空白溶液、c10-sm1及其他杂质均不干扰检测，各有关物质之间的分离度良好。