一种夏枯草或其革糖提取物中同时检测咖啡酸与迷迭香酸的方法与应用与流程

本发明涉及一种药品、保健品、食品或化妆品的质量分析方法，特别涉及一种夏枯草或其革糖提取物中同时检测咖啡酸与迷迭香酸的方法与应用。

背景技术：

1、夏枯草为唇形科(lamiaceae)植物夏枯草prunella vulgaris l.的干燥果穗，始载于《神农本草经》，因“此草夏至后即枯”而得名，是一种药食同源的多年生草本植物，至今已有几千年的药用历史，现收载于2015年版之《中国药典》。夏枯草味苦、辛，性寒，归肝、胆经，可清肝散火、明目、散结消肿，对目赤肿痛、畏光流泪、目珠夜痛、头晕目眩、瘰疬、瘿瘤、乳腺癌、高血压、淋巴结核、浸润性肺结核、单纯性甲状腺肿、腮腺炎、急性黄疸型传染性肝炎等多种疾病均有良好的临床治疗效果。现代研究表明，夏枯草中含有多种化学成分：包括三萜、甾醇、黄酮、有机酸、苯丙素等类型化合物.具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫调节、降血压、降血糖、降血脂等药理作用。革糖素，是一种白睡莲花提取物，是护肤品领域的一种有效抗糖成分，目前主要靠进口，资源稀少，价格较贵。夏枯草中含有较丰富的苯丙素类成分，不仅是有效抗糖成分，且资源丰富；夏枯草中的苯丙素类成分含量较高的是迷迭香酸成分，其次是咖啡酸成分。从夏枯草中提取苯丙素类成分迷迭香酸与咖啡酸，制成革糖提取物，不失为替代珍贵的革糖素的有效方法。

2、

3、迷迭香酸、咖啡酸均含有邻二酚羟基，具有较好的抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎活性，对糖化自由基有较好的清除作用，是天然的革糖成分。从夏枯草中检测迷迭香酸、咖啡酸的成分已有一些报道，对夏枯草及其制剂中的迷迭香酸、咖啡酸同时测定的方法也有报道，如“反相高效液相色谱法测定不同煎煮时间夏枯草中丹参素、咖啡酸、迷迭香酸含量”[中国中医药信息杂志，2020，27(2):64-67]，但其测定方法中均采用了流动相梯度洗脱法，其梯度洗脱的测定方法相对繁锁，且重现性与稳定性相对较差。目前，夏枯草及其革糖提取物中的咖啡酸与迷迭香酸成分的tlc同时检测的方法未见报道，夏枯草及其革糖提取物中的咖啡酸与迷迭香酸成分的用恒流洗脱的hplc同时检测的方法也未见报道；通过其革糖提取物的制备，发现其具有革糖作用的咖啡酸成分显著提高的发现更未见报道。

技术实现思路

1、本发明的首要目的是针对夏枯草及其革糖提取物的上述缺限，首次实现了夏枯草及其革糖提取物中的咖啡酸与迷迭香酸成分的tlc同时检测的检测方法，本发明同样也首次创立了夏枯草及其革糖提取物中的咖啡酸与迷迭香酸成分用恒流洗脱的hplc同时测定的检测方法，从而提供一种具有准确度和精密度高、稳定性和重复性好的夏枯草或其革糖提取物中同时检测咖啡酸与迷迭香酸的方法。

2、本发明的另一目的在于提供上述夏枯草或其革糖提取物中同时检测咖啡酸与迷迭香酸的方法的应用。

3、本发明的目的通过下述技术方案实现：

4、一种夏枯草或其革糖提取物中同时检测咖啡酸与迷迭香酸的方法，包括如下步骤：利用薄层色谱法对夏枯草或其革糖提取物中咖啡酸与迷迭香酸同时进行定性鉴别；利用特定的极性溶剂提取法直接提取咖啡酸与迷迭香酸，再以咖啡酸与迷迭香酸混合对照品对照，用高效液相色谱法对夏枯草或其革糖提取物中的咖啡酸与迷迭香酸同时进行含量测定。

5、所述的革糖提取物优选通过如下步骤制备得到：

6、(i)苯丙素类成分及粗多糖的提取：以夏枯草药材(夏枯草的干燥果穗)为原料，水提，得到夏枯草含苯丙素类成分及粗多糖的提取液；

7、(ii)含苯丙素类成分及粗多糖提取液的浓缩：将步骤(i)得到的提取液进行浓缩，得到浓缩液；

8、(iii)夏枯草革糖提取物与夏枯草粗多糖分离制备：将浓缩液和乙醇混合均匀，得到溶液a，溶液a中含醇量为65～75％；将溶液a冷藏静置，抽滤或过滤，得到夏枯草粗多糖滤取物与夏枯草革糖提取物乙醇滤液；

9、(iv)夏枯草革糖提取物的制备：取夏枯草革糖提取物乙醇滤液，浓缩，得到夏枯草革糖提取物。

10、步骤(i)中所述的夏枯草药材是经过净选和干燥得到的夏枯草药材。

11、步骤(i)中所述的水提的步骤优选如下：用水浸泡夏枯草药材后，煎煮回流，取煎煮液。

12、所述的水优选为纯化水。

13、所述的浸泡的时间优选为1～2h。

14、所述的煎煮回流的次数优选为3～4次；更优选为3次。

15、所述的水提的具体步骤优选如下：加入相当于药材质量18～20倍质量的水，煎煮1～1.5h；重复前述步骤2～3次；第一次煎煮是对浸泡后的夏枯草药材进行煎煮，重复煎煮是对药渣进行煎煮；将每次煎煮得到的煎煮液过滤后合并，或是合并后过滤；更优选如下：第一次煎煮是加入相当于药材质量20倍质量的水，煎煮1.5h；重复煎煮是加入相当于药材质量18倍质量的水，煎煮1h。

16、所述的过滤优选为使用250～400目滤网过滤；更优选为使用350目滤网过滤。

17、所述的过滤优选为每次煎煮得到的煎煮液保温趁热过滤。

18、步骤(ii)中所述的浓缩的方式优选为减压浓缩。

19、步骤(ii)中所述的浓缩的程度优选为浓缩至相对密度为1.39-1.88(70-80℃热测)或是浓缩至每3ml溶液相当于0.9～1.1g夏枯草药材时停止浓缩；更优选为浓缩至相对密度为1.6-1.7(70-75℃热测)或是浓缩至每3ml溶液相当于1g夏枯草药材时停止浓缩。

20、步骤(ii)中所述的浓缩液的干固物含量为0.060～0.066g/ml；总干固物含量为15～20％。

21、步骤(iii)中所述的溶液a的含醇量优选为体积百分比70％。

22、步骤(iii)中所述的冷藏静置的温度优选为2～8℃；更优选为4～6℃。

23、步骤(iii)中所述的冷藏静置的时间优选为36～60小时；更优选为48小时。

24、步骤(iii)中所述的抽滤为减压抽滤。

25、步骤(iii)中所述的过滤为离心过滤。

26、步骤(iii)中所述的抽滤或过滤使用的滤器优选规格为350-800目的滤器；更优选为600目的滤器。

27、步骤(iv)中所述的浓缩的方式优选为减压浓缩，可以回收乙醇。

28、步骤(iv)中所述的浓缩的程度优选为浓缩至相对密度为1.10-1.20(60-70℃热测)或是浓缩后的体积为每2ml溶液相当于1g夏枯草药材时停止浓缩。

29、步骤(iv)中所述的夏枯草革糖提取物的干固物含量为0.0420-0.0460g/ml；总干固物含量即夏枯草革糖提取物中的干固物占夏枯药材的含量为7.6-9.6％(g/g)。

30、所述的薄层色谱检测法的具体步骤如下：

31、(1)供试品溶液的制备：

32、1)夏枯草供试品溶液的制备：

33、a、将夏枯草粉末加入甲醇水溶液中超声提取，过滤，得到的滤液除去溶剂，得到残渣；

34、b、残渣用甲醇溶解，过滤，得到夏枯草供试品溶液；

35、2)夏枯草革糖提取物供试品溶液的制备：

36、a、取夏枯草革糖提取物，除去溶剂，得到残渣；

37、b、残渣用甲醇溶解，过滤，得到夏枯草革糖提取物供试品溶液；

38、(2)对照品溶液的制备：用甲醇溶解咖啡酸和迷迭香酸对照品，得到咖啡酸和迷迭香酸混合溶液，作为对照品溶液；

39、(3)薄层色谱(tlc)检测：吸取供试品溶液和对照品溶液分别点于同一高效硅胶gf254薄层板上，用展开剂展开，取出，晾干；

40、(4)观察硅胶gf254薄层板：分别置紫外光灯254nm与紫外光灯365nm下检识；观察供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上是否存在相同颜色的斑点，即可鉴定出夏枯草或其革糖提取物中是否含有咖啡酸与迷迭香酸成分。

41、步骤(1)1)a中所述的夏枯草粉末优选为通过如下步骤得到：将夏枯草粉碎，过至少40目筛，得到夏枯草粉。

42、所述的筛优选为40-50目的筛。

43、步骤(1)1)a中所述的甲醇水溶液中甲醇的含量优选为体积百分比40～60％；更优选体积百分比50％。

44、步骤(1)1)a中所述的甲醇水溶液的用量优选按2.0～4.0g夏枯草粉配比100～200ml甲醇水溶液计算；更优选按2.5g夏枯草粉配比100ml甲醇水溶液计算。

45、步骤(1)1)a中所述的超声提取的条件优选为于功率50～200w、频率40～60khz提取20～80分钟；更优选为于功率80～150w、频率45～50khz提取30～60分钟；最优选为于功率150w、频率45khz提取45分钟。

46、步骤(1)1)a所述的过滤可通过滤纸过滤，也可以通过滤膜过滤。

47、所述的滤膜优选为0.45μm滤膜。

48、步骤(1)1)a中所述的除去溶剂优选为通过水浴加热蒸发方式除去溶剂。

49、步骤(1)1)b中所述的甲醇的用量优选按2.0～4.0g夏枯草粉末配比2～4ml甲醇计算；更优选按2.5g夏枯草粉末配比2ml甲醇水溶液计算。

50、步骤(1)1)b中所述的过滤优选为使用0.45μm的滤膜过滤。

51、步骤(1)2)a中所述的除去溶剂优选为通过水浴加热蒸发方式除去溶剂。

52、步骤(1)2)b中所述的甲醇的用量优选按相当于夏枯草药材量2.0-4.0g的夏枯草革糖提取物配比2～4ml甲醇计算；更优选按2.5g夏枯草药材的夏枯草革糖提取物配比2ml甲醇水溶液计算。

53、步骤(1)2)b中所述的过滤优选为使用0.45μm的滤膜过滤。

54、步骤(2)中所述的对照品溶液中咖啡酸的浓度优选为0.20～0.21mg/ml；迷迭香酸的浓度优选为0.98～1.0mg/ml。

55、步骤(3)中所述的供试品溶液的用量为4～10μl；更优选为6μl。

56、步骤(3)中所述的对照品溶液的用量为4～10μl；更优选为6μl。

57、步骤(3)中所述的展开剂优选为甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲酸溶液；更优选为按体积比6.4～6.6:1.9～2.1:0.9～1.1:0.4～0.6混合得到的甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲酸溶液；最优选为按体积比6.5:2.0:1.0:0.5混合得到的甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲酸溶液。

58、夏枯草及其革糖提取物的tlc检测结果：在紫外光灯(254nm)下检识：夏枯草及其革糖提取物的供试品色谱中，在与对照品咖啡酸与迷迭香酸色谱相应的位置上，显相同的荧光淬灭斑点；在置紫外光灯(365nm)下检视：夏枯草及其革糖提取物的供试品色谱中，在与对照品咖啡酸与迷迭香酸色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。在夏枯草与夏枯草革糖提取物的供试品tlc色谱比较时，在相同的样品量及色谱条件下，夏枯草革糖提取物样品与夏枯草样品的色谱图存在明显差异，夏枯草革糖提取物样品中的咖啡酸的斑点明显大于夏枯草样品咖啡酸的斑点。

59、所述的特定的极性溶剂提取法是以体积百分比45-55％的甲醇水溶液直接提取咖啡酸与迷迭香酸，能有效地提取咖啡酸与迷迭香酸。

60、所述的甲醇水溶液优选体积百分比50％的甲醇水溶液。

61、所述的高效液相色谱检测法的具体步骤如下：

62、1)色谱条件：色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-甲醇-0.2％(v/v)乙酸水溶液为流动相，检测波长为330nm；理论板数按咖啡酸与迷迭香酸峰计算应不低于10000；

63、2)对照品溶液的制备：精密称定咖啡酸和迷迭香酸对照品，用甲醇水溶液溶解并定容，得到咖啡酸和迷迭香酸混合的对照品溶液；

64、3)供试品溶液的制备：

65、①夏枯草供试品溶液的制备：取夏枯草粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇水溶液，精密称重，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得夏枯草供试品溶液；

66、②夏枯草革糖提取物供试品溶液的制备：取夏枯草革糖提取物，精密量取，先用甲醇调整至所得溶液与甲醇水溶液的浓度相同；再加入甲醇水溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得夏枯草革糖提取物供试品溶液；

67、4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱议，测定，即得。

68、步骤1)中所述的流动相优选为乙腈、甲醇和0.2％(v/v)乙酸水溶液按体积比14-16:11-13:72-74配比得到；更优选为乙腈、甲醇和0.2％(v/v)乙酸水溶液按体积比15:12:73配比得到。

69、步骤1)中所述的色谱中的色谱柱优选为ultimate xb-c18色谱柱。

70、步骤1)中所述的色谱中的柱温为24-27℃；更优选为25℃。

71、步骤1)中所述的流动相的流速优选为0.8-1.2ml/min；更优选为1ml/min。

72、步骤2)中所述的甲醇水溶液优选浓度为体积百分比45-55％的甲醇水溶液；更优选浓度为体积百分比50％的甲醇水溶液。

73、步骤2)中所述的对照品溶液中每lml含0.005-0.006mg咖啡酸、0.05-0.06mg迷迭香酸。

74、步骤3)①中所述的夏枯草粉末优选为通过如下步骤得到：将夏枯草粉碎，过至少40目筛，得到夏枯草粉。

75、步骤3)①中所述的甲醇水溶液优选浓度为体积百分比45-55％的甲醇水溶液；更优选浓度为体积百分比50％的甲醇水溶液。

76、步骤3)①中所述的甲醇水溶液的用量优选按每1.0-3.0g夏枯草粉配比100-300ml甲醇水溶液计算；更优选按每1.5g夏枯草粉末配比100ml甲醇水溶液计算。

77、步骤3)①中所述的超声的条件优选为功率500-700w、频率30-50khz处理40-80分钟；更优选为于功率600w、频率40khz处理30-60分钟。

78、步骤3)②中所述的甲醇水溶液优选浓度为体积百分比45-55％的甲醇水溶液；更优选浓度为体积百分比50％的甲醇水溶液。

79、步骤3)②中所述的夏枯草革糖提取物供试品溶液的浓度优选按夏枯草药材计为1.4-1.6g/100ml；更优选为1.5g/100ml。

80、步骤4)中所述的对照品溶液的吸取体积和所述的供试品溶液的吸取体积优选按体积比1：1配比。

81、所述的对照品溶液的吸取体积优选为10μl。

82、所述的供试品溶液的吸取体积优选为10μl。

83、夏枯草按干燥品计算，夏枯草中含咖啡酸(c9h8o4)不得少于0.010％；含迷迭香酸(c18h1608)不得少于0.20％；夏枯草革糖提取物按对应的夏枯草干燥品量计算，夏枯草革糖提取物中含咖啡酸(c24h26o13)不得少于0.020％；含迷迭香酸(c18h1608)不得少于0.18％。

84、通过夏枯草及其革糖提取物的hplc图谱比较，以相同量的夏枯草干品计，夏枯草革糖提取物hplc图中的咖啡酸的吸收峰高与峰面积明显高于夏枯草hplc图中的咖啡酸的吸收峰高与峰面积；通过本研究的咖啡酸与迷迭香酸成分的hplc同时测定方法的检测，夏枯草革糖提取物中具有革糖作用的咖啡酸成分的含量显著提高，以相同量的夏枯草干品计，咖啡酸含量提高了一倍以上。

85、所述的夏枯草或其革糖提取物中同时检测咖啡酸与迷迭香酸的方法在夏枯草及其革糖提取物和其化妆品及其制品开发中的应用。

86、夏枯草是我国药典收载的一种药食同源的常见药味，其野生与种植资源十分丰富，但由于夏枯草在革糖作用方面未被开发利用，致使夏枯草及其革糖提取物在革糖质量方面的控制还是空白；本发明的利用有如下的有益效果：

87、1、本发明首次实现了夏枯草及其革糖提取物中的咖啡酸与迷迭香酸成分的tlc同时检测的检测方法，为夏枯草及其革糖提取物开发利用提供了方法和依据；

88、2、本发明首次创立了夏枯草及其革糖提取物中的咖啡酸与迷迭香酸成分用恒流洗脱的hplc同时测定的检测方法，为夏枯草及其革糖提取物的化妆品、保健与药用的质量控制提供了依据；

89、3、本发明提供的夏枯草及其革糖提取物中咖啡酸与迷迭香酸同时测定的检测方法，具有准确度和精密度高、稳定性和重复性好等特点。克服了其梯度洗脱的测定方法相对繁锁，且重现性与稳定性相对较差的不足。

90、4、本发明的检测方法发现：通过夏枯草革糖提取物的制备，发现其具有革糖作用的咖啡酸成分显著提高，为夏枯草革糖提取物在化妆品、食用、保健或药用价值的开发和利用提供方法和依据。