用于乳腺癌HER2-ECD检测的电致化学发光能量共振转移适体传感器

用于乳腺癌her2-ecd检测的电致化学发光能量共振转移适体传感器
技术领域
1.本发明涉及电化学检测技术领域，具体涉及一种用于乳腺癌her2-ecd检测的电致化学发光能量共振转移适体传感器及其检测方法。


背景技术：

2.乳腺癌（breast cancer，bc）是发生在乳腺上皮或导管上皮的恶性肿瘤。多年来，全球乳腺癌的发病率不断上升，据报道，每年有超过100万的新病例。相对于其它癌症，乳腺癌在女性中的患病率很高，对女性的生命健康产生巨大的威胁，如果不及早诊断，这种疾病最严重会导致死亡。因此，需要开发一种经济、灵敏、快速的乳腺癌检测方法，在乳腺癌发展的早期给予正确、及时的治疗，从而抑制乳腺癌的进一步发展。人表皮生长因子受体2（her-2）是乳腺癌预后的重要判断因子，它编码相对分子量185kd的跨膜受体样蛋白，具有酪氨酸激酶活性。人表皮生长因子受体 2 (her2) 由细胞外结构域 (ecd)、亲脂性跨膜区和细胞内结构域 (icd) 组成。确定 her2 状态的最常用方法是免疫组织化学。然而，有时会给出假阴性结果，这会导致一些患者失去抗 her2 治疗的机会。
3.除细胞her2外，通过adam（一种去整合素和金属蛋白酶）蛋白酶介导的膜结合her2的裂解释放到循环中的her2胞外区（her2-ecd）水平已被证明与原发性乳腺癌患者和转移癌患者的肿瘤负担有关。对her2-ecd循环水平的分析被建议作为评估her-2水平、预测治疗反应和监测治疗反应的传统方法的微创替代方法。
4.目前，her2-ecd的分析技术主要集中在酶联免疫吸附试验（elisa），虽被广泛应用但也存在些许不足，如elisa常会存在假阳性，容易受到干扰物的影响。因此，随着血清her2-ecd临床实用性的提高，发展一种灵敏、经济和快速的检测方法，建立其准确的定量分析方法具有重要的意义。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种用于乳腺癌her2-ecd检测的电致化学发光能量共振转移适体传感器。本发明以金纳米粒子（au nps）修饰的聚二烯丙基二甲基氯化铵（pdda）功能化的石墨相氮化碳（g-c3n4）复合发光材料作为基底信号材料，以金铂（aupt）修饰的金属有机框架材料（mof）作为信号猝灭材料，通过金属纳米粒子与氨基的键合作用装载大量her2-ecd结合适体链的部分互补链2（pdna），用6-巯基己醇（mch）封闭未结合的活性位点，最终制备得到了aupt@zif-67/pdna基底信号猝灭溶液。值得注意的是，zif-67的紫外光谱与g-c3n4的ecl光谱有重叠，由于ecl-ret效应而猝灭g-c3n4的ecl信号，并且在zif-67表面修饰了aupt之后能有效地提高mof的稳定性，且aupt作为her2-ecd结合适体链的部分互补链2（pdna）的活性结合位点，提高pdna负载量。因此，本发明以au nps/g-c3n4/pdda复合发光材料为基底、aupt@zif-67/pdna基底信号猝灭溶液，利用能量共振转移（ecl-ret）效应，实现了对her2-ecd的超灵敏检测，为乳腺癌患者早期诊断提供新的诊断途径。
6.除特殊说明外，本发明所述份数均为重量份，所述百分比均为质量百分比。
7.为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种用于乳腺癌her2-ecd检测的电致化学发光能量共振转移适体传感器，其特征在于，所述构建用于乳腺癌her2-ecd检测的电致化学发光能量共振转移适体传感器的方法为：将基底材料au nps/g-c3n4/pdda分散液滴加到清洁的玻碳电极表面，室温干燥后再将cdna滴加到电极表面，4-5℃孵育12-13 h；再将mch溶液滴加到电极上，室温孵育30-35 min；然后将apt滴加在电极上，室温孵育1-2 h；最后将aupt@zif-67/pdna基底信号猝灭溶液滴加到电极上，室温孵育3-4 h，即得到用于her2-ecd检测的电致化学发光适体传感器。
8.所述基底材料au nps/g-c3n4/pdda分散液的制备方法为将g-c3n4/pdda分散液加入到胶体金纳米粒子（au nps）溶液中，搅拌6-7 h，离心、洗涤，再将沉淀物分散在超纯水中，即得到分散均匀的au nps/g-c3n4/pdda分散液。
9.所述g-c3n4/pdda分散液：g-c3n4溶于超纯水中，超声分散均匀，加入pdda溶液（5 wt%），磁力搅拌12-13h，离心、洗涤，再将沉淀物分散在超纯水中，即得到分散均匀的g-c3n4/pdda分散液。
10.所述aupt@zif-67/pdna基底信号猝灭溶液的制备方法为：称取aupt@zif-67纳米复合物粉末溶于超纯水中，超声分散均匀，加入her2-ecd结合适体的部分互补链2（pdna），冰浴搅拌12-13 h，离心，水洗，将沉淀物重新分散于超纯水中，加入6-巯基己醇（mch）溶液，搅拌1-2h，离心，水洗，将沉淀物重新分散于超纯水中，即得到aupt@zif-67/pdna基底信号猝灭溶液。
11.所述aupt@zif-67纳米复合物的制备方法为：称取六水硝酸钴（co(no3)2·
6h2o）和2-甲基咪唑（c4h6n2）溶解于无水甲醇中，在超声的作用下，缓慢加入c4h6n2溶液，继续超声反应1-2h；然后将k2ptcl
6 （0.3 wt%）和haucl
4 （0.2 wt%）加入到混合溶液中，并将反应搅拌3-4小时；最后分离产物，用无水甲醇洗涤，离心，80-85℃真空干燥，得到aupt@zif-67纳米复合物。
12.所述胶体金纳米粒子（au nps）溶液的制备方法为：将1%haucl4添加到超纯水中，加热至沸腾，然后将1%柠檬酸三钠加入到煮沸的溶液中，当溶液颜色由蓝色变成红色时，将混合物保持沸腾15-20分钟，冷却至室温，加入超纯水分散得到胶体金纳米粒子（au nps）溶液。
13.上述aupt@zif-67/pdna基底信号猝灭溶液的制备方法，包括如下步骤；1）aupt@zif-67：首先，称取六水硝酸钴（co(no3)2·
6h2o）和2-甲基咪唑（c4h6n2），溶解于无水甲醇中；在超声的作用下，将c4h6n2溶液缓慢倒入co(no3)2·
6h2o溶液中，然后继续超声反应1h；将k2ptcl
6 （0.3 wt%）和haucl
4 （0.2 wt%）加入到混合溶液中，并将反应搅拌3小时；最后用无水甲醇洗涤3次，离心，80℃真空干燥，得到aupt@zif-67纳米复合物；2）aupt@zif-67/pdna：称取步骤1）制得的aupt@zif-67粉末，溶于超纯水中，超声分散均匀，加入her2-ecd结合适体的部分互补链2（pdna），冰浴搅拌12 h，离心，水洗，将沉淀物重新分散于超纯水中加入1mm 6-巯基己醇（mch）溶液，搅拌1h，离心，水洗，将沉淀物重新分散于超纯水中，即得到aupt@zif-67/pdna基底信号猝灭溶液。
14.具体的说，一种用于乳腺癌her2-ecd检测的电致化学发光能量共振转移适体传感
器，其特征在于，所述构建用于乳腺癌her2-ecd检测的电致化学发光能量共振转移适体传感器的方法包括如下步骤：（1）基底材料的制备；1）au nps：将1ml（1%）haucl4添加到100ml超纯水中并加热至沸腾，然后将2.5ml（1%）柠檬酸三钠快速加入到煮沸的溶液中；当溶液颜色由蓝色变成红色时，将混合物保持沸腾15分钟，冷却至室温，加入超纯水定容至100ml,得到胶体金纳米粒子（au nps）；2）g-c3n4/pdda分散液：称取2mg的g-c3n4，溶于2ml超纯水中，超声分散均匀，加入600ml pdda溶液（5 wt%），磁力搅拌12h，离心、洗涤，再将沉淀物分散在2ml超纯水中，即得到分散均匀的g-c3n4/pdda分散液；3）au nps/g-c3n4/pdda分散液：取2ml 步骤2）制得的g-c3n4/pdda分散液，加入600 ul步骤1）制得的au nps，搅拌6 h，离心、洗涤，再将沉淀物分散在1ml超纯水中，即得到分散均匀的au nps/g-c3n4/pdda分散液；（2）信号猝灭材料的制备；1）aupt@zif-67：首先，称取六水硝酸钴（co(no3)2·
6h2o，0.582g）和2-甲基咪唑（c4h6n2，0.656g）分别溶解于25ml无水甲醇中；在超声的作用下，将c4h6n2溶液缓慢倒入co(no3)2·
6h2o溶液中，然后继续超声反应1 h；其次，将2 ml k2ptcl
6 （0.3 wt%）和3 ml haucl
4 （0.2 wt%）加入到混合溶液中，并将反应搅拌3小时；最后用无水甲醇洗涤3次，离心，80℃真空干燥，得到aupt@zif-67纳米复合物；2）aupt@zif-67/pdna：称取2mg步骤1）制得的aupt@zif-67粉末，溶于1ml超纯水中，超声分散均匀，加入2μm her2-ecd结合适体的部分互补链2（pdna）200μl，冰浴搅拌12 h，离心，水洗，将沉淀物重新分散于1ml超纯水中加入200μl 1mm 6-巯基己醇（mch）溶液，搅拌1h，离心，水洗，将沉淀物重新分散于500μl超纯水中，即得到aupt@zif-67/pdna基底信号猝灭溶液；（3）用于her2-ecd检测的电致化学发光能量共振转移（ecl-ret）适体传感器的构建：1）用20 mm tris-hcl（ph=7.4）缓冲液室温下处理her2-ecd结合适体（apt）、apt的部分互补链1（cdna）和apt的部分互补链2（pdna），4℃储存备用；2）将玻碳电极用食人鱼洗液（98% h2so4/30% h2o
2 = 3:1, v/v）浸泡30 min后用超纯水冲洗干净备用；3）将步骤2）得到的电极分别用0.3 μm和0.05 μm的al2o3粉末抛光呈镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声处理电极，干燥备用；4）将步骤3）得到的电极在0.5 m h2so4中进行电化学活化，然后用超纯水冲洗，干燥；5）将10 μl所述的基底材料au nps/g-c3n4/pdda溶液滴加到步骤4）清洁的玻碳电极表面上，室温干燥；6）将10 μl步骤1）制得的cdna，滴加在步骤5）制备得到的电极4℃孵育12 h；7）将10 μl 1mm mch溶液滴加到步骤6）得到的电极上室温孵育30 min；8）将10 μl步骤1）制得的apt，滴加在步骤7）制备得到的电极上室温孵育1 h；
9）将15 μl所述的aupt@zif-67/pdna基底信号猝灭溶液滴加到步骤8）制备得到的电极上室温孵育3 h，即得到用于her2-ecd检测的电致化学发光适体传感器。
15.本发明还提供一种利用上述电致化学发光能量共振转移（ecl-ret）适体传感器检测her2-ecd的方法。
16.一种利用上述电致化学发光能量共振转移（ecl-ret）适体传感器检测her2-ecd的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）向上述传感器的电极上滴加不同浓度的目标物人表皮生长因子受体2细胞外结构域（her2-ecd）；2）将电极置于含有8 mm k2s2o8的0.1 m pbs（ph=7.0）溶液中进行表征，测量其电致化学发光强度值；3）根据步骤2）所得发光强度与her2-ecd浓度对数值的线性关系，绘制工作曲线；4）将待测样品用所述传感器检测，将得到的电流值通过步骤3）制得的工作曲线计算得到待测样品的her2-ecd浓度。
17.与现有技术相比，本发明的一种检测her2-ecd的电致化学发光能量共振转移（ecl-ret）适体传感器的制备方法与应用，其突出的特点是：本发明制备了金纳米粒子（au nps）修饰的聚二烯丙基二甲基氯化铵（pdda）功能化的石墨相氮化碳（g-c3n4）复合发光材料和金铂（aupt）修饰的金属有机框架材料（mof）的信号猝灭材料，通过金属粒子与氨基的键合作用装载大量her2-ecd结合适体的部分互补链2（pdna），最终制备了aupt@zif-67/pdna的基底信号猝灭溶液。本发明制备的金纳米粒子（au nps）修饰的聚二烯丙基二甲基氯化铵（pdda）功能化的石墨相氮化碳（g-c3n4）复合发光材料具有强大而稳定的阴极ecl活性。同时信号猝灭材料的紫外光谱与au nps/g-c3n4/pdda的ecl光谱具有高度重合。aupt的加入增加了zif-67的稳定性且作为her2-ecd结合适体的部分互补链2（pdna）的活性结合位点，提高pdna负载量。在本发明中，以聚二烯丙基二甲基氯化铵-石墨相氮化碳（g-c3n4/pdda）和金纳米粒子（au nps）通过搅拌的方法合成au nps/g-c3n4/pdda复合材料作为传感界面，捕获大量her2-ecd结合适体的部分互补链1（cdna）进一步实现信号放大。通过上述手段，所制备的电致化学发光能量共振转移适体传感器成功的用于her2-ecd的超灵敏检测。与传统的her2-ecd检测方法相比，本发明的优点在于灵敏度高，特异性强，检测迅速，操作方便，设备材料价格低廉，无污染，从而为her2-ecd的检测提供了新的分析方法。
18.本发明的有益效果是：1）通过金纳米粒子（au nps）修饰的聚二烯丙基二甲基氯化铵（pdda）功能化的石墨相氮化碳（g-c3n4）复合发光材料，可以极大地改善g-c3n4的负载位点少，发光效率低，电极易钝化的特点，从而提高传感器性能实现信号放大作用，同时提高检测的灵敏度。
19.2）本发明制备的电致化学发光能量共振转移（ecl-ret）适体传感器用于目标物的识别具有高度的特异性，可提高传感器的选择性，从而为微量her2-ecd的检测提供了新的研究方向和分析方法。
20.4）本发明涉及的材料均可在实验室条件下合成，具有操作简单，原材料价格低廉，毒性低、环境友好，而且每次使用量极少，降低了实验成本。
21.5）本发明整个检测分析方法步骤清晰简便，灵敏度高，信号响应迅速。
22.6）本方法制备的电化学适体传感器可为her2-ecd的检测提供新方法。
附图说明
23.图1是不同修饰电极在含8 mm k2s2o8的0 .1 m pbs （ph 7.0）中电压范围从0到-1.2 v以200 mv/s的扫描速率（a）及au nps/g-c3n4/pdda的连续扫描得到的时间-电化学发光强度图（b）。
24.图2是不同修饰电极在含8 mm k2s2o8的0 .1 m pbs （ph 7.0）中电压范围从0到-1.2 v以200 mv/s的扫描速率扫描得到的时间-电化学发光强度图（a）及aupt@zif-67/pdna的紫外光谱（b）和au nps/g-c3n4/pdda的ecl光谱图（a）。
25.图3是不同修饰电极在5 mm k3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6]溶液中电压范围从-0.2到0.7 v以100 mv/s的扫描速率得到的循环伏安表征图（a）和阻抗表征图（b）。
[0026]
图4是不同浓度的her2-ecd通过本发明传感器检测的结果，其中，图（a）为在8 mm k2s2o8的0.1 m pbs （ph 7.0）中传感器分别对0.0001, 0.001, 0.01，0.1，1，10 和 100 ng/ml 的her2-ecd扫描的时间-电化学发光强度图；图（b）为传感器电化学发光强度与不同浓度her2-ecd对数值的校准曲线。
[0027]
图5是传感器稳定性检测结果，为1 ng/ml her2-ecd孵育的传感器在连续扫描12圈后得到的时间-电化学发光强度图；图6是五支不同玻碳电极同时孵育10 ng/ml her2-ecd所得的传感器在相同条件下扫描后得到的重现性结果。
[0028]
图7是her2-ecd适体传感器的特异性检测图，其中，干扰物为神经烯醇化酶（nse，10ng/ml），人附睾蛋白4（he4，10ng/ml），前列腺特异性抗原（psa，10ng/ml）癌胚抗原（cea，10ng/ml），人血清白蛋白（has，10 ng/ml）和细胞角蛋白19的可溶性片段（cyfra21-1，10 ng/ml）。
具体实施方式
[0029]
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
[0030]
本发明实施例中用到的主要化学试剂如下：人表皮生长因子受体2配体结合域（her2-ecd）elisa检测试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司；聚二烯丙基二甲基氯化铵（pdda，30%）购自索莱宝（中国北京）；石墨相氮化碳（g-c3n4）购自南京先锋纳米有限公司（中国南京）；六水硝酸钴和2-甲基咪唑购自阿拉丁生化科技股份有限公司（中国上海）；氯金酸（haucl4）和氯铂酸钾（k2ptcl6）购自sigma（usa）；6-巯基己醇（mch）和过硫酸钾（k2s2o8）购自j＆k scientific ltd（中国北京）；涉及到的适体由上海生工有限公司合成，具体序列如下：her2-ecd结合适体链（apt）的序列：5'-tccacctttccgtctaactccccactttat-3'与apt部分互补链1（cdna）的序列: 5'-nh
2-(ch2)
6-ataaagtggggagtt-3'与apt部分互补链2（pdna）的序列: 5'
‑ꢀ
agacggaaaggtgga
ꢀ‑
(ch2)
6-nh
2-3'所用设备及技术参数：仪器：使用mpi-eⅱ型电致化学发光工作站（中国西安）进行时间/电压-电化学发光强度测定。使用metrohm autolab b.v.电化学工作站（瑞士modular仪器）进行循环伏安
法（cv）和阻抗法（eis）测定。电化学发光检测采用三电极系统：修饰后的玻碳电极（直径4 mm）作为工作电极，铂丝作为对电极，银-氯化银（饱和kcl）作为参比电极。电化学检测采用三电极系统：修饰后的玻碳电极（直径4 mm）作为工作电极，铂丝作为对电极，饱和甘汞电极（sce）作为参比电极。ph计监测ph值（s210 sevencompact，梅特勒-托利多，中国上海）。使用紫外分光光度仪测量紫外可见吸收光谱（uv
‑ꢀ
2600，岛津，日本）。电化学发光三电极系统在含8 mm k2s2o8的0.1 m pbs （ph 7.0）中以200 mv/s扫描。电化学三电极系统在5 mm k3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6]溶液中以100 mv/s扫描。
[0031]
实施例1构建用于乳腺癌her2-ecd检测的电致化学发光能量共振转移适体传感器，包括如下步骤操作：（1）基底材料的制备；1）au nps：将1ml（1%）haucl4添加到100ml超纯水中并加热至沸腾，然后将2.5ml（1%）柠檬酸三钠快速加入到煮沸的溶液中；当溶液颜色由蓝色变成红色时，将混合物保持沸腾15分钟，冷却至室温，加入超纯水定容至100ml,得到胶体金纳米粒子（au nps）；2）g-c3n4/pdda分散液：称取2mg的g-c3n4，溶于2ml超纯水中，超声分散均匀，加入600ml pdda溶液（5 wt%），磁力搅拌12h，离心、洗涤，再将沉淀物分散在2ml超纯水中，即得到分散均匀的g-c3n4/pdda分散液；3）au nps/g-c3n4/pdda分散液：取2ml 步骤2）制得的g-c3n4/pdda分散液，加入600 ul步骤1）制得的au nps，搅拌6 h，离心、洗涤，再将沉淀物分散在1ml超纯水中，即得到分散均匀的au nps/g-c3n4/pdda分散液。
[0032]
（2）信号猝灭材料的制备；1）aupt@zif-67：首先，称取六水硝酸钴（co(no3)2·
6h2o，0.582g）和2-甲基咪唑（c4h6n2，0.656g）溶解于25ml无水甲醇中，在超声的作用下，将c4h6n2溶液缓慢倒入co(no3)2·
6h2o溶液中，然后继续超声反应1h；将2 ml k2ptcl
6 (0.3 wt%)和3 ml haucl
4 (0.2 wt%)加入到混合溶液中，并将反应搅拌3小时；最后用无水甲醇洗涤3次，离心，80℃真空干燥，得到aupt@zif-67纳米复合物；2）aupt@zif-67/pdna：称取2mg步骤1）制得的aupt@zif-67粉末，溶于1ml超纯水中，超声分散均匀，加入2 μm her-ecd结合适体的部分互补链2（pdna）200 μl，冰浴搅拌12 h，离心，水洗，将沉淀物重新分散于1ml超纯水中加入200μl 1mm 6-巯基己醇（mch）溶液，搅拌1h，离心，水洗，将沉淀物重新分散于500μl超纯水中，即得到aupt@zif-67/pdna基底信号猝灭溶液。
[0033]
（3）用于her2-ecd检测的电致化学发光能量共振转移适体传感器的构建：1）用20 mm tris-hcl（ph=7.4）缓冲液室温下处理her2-ecd结合适体链（apt）、apt的部分互补链1（cdna）和2（pdna），4℃储存备用；2）将玻碳电极用食人鱼洗液（98% h2so4/30% h2o
2 = 3:1, v/v）浸泡30 min后用超纯水冲洗干净备用；3）将步骤2）得到的电极分别用0.3 μm和0.05 μm的al2o3粉末抛光呈镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声处理电极，干燥备用；
4）将步骤3）得到的电极在0.5 m h2so4中进行电化学活化，然后用超纯水冲洗，干燥；5）将10 μl所述的基底材料au nps/g-c3n4/pdda溶液滴加到步骤4）清洁的玻碳电极表面上，室温干燥；6）将10 μl步骤1）制得的cdna，滴加在步骤5）制备得到的电极4℃孵育12 h；7）将10 μl 1mm mch溶液滴加到步骤6）得到的电极上室温孵育30 min；8）将10 μl步骤1）制得的apt，滴加在步骤7）制备得到的电极上室温孵育1 h；9）将15 μl所述的aupt@zif-67/pdna基底信号猝灭溶液滴加到步骤8）制备得到的电极上室温孵育3 h，即得到用于her2-ecd检测的电致化学发光适体传感器。
[0034]
实施例2利用电致化学发光能量共振转移适体传感器检测her2-ecd利用实施例1构建的电致化学发光能量共振转移适体传感器检测her2-ecd，按照如下步骤操作：一、绘制工作曲线1）将实施例2步骤5）至步骤9）的修饰电极分别置于含8 mm k2s2o8的0 .1 m pbs（ph=7.0）中进行表征，测量其电化学发光响应信号，结果如图1a所示：（a）滴加基底材料au nps/g-c3n4/pdda；（b）滴加cdna；（c）滴加mch溶液封闭；（d）滴加apt；（e）滴加信号猝灭材料aupt@zif-67/pdna；（f）滴加her2-ecd；图1b：基底材料au nps/g-c3n4/pdda。
[0035]
2）将不同修饰电极分别置于含8 mm k2s2o8的0.1 m pbs（ph=7.0）中进行表征，测量其电化学发光响应信号，结果如图2a所示：（a）au nps/g-c3n4/pdda；（b）g-c3n4/pdda；（c）aupt@zif-67/g-c3n4/pdda。分别测量au nps/g-c3n4/pdda的ecl光谱和aupt@zif-67/pdna的紫外光谱，结果如图2b所示：（a）au nps/g-c3n4/pdda的ecl光谱；（b）aupt@zif-67/pdna的紫外光谱。
[0036]
3）将实施例2步骤5）至步骤9）的修饰电极分别置于5 mm k3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6]溶液中进行cv和eis表征。测量其电流响应信号，结果如图3a所示：（a）滴加基底材料au nps/g-c3n4/pdda；（b）滴加cdna；（c）滴加mch溶液封闭；（d）滴加apt；（e）滴加信号猝灭材料aupt@zif-67/pdna；（f）滴加her2-ecd。测量其阻抗响应信号，结果如图3b所示：（a）滴加基底材料au nps/g-c3n4/pdda；（b）滴加cdna；（c）滴加mch溶液封闭；（d）滴加apt；（e）滴加信号猝灭材料aupt@zif-67/pdna；（f）滴加her2-ecd。
[0037]
4）向实施例1制得的适体传感器的电极上滴加10 μl不同浓度的目标物her2-ecd，分别测定其发光强度情况。如图4a所示：从下到上的浓度依次为: 0.0001, 0.001, 0.01，0.1，1，10 和 100 ng/ml。
[0038]
5）根据所得发光强度值与her2-ecd浓度对数值的线性关系，绘制工作曲线（如图4b所示）。测定结果表明发光强度响应值与her2-ecd浓度对数值在100 fg/ml－100 ng/ml范围内呈良好的线性关系，线性相关系数为0.9989，检测限为17.3 fg/ml；结果如图4所示。
[0039]
二、传感器稳定性测试：将实施例1制得的传感器在最佳条件下连续进行12圈ecl测量后，其发光强度仅降低了5.1%（如图5所示），表明传感器具有良好的稳定性。
[0040]
三、传感器重现性测试：将实施例1采用五支不同玻碳电极孵育相同浓度her-2（10 ng/ml）制得的传感器进行ecl测量后（如图6所示），得到相对标准偏差（rsd）为3.6%，表明传
感器重现性良好。
[0041]
四、传感器特异性测试：为了研究提出的适应传感器的特异性，采用可能存在于血清中的干扰物：神经烯醇化酶（nse，10ng/ml），人附睾蛋白4（he4，10ng/ml），前列腺特异性抗原（psa，10ng/ml）癌胚抗原（cea，10ng/ml），人血清白蛋白（has，10 ng/ml）和细胞角蛋白19的可溶性片段（cyfra21-1，10 ng/ml）在相同浓度及条件下测定的不同干扰物质在含8 mm k2s2o8的0 .1 m pbs（ph=7.0）中电化学发光强度响应值。结果表明（如图7所示），提出的基于her2-ecd~hba的高特异性反应的适体传感器具有良好的特异性。