一种黄芪多糖测定方法

1.本发明属于多糖测定技术领域，尤其涉及一种黄芪多糖测定方法。


背景技术：

2.多糖(polysaccharide)，是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物。由相同的单糖组成的多糖称为同多糖，如淀粉、纤维素和糖原；以不同的单糖组成的多糖称为杂多糖，如阿拉伯胶是由戊糖和半乳糖等组成。多糖不是一种纯粹的化学物质，而是聚合程度不同的物质的混合物。多糖类一般不溶于水，无甜味，不能形成结晶，无还原性和变旋现象。多糖也是糖苷，所以可以水解，在水解过程中，往往产生一系列的中间产物，最终完全水解得到单糖。
3.黄芪多糖是豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根经提取、浓缩、纯化而成的水溶性杂多糖，淡黄色，粉末细腻，均匀无杂质，具引湿性。黄芪多糖由己糖醛酸、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等组成，可作为免疫促进剂或调节剂，同时具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗应激、抗氧化等作用。
4.多糖的测定目前多采用苯酚硫酸法，而硫酸是管制用品，购买不便，不易进行后期应用研究，硫酸具有强腐蚀性，实验室使用非常不安全。


技术实现要素：

5.本发明实施例的目的在于提供一种黄芪多糖测定方法，旨在解决多糖的测定目前多采用苯酚硫酸法，而硫酸是管制用品，购买不便，不易进行后期应用研究，硫酸具有强腐蚀性，实验室使用非常不安全的问题。
6.本发明实施例是这样实现的，一种黄芪多糖测定方法，所述黄芪多糖测定方法包括如下步骤：
7.步骤1、用移液枪精密移取多组葡萄糖对照品溶液置于2ml的容量瓶中，将稀释后的对照品溶液放入超声仪中超声30min，并放置60min，随后用三诺牌安稳免调码血糖仪进行血糖值的测定，以血糖值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线；
8.步骤2、从药材中提取多糖，并置于10ml螺纹试管中，按照料液比1：2，加入2mol/l的三氟乙酸并封口，放于超声清洗机中超声10min除空气，再放入烧杯中，并将烧杯放置在电热套中，温度设置96℃、时间为1.7h进行水解；
9.步骤3、待水解液冷却后将其转移至100ml的圆底烧瓶中，并置于水浴锅上采用减压蒸馏蒸干；
10.步骤4、待冷却后加入3ml的蒸馏水于圆底烧瓶中，进行超声30min并放置60min后，用血糖仪测葡萄糖含量，以试样空白扣除干扰，以葡萄糖计得黄芪中多糖含量。
11.作为本发明再进一步的方案：步骤2中所述的从药材中提取多糖包括如下步骤：
12.步骤1、称取黄芪粗粉100g，加入75％乙醇溶液300ml，解吸40min，加入12倍体积80℃的蒸馏水，80℃下减压(真空度为﹣0.0740mpa)回流提取7min，用离心机对提取液进行离
心，自“加入12倍体积80℃的蒸馏水”起，同法提前2次，合并滤液；
13.步骤2、将滤液80℃下浓缩至170ml，加入3倍量的浓度为80％的乙醇溶液并在加入过程中持续搅拌，加入后静置过夜，对过夜后的溶液进行抽滤，得到黄芪多糖。
14.作为本发明再进一步的方案：步骤4中所述的以葡萄糖计得黄芪中多糖含量，计算公式为：
[0015][0016][0017]
作为本发明再进一步的方案：步骤3中所述的采用减压蒸馏蒸干，在蒸干过程中，向圆底烧瓶反复4次，每次2ml的加入甲醇用于去除三氟乙酰基，至无酸味为止。
[0018]
本发明实施例提供的一种黄芪多糖测定方法，具有以下有益效果：
[0019]
采用免调码血糖仪测定葡萄糖含量，操作方便，专属性强，干扰少，不需要进行除蛋白等多糖纯化，降低了多糖的损失；以试样做空白，可以有效降低黄芪药材本身所含葡萄糖的干扰，测得结果更准确，便于药材质量比较和监控；
[0020]
采用三氟乙酸进行水解，三氟乙酸挥发性强易于除去消除干扰，腐蚀性较浓硫酸弱，避免了使用苯酚带来的毒性，可用于大批量工业生产。水解的实验装置由烘箱高温水解，改为水浴控温水解，安全，便于操作，通过超声除空气，降低了多糖的氧化。
附图说明
[0021]
图1为温度和时间对结果影响的等高线图；
[0022]
图2为温度和时间对结果影响的响应面3d图；
[0023]
图3为温度和多糖用量对结果影响的等高线图；
[0024]
图4为温度和多糖用量对结果影响的响应面3d图；
[0025]
图5为时间和多糖用量对结果影响的等高线图；
[0026]
图6为时间和多糖用量对结果影响的响应面3d图；
[0027]
图7为室温定容对测定结果的影响图；
[0028]
图8为36℃水浴定容的影响效果图；
[0029]
图9为80℃水浴定容的影响效果图；
[0030]
图10为超声对测定结果的影响图；
[0031]
图11为线性关系标准曲线图。
具体实施方式
[0032]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0033]
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
[0034]
如图1所示，在本发明实施例中，一种黄芪多糖测定方法，所述黄芪多糖测定方法
包括如下步骤：
[0035]
步骤1、用移液枪精密移取多组葡萄糖对照品溶液置于2ml的容量瓶中，将稀释后的对照品溶液放入超声仪中超声30min，并放置60min，随后用安稳免调码血糖仪进行血糖值的测定，以血糖值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线；
[0036]
步骤2、从药材中提取多糖，并置于10ml螺纹试管中，按照料液比1：2，加入2mol/l的三氟乙酸并封口，放于超声清洗机中超声10min除空气，再放入烧杯中，并将烧杯放置在电热套中，温度设置96℃、时间为1.7h进行水解；
[0037]
步骤3、待水解液冷却后将其转移至100ml的圆底烧瓶中，并置于水浴锅上采用减压蒸馏蒸干；
[0038]
步骤4、待冷却后加入3ml的蒸馏水于圆底烧瓶中，进行超声30min并放置60min后，用血糖仪测葡萄糖含量，以试样空白扣除干扰，以葡萄糖计得黄芪中多糖含量。
[0039]
作为本发明再进一步的方案：步骤2中所述的从药材中提取多糖包括如下步骤：
[0040]
步骤1、称取黄芪粗粉100g，加入75％乙醇溶液300ml，解吸40min，加入12倍体积80℃的蒸馏水，80℃下减压(真空度为﹣0.0740mpa)回流提取7min，用离心机对提取液进行离心，自“加入12倍体积80℃的蒸馏水”起，同法提前两次，合并滤液；
[0041]
步骤2、将滤液80℃下浓缩至170ml，加入3倍量的浓度为80％的乙醇溶液并在加入过程中持续搅拌，加入后静置过夜，对过夜后的溶液进行抽滤，得到黄芪多糖。
[0042]
作为本发明再进一步的方案：步骤4中所述的以葡萄糖计得黄芪中多糖含量，计算公式为：
[0043][0044][0045]
作为本发明再进一步的方案：步骤3中所述的采用减压蒸馏蒸干，在蒸干过程中，向圆底烧瓶反复4次，每次2ml的加入甲醇用于去除三氟乙酰基，至无酸味为止。
[0046]
实施例1：
[0047]
用万分之一的分析天平将对照品精密称定132.7mg，用蒸馏水定容至25ml容量中，摇匀，得到浓度为5.308mg/ml的葡萄糖对照品溶液；
[0048]
用移液枪精密移取对照品溶液0.14、0.18、0.205、0.24、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20ml于2ml的容量瓶中，将稀释后的对照品溶液放入超声仪中超声30min，放置60min后，用安稳免调码血糖仪进行血糖值的测定，以血糖值(b)纵坐标，葡萄糖浓度(x)为横坐标绘制标准曲线；
[0049]
葡萄糖对照品浓度在0.5443～3.1848的范围内线性关系良好，线性相关系r＝0.9993；
[0050]
称取从药材中提取的一定质量的多糖，置于10ml螺纹试管中，按照料液比1：2，加入2mol/l的三氟乙酸，封口，放于超声清洗机中超声10min除空气，再放入盛水的烧杯，烧杯放置在电热套中，温度设置96℃、时间为1.7h进行水解；
[0051]
待水解液冷却后转移至100ml的圆底烧瓶，置于水浴锅上采用减压蒸馏蒸干，向圆
底烧瓶反复4次，每次2ml的加入甲醇用于去除三氟乙酰基，至无酸味为止；
[0052]
待冷却后加入3ml的蒸馏水于圆底烧瓶中，进行超声30min并放置60min后，用血糖仪测葡萄糖含量，以试样空白扣除干扰，以葡萄糖计得黄芪中多糖含量。
[0053]
实施例2：
[0054]
黄芪多糖的提取：
[0055]
取黄芪药材阴干，粉碎，精密称取黄芪粗粉100g，加入75％乙醇溶液300ml，解吸40min，加入12倍体积80℃的蒸馏水，在80℃下减压回流提取7min，用离心机离心，自“加入12倍体积80℃的蒸馏水”起，同法提前两次，合并滤液；80℃下浓缩至170ml，慢加快搅加入3倍量的80％乙醇，静置过夜，抽滤，得到黄芪多糖47.35g。
[0056]
实施例3：
[0057]
水解时间的考察：
[0058]
精密称取五份黄芪多糖，每份100mg，分别置于10ml螺纹试管中，加入2mol/l的三氟乙酰基15ml，超声10min除空气，置于盛满水的烧杯中，置于电热套内，100℃下分别水解0.5、1、1.5、2、3h，然后按照黄芪多糖测定方法的步骤3开始操作，冷却后加入蒸馏水3ml，超声30min，放置60min，用血糖仪测血糖值，计算葡萄糖含量及多糖含量，测量结果见表3，由表可见，随着时间的增加，多糖水解成单糖的量越来越多，1.5h时，葡萄糖百分含量达到最高，随后继续延长时间，单糖含量不升反降，因此，最佳的水解时间为1.5h。
[0059]
表3水解时间对葡萄糖百分含量的影响
[0060][0061]
水解温度的考察：
[0062]
精密称取五份黄芪多糖，每份100mg，分别置于10ml螺纹试管中，加2mol/l的三氟乙酰基15ml，封口，超声10min，置于盛满水的烧杯中，烧杯放到电热套上，分别在80、85、90、95、100℃下分别水解，然后按照黄芪多糖测定方法的步骤3中“待水解液冷却后转移至100ml的圆底烧瓶”开始操作，冷却后加3ml的蒸馏水于圆底烧瓶中，超声30min，放置60min后，用血糖仪测血糖值，计算葡萄糖含量及多糖含量。由表4可知，温度越高，多糖水解成单糖的量越来越多，95℃时达到最高。到95℃之后，葡萄糖含量稍有一定程度的下降。可能的原因是水解温度过高导致了葡萄糖被空气中的氧气氧化。因此，最佳的水解温度为95℃。
[0063]
表4水解温度对葡萄糖百分含量的影响
[0064][0065]
料液比的考察：
[0066]
精密称取五份黄芪多糖各45、30、15、7.5、5mg，分别置于10ml螺纹试管中，加2mol/l的三氟乙酰基15ml，使其料液比为3：1、2：1、1：1、1：2、1：3(因三氟乙酸量不变为15ml，所以只需改变多糖量即可)封口，超声10min，置于盛满水的烧杯中，烧杯放在电热套上，100℃下水解1.5h。然后按照黄芪多糖测定方法的步骤3中“待水解液冷却后转移至100ml的圆底烧瓶”开始操作，冷却后加3ml的蒸馏水于圆底烧瓶中，超声30min，放置60min后，用血糖仪测血糖值，计算葡萄糖含量及多糖含量。由表5可知，料液比对多糖的水解有较大的影响，当料液比为1：2(此时多糖为7.5mg)时葡萄糖含量达到最高，随后逐渐减少。出现此现象可能的原因是：多糖量太多可能会导致水解不完全，量太少会导致葡萄糖被碳化，因此把7.5mg的多糖用量定为最佳，即料液比为1：2。
[0067]
表5料液比对葡萄糖百分含量的影响
[0068][0069][0070]
响应面法优化黄芪多糖水解工艺的试验：
[0071]
在单因素实验的基础上，依据design-expert软件，运用box-behnken中心组合实验设计原理，以水解温度(a)、水解时间(b)、多糖用量(c)三个因子为自变量，以黄芪水解出来的葡萄糖百分含量为响应值，对黄芪多糖的水解条件进行优化，响应面试验因素及水平见表6。
[0072]
表6响应面试验因素水平表
[0073][0074]
响应面试验的结果：
[0075]
依据单因素实验所得的款冬花多糖的最佳水解条件进行三因素三水平响应面的设计，以三个因素的三个水平(-1、0、1)为自变量，血糖仪测得葡萄糖的百分含量为因变量(响应值)，响应面试验设计及结果如表7所示。
[0076]
表7响应面试验设计及结果
[0077][0078][0079]
使用响应面数据分析软件对表7的实验数据进行分析，建立多元回归模型，得到的水解温度(℃)、水解时间(h)、多糖量(mg)与葡萄糖百分含量之间的二次多项回归方程为：
[0080]
y＝33.39+3.79a+4.27b+2.04c-1.74ab-0.14ac-0.15bc-5.42a
2-5.42b
2-8.90c2[0081]
其中，y为百分含量。
[0082]
响应面法的方差分析：
[0083]
对模型进行二项式模型的anova方差分析，分析结果见表7。
[0084]
表8回归模型的方差分析
[0085][0086]
对该方差分析进行文字简读：由表7可知，模型项p值《0.0500，这表示模型项是显著的。该模型的失拟项p》0.05显著，因而采用此模型推测因素变化导致葡萄糖百分含量变化的方法是可信的。同时结合f值可以看出，以上3个因素对黄芪多糖水解的影响顺序依次为：b(时间)》a(温度)》c(料液比)。
[0087]
响应面曲面分析：
[0088]
使用响应面软件分析实验结果，同时作出3d图和等高线分析图。更有利于分析三个因素对黄芪多糖水解所得葡萄糖百分含量的影响。
[0089]
由图1至图6可观察出，时间的曲线弯曲度最大，这说明改变时间引起的葡萄糖百分含量的变化最为明显；相对而言，温度与多糖的用量对葡萄糖百分含量的影响都不甚明显，但温度的影响要稍大于多糖用量。此结论与方差分析中所表示的趋势相同。
[0090]
响应面优选条件：
[0091]
根据design expert 8.0设计的响应面实验预测的优化方案为：水解时间1.673h、水解温度96.466℃、料液比1：2。此条件下的模型预测值为34.797％。
[0092]
结论：
[0093]
响应面预测出的最佳条件为：时间1.67h、温度96.46℃、多糖用量7.774mg。根据实际操作，并结合单因素结果，最终将水解条件修正为：水解时间1.7h、水解温度96℃，料液比1：2。
[0094]
本实验利用三氟乙酸水解黄芪多糖的方法较为新颖，且实验的可操作性强，得出的实验数据稳定，可在实际操作中应用。但在实验过程中发现空气中的氧气会对葡萄糖进行氧化，故水解完以后应待水解液冷却至室温后再取出；此外，减压蒸馏除三氟乙酸时，温度会也影响测定结果，应在80℃下进行。
[0095]
实施例4：
[0096]
室温定容对测定结果的影响：
[0097]
精密称定葡萄糖对照品11.6mg，用蒸馏水定容至5ml容量中，摇匀，在室温下避光保存。分别于0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6h内进行测定，每0.5h内连续测定3次，计算其平均值。测定结果见表1。结果表明，葡萄糖溶液在室温下避光保存后前4.5h内测
定的血糖值不稳定，波动较大。4.5h后测得的血糖值趋于稳定，误差较小。影响效果见图1。
[0098]
表1室温定容对测定结果的影响
[0099][0100]
36℃水浴定容对测定结果的影响：
[0101]
精密称定葡萄糖对照品11.6mg，用蒸馏水定容至5ml容量中，摇匀，在36℃水浴条件下加热30min后取出。分别于0.5、1、1.5、2、2.5、3h内进行测定，每0.5h内连续测定3次，计算平均值。测定结果见表2。结果表明，葡萄糖溶液在水浴加热36℃后前1.5h内所测得的血糖值不稳定，波动较大。1.5h后所测得的血糖值趋于稳定。误差较小。影响效果见图2。
[0102]
表2 36℃水浴定容对测定结果的影响
[0103][0104]
80℃水浴定容的影响：
[0105]
精密称定葡萄糖对照品11.6mg，用蒸馏水定容至5ml容量中，摇匀。在80℃水浴条件下加热30min后取出，分别于0.5、1、1.5、2、2.5、3h内进行测定，每0.5h连续测定3次，计算其平均值。测定结果见表3。结果表明，葡萄糖溶液在80℃水浴加热30min后前2h内所测得的血糖值不稳定，波动较大。2h后所测得的血糖值趋于稳定，误差较小。影响效果见图3。
[0106]
表3 80℃水浴定容的影响
[0107][0108]
超声对测定结果的影响：
[0109]
精密称定葡萄糖对照品11.6mg，用蒸馏水定容至5ml容量中，摇匀。在超声仪中超声30min后取出，分别于15、30、60、90、120、180min内进行测定，连续测定3次，计算平均值。
测定结果见表4。可见葡萄糖溶液在超声60min后，前1h内所测得的血糖值不稳定，波动较大。1h后所测得的血糖值趋于稳定，误差较小。影响效果见图4。
[0110]
表4超声对测定结果的影响
[0111][0112]
实施例5：
[0113]
一、稳定性的考察：
[0114]
精密称定4份质量为6.0mg的d-葡萄糖对照品，分别置于烧杯中用蒸馏水定容至5ml的容量瓶中，将定容好的对照品溶液1在室温下放置4.5h，对照品溶液2在36℃水浴条件下加热30min后，在室温下放置1.5h，对照品溶液3在80℃水浴条件下加热30min后，在室温下放置2h，对照品溶液4超声30min后，在室温下放置60min。分别考察葡萄糖溶液在不同预处理方式后在0、2、4、6、8、10、12、24h内的稳定性。用免调码三诺牌安稳血糖仪测定其血糖值并记录，结果见表5。结果表明：rsd(室温)＞rsd(80℃水浴)＞rsd(36℃水浴)＞rsd(超声)，可见，对照品溶液经超声处理后稳定性最好。
[0115]
表5葡萄糖不同预处理后稳定性考察
[0116][0117]
综合以上分析结果，使用血糖仪测定葡萄糖含量时，葡萄糖的预处理方式采用超声30min，放置60min后进行测定，所测得的血糖值最为稳定。
[0118]
二、检测限考察：
[0119]
精密称定葡萄糖对照品132.7mg，用蒸馏水定容至25ml容量中，摇匀，用移液枪精密移取对照品溶液0.14、0.18、0.205、0.24、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80ml于2ml的容量瓶中，超声30min后，放置60min后，用血糖仪连续测定6次血糖值。结果见表6。实验结果表明：仪器的稳定测定范围在1.1mmol/l～17.0mmol/l。
[0120]
表6仪器测定范围的考察
[0121][0122]
将对照品逐渐稀释，发现当血糖值低于1.1mmol/l时仪器未能检测出，则1.1mmol/l为仪器的检测限。
[0123]
线性关系考察：
[0124]
用万分之一的分析天平将对照品精密称定132.7mg，用蒸馏水定容至25ml容量中，摇匀，得到浓度为5.308mg/ml的葡萄糖对照品溶液，用移液枪精密移取对照品溶液0.14、0.18、0.205、0.24、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20ml于2ml的容量瓶中，将稀释后的对照品溶液放入超声仪中超声30min，放置60min后，用免调码三诺牌安稳血糖仪进行血糖值的测定。结果见表13。以血糖值(b)纵坐标，葡萄糖浓度(x)为横坐标绘制标准曲线。发现在仪器的测定范围内，葡萄糖对照品浓度在0.5443～3.1848的范围内线性关系良好，线性相关系r＝0.9993，线性方程b＝5.1803x+0.3552，结果见图11。
[0125]
表13标准曲线测定结果
[0126][0127]
三、精密度考察：
[0128]
精密移
取浓度为5.308mg/ml的葡萄糖标准品溶液0.6ml，将其定容至2ml的容量瓶中，超声30min，放置60min后用免调码三诺牌安稳血糖仪连续测定6次。结果见表14。由表可见，得rsd为1.64％(n＝6)，表明仪器精密度良好，符合要求。
[0129]
表14精密度实验结果
[0130][0131]
四、重复性考察
[0132]
精密称取黄芪多糖6份，每份约7.5mg，分别置于10ml螺纹试管中，加2mol/l的tfa15ml，放于超声清洗机中超声10min除空气，再放入盛水的烧杯，烧杯放置在电热套中，于96℃，水解1.7小时，待水解液冷却后转移至100ml的圆底烧瓶，置于水浴锅上采用减压蒸馏蒸干，再加4次，每次2ml甲醇除tfa，至无酸味为止。待冷却后加一定量的蒸馏水于圆底烧瓶中，超声30min，放置60min后，用血糖仪测血糖值，每份测定3次血糖值并求平均值，得rsd为2.52％(n＝6)，结果表明该方法重复性良好，结果见表15。
[0133]
表15重复性实验结果
[0134][0135][0136]
五、回收率考察
[0137]
精密称取黄芪多糖6份，每份约7.5mg，分别放入10ml螺纹试管中，加2mol/l的tfa15ml，放于超声清洗机中超声10min除空气，再放入盛水的烧杯，烧杯放置在电热套中，于96℃，水解1.7小时，待水解液冷却后转移至100ml的圆底烧瓶，置于水浴锅上采用减压蒸馏蒸干，再加4次，每次2ml甲醇除tfa，至无酸味为止。待冷却后分别加入1.5ml浓度为1.5924mg
·
ml-1葡萄糖标准品溶液，加3ml的蒸馏水于圆底烧瓶中，超声30min，放置60min后，用血糖仪测血糖值，扣除试样空白，由回归方程计算葡萄糖含量，计算葡萄糖百分含量，计算加样回收率，得该方法的平均回收率为97.49％，rsd为2.48％(n＝6)。表明本法回收率良好。结果见表16。
[0138]
表16加样回收率实验结果
[0139][0140]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精
神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。