一种结合薄层色谱和酶抑制原理快速检测农药的方法

1.本发明属于农药检测技术领域，具体涉及一种结合薄层色谱和酶抑制原理快速检测农药的方法。


背景技术：

2.有机磷和氨基甲酸酯类农药是目前农业生产中仍在使用的高毒农药，其在食用农产品中的残留对消费者健康造成了严重风险。
3.目前，上述两类农药的主流快速检测方法是酶抑制法。其主要原理是：胆碱酯酶等酶可以催化特定底物水解显色或产生荧光或电化学信号，而高毒农药可以抑制酶的活性，影响上述反应的发生，进而通过光学或电化学信号的改变来测量农药的种类和含量。但在该方法中，反应体系多采用pbs或tris-hcl等水性缓冲液，以保证酶催化反应的正常进行，但水系缓冲液仅能提取农产品表面的部分农药，提取效率不足。而农药残留经典的前处理方法多采用有机溶剂进行提取，以保证样品中农药的提取效率。例如经典的quechers(quick、easy、cheap、effective、rugged、safe)快速样品前处理技术，最终的提取溶剂为乙腈或甲醇。而有机溶剂对酶等生物识别元件的活性存在显著影响。
4.上述前处理溶剂体系和酶抑制反应溶液体系的矛盾，导致了酶抑制法检测农药时，存在严重的假阳性和假阴性，限制该方法使用的同时，对食品安全也造成了隐患。为了解决这一问题，申请号为cn202010505846.6的中国发明专利公开了一种适用于检测有机溶剂提取样品农药残留的酶抑制速测卡、独立进样卡片及其使用方法。其酶抑制速测卡由进样卡片、酶区卡片、底物卡片组成。该发明提供的酶抑制速测卡，新增进样区卡片；利用纸质材料超大的比表面积，加速进样区有机溶剂的在线挥发，待有机溶剂挥干后，通过折叠、贴合等方式，依次展开酶抑制、显色反应，满足样品有机相前处理与酶抑制法相结合、有机溶剂与固定化酶零接触的双重需求，提高酶抑制速测卡检测灵敏度与准确性。但是在对农产品中农药的残留进行检测时，样品提取液中通常含有色素等干扰物质，这些物质会影响检测结果的准确性。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种结合薄层色谱和酶抑制原理快速检测农药的方法。将薄层色谱分离(tlc)和酶抑制法相结合，建立了快速检测农产品中有机磷和氨基甲酸酯类农药的新方法。
6.为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
7.提供一种结合薄层色谱和酶抑制原理快速检测农药的方法，包括以下步骤：
8.s1、将薄层色谱板裁剪成长方形，一端用于接触样品提取液，构成农残分离区；将其另一端用滤纸或玻璃纤维剪成的小片覆盖并固定在酶抑制反应试纸上，构成农残富集区；将酶抑制反应试纸远离农残分离区的一边黏贴上固定有显色试剂的滤纸片，构成底物显色区；
9.s2、在样品槽中加入50微升农产品样品提取液，将农残分离区插入样品槽，进行薄层色谱分离展开；
10.s3、当样品提取液随展开剂迁移至农残分离区上端时，将农残分离区从样品槽中拔出，平放，在空气中干燥1min；
11.s4、在农残富集区滴加25微升酶的水相工作液，30s后将底物显色区折叠，使其与农残富集区重叠，用手捏紧1-3min，进行显色反应；若样品提取液中不含农药，底物显色区显色，且显色产物被农残富集区的纸片吸附；若样品提取液中含有超标农药，底物显色区显色不充分或不显色，农残富集区的纸片富集不到显色产物，通过颜色变化与否，即可判定样品中是否含有农药。
12.进一步地，步骤s1中，薄层色谱板的支持介质为玻璃或金属箔。
13.进一步地，步骤s2中，样品提取液采用quechers方法制备，以乙腈或甲醇作为溶剂。
14.进一步地，步骤s4中，在农残富集区预先固定上酶的滤纸片，然后与底物显色区折叠。
15.本发明的有益效果为：
16.本发明提供的方法克服了有机溶剂提取与酶在水系溶液下反应的矛盾，同时减少了农产品样品中色素等物质的干扰，增加了农药残留快速检测的效率和准确性。
附图说明
17.图1为本发明方法检测用农残分离区、农残富集区、底物显色区示意图；
18.图2为本发明方法对比例2检测结果示意图；从左至右依次为50μl磷酸缓冲液组、50μl含0.05mg/l n-甲基氨基甲酸酯的甲醇溶液组、50μl含0.05mg/l n-甲基氨基甲酸酯和0.05mg/l色素的甲醇溶液组。
具体实施方式
19.下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
20.实施例
21.一种结合薄层色谱和酶抑制原理快速检测农药的方法，包括以下步骤：
22.s1、将薄层色谱板(支持介质可以为玻璃或金属箔)裁剪成长方形，一端用于接触样品提取液，构成农残分离区；将其另一端用滤纸或玻璃纤维剪成的小片覆盖并固定在酶抑制反应试纸上，构成农残富集区；将酶抑制反应试纸远离农残分离区的一边黏贴上固定有显色试剂的滤纸片，构成底物显色区。如图1所示。
23.s2、在样品槽中加入50微升农产品样品提取液，将农残分离区插入样品槽，进行薄层色谱分离展开。由于有机磷和氨基甲酸酯类农药在有机相中分配比例较大，而叶绿素等色素的分配比例相对较小，可以实现农药和样品基质中色素等干扰物质的有效分离。
24.s3、当样品提取液随展开剂迁移至农残分离区上端时，即被农残富集区接收，此时
将农残分离区从样品槽中拔出，平放，在空气中干燥1min，有机溶剂即可被挥发干净，农残即被吸附至农残富集区。
25.s4、在农残富集区滴加25微升酶的水相工作液(农残富集区也可使用预先固定上酶的滤纸片)，30s后将底物显色区折叠过来，使其与农残富集区重叠，用手捏紧1-3min，进行显色反应。若样品提取液中不含农药，农残富集区上的酶催化底物显色区显色，且显色产物被农残富集区的纸片吸附；若样品提取液中含有农药，农残富集区富集的农药抑制了酶的活性，底物显色区显色不充分或不显色，农残富集区的纸片富集不到显色产物。通过颜色变化与否，即可判定样品中是否含有农药。
26.反应结束后，利用扫描仪扫描或手机拍照及软件分析等形式，可以对特定农药进行半定量分析，判断样品中是否农药超标。
27.对比例1
28.为了说明本发明方法相比常规酶抑制法具有更快的检测效率和更高的准确性。将常规酶抑制法和本发明方法进行对比测试，测试方法如下：
29.常规酶抑制法使用酶抑制反应试纸进行农药检测，其只含有酶区和底物区，测试方法如下：
30.分别在3张常规酶抑制反应试纸的酶区滴加50μl磷酸缓冲液、50μl纯甲醇溶液、50μl含0.05mg/l n-甲基氨基甲酸酯的甲醇溶液，在37℃下孵育10min，然后通过折叠的方式将3张酶抑制反应试纸的酶区和底物区重叠贴合接触，用手捏紧3min，进行显色反应。将酶区和底物区分离，观察酶区颜色。以滴加磷酸缓冲液的酶抑制反应试纸的酶区为对照品，阴性。与对照品相比，滴加50μl纯甲醇溶液、50μl含0.05mg/l n-甲基氨基甲酸酯的甲醇溶液的酶区颜色均变淡，检测结果显示为阳性，表明常规酶抑制反应试纸易受有机溶剂的干扰，无法有效辨别有机相溶液中农药浓度水平，在检测过程中易产生假阳性结果，难以保障检测结果的准确性。
31.用本发明提供的方法进行测试，测试方法如下：
32.s1、将薄层色谱板裁剪成长方形，一端用于接触样品提取液，构成农残分离区；将其另一端用滤纸或玻璃纤维剪成的小片覆盖并固定在酶抑制反应试纸上，构成农残富集区；将酶抑制反应试纸远离农残分离区的一边黏贴上固定有显色试剂的滤纸片，构成底物显色区。
33.s2、在三个样品槽中分别加入50μl磷酸缓冲液、50μl纯甲醇溶液、50μl含0.05mg/l n-甲基氨基甲酸酯的甲醇溶液，然后将三个农残分离区分别插入三个样品槽，进行薄层色谱分离展开。
34.s3、当样品提取液随展开剂迁移至农残分离区上端时，将农残分离区从样品槽中拔出，平放，在空气中干燥1min。
35.s4、在农残富集区滴加25微升酶的水相工作液，30s后将底物显色区折叠过来，使其与农残富集区重叠，用手捏紧3min，进行显色反应。
36.以磷酸缓冲液组的底物显色区为对照品，阴性。与对照品相比，纯甲醇溶液组的底物显色区颜色无变化，也为阴性。而0.05mg/l n-甲基氨基甲酸酯的甲醇溶液组的底物显色区颜色变淡，检测结果为阳性，表明本发明提供的方法克服了有机溶剂提取与酶在水系溶液下反应的矛盾，增加了农药残留快速检测的效率和准确性。
37.对比例2
38.为了说明本发明方法与申请号为cn202010505846.6的中国发明专利公开的一种适用于检测有机溶剂提取样品农药残留的酶抑制速测卡、独立进样卡片及其使用方法相比，能够减少农产品样品中色素等物质的干扰，增加农药残留检测的准确性，进行对比测试，测试方法如下：
39.用申请号为cn202010505846.6的中国发明专利公开的独立进样卡片与常规酶抑制速测卡配套使用，检测方法如下：
40.分别在3张进样卡的进样区滴加50μl磷酸缓冲液、50μl含0.05mg/l n-甲基氨基甲酸酯的甲醇溶液、50μl含0.05mg/l n-甲基氨基甲酸酯和0.05mg/l色素(在本次检测中，添加的色素为叶绿素，但是在实际应用中，农产品中的色素包括但不限于叶绿素)的甲醇溶液，放置于室温下，待水分和有机溶剂完全挥发后，将进样区与酶区对齐使其完全贴合接触以促发酶抑制反应，在37℃下孵育10min，孵育完全后，解除进样区与酶区的接触，通过折叠方式将酶区与底物区完全重叠贴合接触以促发酶显色反应，在37℃下反应3min，将酶区和底物区分离，观察酶区颜色。
41.以磷酸缓冲液组的酶区为对照品，阴性。与对照品相比，0.05mg/l n-甲基氨基甲酸酯的甲醇溶液组的酶区颜色变淡，检测结果为阳性。而与对照品相比，0.05mg/l n-甲基氨基甲酸酯和0.05mg/l色素的甲醇溶液组的酶区颜色无明显变化，检测结果为阴性。表明该检测方法在色素等干扰物质存在的情况下，在检测过程中易产生假阳性结果，难以保障检测结果的准确性。
42.用本发明提供的方法进行测试，测试方法如下：
43.s1、将薄层色谱板裁剪成长方形，一端用于接触样品提取液，构成农残分离区；将其另一端用滤纸或玻璃纤维剪成的小片覆盖并固定在酶抑制反应试纸上，构成农残富集区；将酶抑制反应试纸远离农残分离区的一边黏贴上固定有显色试剂的滤纸片，构成底物显色区。
44.s2、在三个样品槽中分别加入50μl磷酸缓冲液、50μl含0.05mg/l n-甲基氨基甲酸酯的甲醇溶液、50μl含0.05mg/l n-甲基氨基甲酸酯和0.05mg/l色素的甲醇溶液，然后将三个农残分离区分别插入三个样品槽，进行薄层色谱分离展开。
45.s3、当样品提取液随展开剂迁移至农残分离区上端时，将农残分离区从样品槽中拔出，平放，在空气中干燥1min。
46.s4、在农残富集区滴加25微升酶的水相工作液，30s后将底物显色区折叠过来，使其与农残富集区重叠，用手捏紧3min，进行显色反应。
47.参照图2，以磷酸缓冲液的底物显色区为对照品，阴性。与对照品相比，0.05mg/l n-甲基氨基甲酸酯的甲醇溶液组、0.05mg/l n-甲基氨基甲酸酯和0.05mg/l色素的甲醇溶液组的底物显色区颜色均变淡，检测结果为阳性，表明本发明提供的方法能够减少农产品样品中色素等物质的干扰，增加农药残留检测的准确性。
48.由于有机磷和氨基甲酸酯类农药在有机相中分配比例较大，而叶绿素等色素的分配比例相对较小，本发明提供的方法可以实现农药和样品基质中色素等干扰物质的有效分离。克服了有机溶剂提取与酶在水系溶液下反应的矛盾，同时减少了农产品样品中色素等物质的干扰，增加了农药残留快速检测的效率和准确性。
49.于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
50.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。