一种利用HPLC检测4-羟基咔唑含量的方法与流程

一种利用hplc检测4-羟基咔唑含量的方法
技术领域
1.本发明属于化学检测技术领域，涉及一种利用hplc检测4-羟基咔唑含量的方法。


背景技术：

2.卡维地洛是α、β受体阻断剂，具有舒张血管作用，用于治疗轻度及中度高血压或伴有肾功能不全、糖尿病的高血压病症。4-羟基咔唑是合成卡维地洛的重要中间体，因此具有很重要的地位。
3.目前，4-羟基咔唑的含量检测方法并无相关文献报道。为了保证合成卡维地洛的成功率，需要对合成卡维地诺的中间体进行质量控制，含量是其必须要检测项目。因4-羟基咔唑是一种三环芳香杂环化合物，碱性和氧化条件会影响其稳定性，生成的杂质会影响其含量的测定，因此，寻求一种能够有效检测4-羟基咔唑含量的方法，对于其质量控制具有十分重要的意义，同时，适合含量的4-羟基咔唑对成功合成卡维地洛也具有十分重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出一种操作简单、准确度高、检测效率高、专属性好的利用高效液相色谱法(hplc)检测4-羟基咔唑含量的方法。
5.本发明的技术方案中一种利用hplc检测4-羟基咔唑含量的方法，包括如下步骤：
6.s1、将4-羟基咔唑对照品溶解于甲醇中得对照溶液；
7.s2、将待检品溶解于甲醇中得供试品溶液；
8.s3、将对照溶液、供试品溶液分别注入液相色谱仪，使用hplc检测待测品中4-羟基咔唑的含量。
9.进一步地，步骤s1中对照溶液中4-羟基咔唑浓度为0.04～0.06mg/ml。用4-羟基咔唑纯品作为对照物质，以对照物质和待检品中待测组分的响应信号(即峰面积大小)相比较进行定量，用该方法计算4-羟基咔唑含量，简单准确。
10.进一步地，步骤s3中hplc检测的流动相为：流动相a：0.04～0.06v/v％磷酸水溶液和流动相b：乙腈的混合液。
11.0.04～0.06v/v％磷酸水溶液可以用来调节峰型，一般流动相的ph值是根据样品的ph值来定的，要根据样品的pka或者pkb值来确定，磷酸就是通过调节酸碱性来修饰峰型。同时磷酸水溶液可以作为离子抑制剂，有助于分离物质。以0.04～0.06v/v％磷酸水溶液和乙腈混合液为流动相，使得4-羟基咔唑峰型较好，且其他物质不干扰其含量检测。
12.进一步地，步骤s3中hplc检测过程中流动相流速为0.8～1.2ml/min。通过控制流动相的流速，可以使4-羟基咔唑与其他物质得到有效的分离，从而更准确的计算供试品溶液中4-羟基咔唑的含量。
13.进一步地，hplc检测采用梯度洗脱，梯度洗脱参数如下：0～5min，流动相a含量从75～85v/v％逐渐降低至55～65v/v％；5～15min，流动相a含量在55～65v/v％范围内维持不变；15～16min，流动相a含量从55～65v/v％逐渐升高至75～85v/v％；16～20min，流动相
a含量在75～85v/v％范围内维持不变。采用梯度洗脱并控制梯度洗脱流动相比例，有利于4-羟基咔唑与其他物质分离，可以有效去除其它杂质对4-羟基咔唑含量测定的影响。
14.进一步地，步骤s3中hplc检测过程中色谱柱为粒径3～8μm的c18色谱柱，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。
15.进一步地，步骤s3中hplc检测过程中色谱柱的柱温为25～35℃。通过控制柱温可以使物质的保留时间具有再现性，在该柱温范围内，能使4-羟基咔唑与其他物质得到有效的分离，同时能保护色谱柱。
16.进一步地，步骤s3中hplc检测过程中使用的检测器为紫外可见吸收检测器，检测波长为210～220nm。
17.进一步地，所述hplc检测方法的检测线性范围为0.025～0.075mg/ml。当待检品中4-羟基咔唑含量在该范围内，4-羟基咔唑测定具有良好的线性范围，准确度高。
18.与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
19.(1)本发明的技术方案利用hplc检测4-羟基咔唑含量的方法，操作简单，准确度高，检测效率高，专属性好，线性良好；
20.(2)以磷酸水溶液和乙腈混合液为流动相，使得4-羟基咔唑峰型较好，且其他物质不干扰其含量检测，磷酸溶液可以作为离子抑制剂，有助于分离物质；
21.(3)采用梯度洗脱并控制梯度洗脱流动相比例，有利于4-羟基咔唑与其他物质分离，可以有效去除其它杂质对4-羟基咔唑含量测定的影响；
22.(4)本发明利用hplc检测4-羟基咔唑含量的方法中检测线性范围为0.025～0.075mg/ml，在此范围内线性回归系数r2为0.9998，线性良好；
23.(5)采用本发明检测方法选择合适含量的4-羟基咔唑，可以进一步有效提升卡维地洛合成的成功率。
附图说明
24.图1为实施例1中4-羟基咔唑含量的典型图谱；
25.图2为实施例1中4-羟基咔唑未破坏、酸、碱、氧化、加热以及光破坏后的hplc色谱图；
26.图3为实施例1中4-羟基咔唑未破坏的峰纯度图谱；
27.图4为实施例1中4-羟基咔唑酸破坏的峰纯度图谱；
28.图5为实施例1中4-羟基咔唑碱破坏的峰纯度图谱；
29.图6为实施例1中4-羟基咔唑氧化破坏的峰纯度图谱；
30.图7为实施例1中4-羟基咔唑液体高温破坏的峰纯度图谱；
31.图8为实施例1中4-羟基咔唑固体高温破坏的峰纯度图谱；
32.图9为实施例1中4-羟基咔唑液体光照破坏的峰纯度图谱；
33.图10为实施例1中4-羟基咔唑固体光照破坏的峰纯度图谱；
34.图11为对比例1中的4-羟基咔唑氧化破坏的峰纯度图谱；
35.图12为对比例2中的4-羟基咔唑氧化破坏的峰纯度图谱；
36.图13为4-羟基咔唑的线性关系图；
37.图14为4-羟基咔唑的准确度典型图谱。
具体实施方式
38.下面通过具体实施例和附图，对本发明的技术方案作进一步描述说明，应当理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于帮助理解本发明，不用于本发明的具体限制。且本文中所使用的附图，仅仅是为了更好地说明本发明所公开内容，对保护范围并不具有限制作用。如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。
39.实施例1
40.目前国内已有较多的4-羟基咔唑供应商，从中选取上海邦成化工有限公司的产品、麦克林的试剂、宁波三生生物科技有限公司的样品，采用本发明4-羟基咔唑含量的hplc检测方法进行测定，测定方法步骤具体如下：
41.对照品：4-羟基咔唑对照品(批号0708-rd-0041，含量99.1％；由广州佳途科技股份有限公司提供)；
42.试药：乙腈(色谱纯，批号20220106，由国药集团化学试剂有限公司提供)、磷酸(分析纯，批号c12747031，由国药集团化学试剂有限公司提供)、甲醇(色谱纯，批号20211103，由国药集团化学试剂有限公司提供)
43.样品：4-羟基咔唑(批号20201101，上海邦成化工有限公司生产)、4-羟基咔唑(批号c12044016，麦克林试剂有限公司生产)、4-羟基咔唑(批号20210501，宁波三生生物科技股份有限公司生产)
44.色谱条件：welchplus c18 4.6*250mm，5μm色谱柱，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.05％磷酸溶液(取磷酸溶液0.5ml，加水1000ml使溶解)为流动相a，以乙腈为流动相b，按照下表进行梯度洗脱，流速为：1ml/min，柱温为30℃，检测波长为215nm。流动相梯度洗脱如表1所示：
45.表1本实施例流动相梯度洗脱条件
46.时间/min流动相a％流动相b％0802056040156040168020208020
47.对照溶液的制备：取4-羟基咔唑对照品25mg，精密称定，置25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，精密量取1ml，用甲醇稀释至20ml，摇匀即得。
48.供试品溶液的制备：取待检品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，精密量取1ml，用甲醇稀释至20ml，摇匀即得。
49.测定方法：精密量取对照溶液和供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，按上述的色谱条件进行测定，记录色谱图。
50.(1)含量测定结果：对上述样品进行测定，用外标法计算4-羟基咔唑含量。
51.上海邦成化工有限公司的样品含量为99.9％，麦克林的试剂含量为99.4％，宁波三生生物科技有限公司合成的样品含量为94.7％，结果见表2，hplc色谱图见1，从图1和表2中可以看出，本发明的hplc检测方法适用于不同来源的4-羟基咔唑含量的检测。
52.表2：各公司的4-羟基咔唑含量测定结果汇总表
53.来源批号含量％上海邦成化工有限公司2020110199.9麦克林c1204401699.4宁波三生生物科技有限公司2021050194.7
54.(2)专属性试验
55.氧化破坏试验：取20mg 4-羟基咔唑，精密称定，置20ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，精密量取1ml置20ml量瓶中，加入30％双氧水1ml，于室温放置19小时后，用甲醇稀释定容至刻度，摇匀。4-羟基咔唑含量为94.8％，主峰峰纯度大于990。
56.高温液体破坏试验：取20mg 4-羟基咔唑，精密称定，置20ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，置60℃烘箱中，放置5天，精密量取1ml置20ml量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，摇匀。4-羟基咔唑含量为99.4％，主峰峰纯度大于990。
57.高温固体破坏试验：取适量4-羟基咔唑，置60℃烘箱中，放置5天，精密称取约20mg，置20ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，精密量取1ml置20ml量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，摇匀。4-羟基咔唑含量为98.9％，主峰峰纯度大于990。
58.光照液体破坏：取20mg 4-羟基咔唑，精密称定，置20ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，置4500lx
±
500lx光照箱中，放置5天，精密量取1ml置20ml量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，摇匀。4-羟基咔唑含量为99.8％，主峰峰纯度大于990。
59.光照固体破坏试验：取适量4-羟基咔唑，置4500lx
±
500lx光照箱中，放置5天，精密称取约20mg，置20ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，精密量取1ml置20ml量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，摇匀。4-羟基咔唑含量为98.7％，主峰峰纯度大于990。
60.酸破坏试验：取20mg 4-羟基咔唑，精密称定，置20ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，精密量取1ml置20ml量瓶中，加入1mlo/l盐酸溶液1ml，于室温放置19小时后，加入1mol/l氢氧化钠溶液1ml，用甲醇稀释定容至刻度，摇匀。4-羟基咔唑含量为101.4％，主峰峰纯度大于990。
61.碱破坏试验：取20mg 4-羟基咔唑，精密称定，置20ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，精密量取1ml置20ml量瓶中，加入1mlo/l氢氧化钠溶液1ml，于室温放置19小时后，加入1mol/l盐酸溶液1ml，用甲醇稀释定容至刻度，摇匀。4-羟基咔唑含量为85.0％，主峰峰纯度大于990。
62.上述各种破坏方式用外标法计算含量，含量结果如下表3所示，未破坏、酸、碱、氧化、加热、光照破坏的色谱图如图2所示，未破坏的供试品中主峰的峰纯度图谱如图3所示，酸破坏的供试品中主峰的峰纯度图谱如图4所示，碱破坏的供试品中主峰的峰纯度图谱如图5所示，氧化破坏的供试品中主峰的峰纯度图谱如图6所示，液体加热破坏的供试品中主峰的峰纯度图谱如图7所示，固体加热破坏的供试品中主峰的峰纯度图谱如图8所示，液体光照破坏的供试品中主峰的峰纯度图谱如图9所示，固体光照破坏的供试品中主峰的峰纯度图谱如图10所示。从表3以及图2-9可知，hplc图谱的主峰中没有包含其它峰，峰型很好，说明该方法适用于未破坏4-羟基咔唑含量、4-羟基咔唑酸降解含量、4-羟基咔唑碱降解含量、4-羟基咔唑氧化降解含量、4-羟基咔唑溶液高温降解含量、4-羟基咔唑固体高温降解含量、4-羟基咔唑溶液光照降解含量、4-羟基咔唑固体光照降解含量的测定。4-羟基咔唑在氧
化和碱破坏条件下不稳定，储存和运输应考虑这两个条件。
63.表3：各种破坏方式含量对比表
[0064][0065][0066]
对比例1
[0067]
本对比例与实施例1的区别仅在于不采用梯度洗脱，0-20min都是60％流动相a和40％流动相b。
[0068]
取20mg 4-羟基咔唑，精密称定，置20ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，精密量取1ml置20ml量瓶中，加入30％双氧水1ml，于室温放置19小时后，用甲醇稀释定容至刻度，摇匀。供试品中主峰的峰纯度图谱如图11所示，4-羟基咔唑峰纯度为886.44，峰纯度小于990，证明专属性不好。
[0069]
对比例2
[0070]
本对比例与实施例1的区别仅在于梯度洗脱如表4所示：
[0071]
表4本对比例流动相梯度洗脱条件
[0072]
时间/min流动相a％流动相b％0604058020166040206040
[0073]
取20mg 4-羟基咔唑，精密称定，置20ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，精密量取1ml置20ml量瓶中，加入30％双氧水1ml，于室温放置19小时后，用甲醇稀释定容至刻度，摇匀。供试品中主峰的峰纯度图谱如图12所示，4-羟基咔唑峰纯度为972.35，峰纯度小于990，证明专属性不好。
[0074]
(3)方法线性：
[0075]
取4-羟基咔唑对照品25mg，精密称定，置25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，作为线性储备液，精密量取适量线性储备液，加甲醇溶解并稀释成各浓度溶液，如表4所示。按本发明方法中限定的色谱条件进行测定，线性关系以测得的响应信号(峰面积)对被分析物浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归，4-羟基咔唑的线性关系如图13所示。从表
5和图13中可知，4-羟基咔唑的线性范围在0.025mg/ml～0.075mg/ml，在此范围内线性回归系数r2为0.9998，证明线性良好。
[0076]
表5：溶液浓度与峰面积对比表
[0077][0078][0079]
(4)方法准确度：
[0080]
取4-羟基咔唑对照品25mg，精密称定，置25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，作为准确度储备液，精密量取适量准确度储备液，加甲醇溶解并稀释成各浓度溶液，如表6所示。按本发明方法中限定的色谱条件进行测定，准确度图谱如图12所示。从图14和表6中可知，4-羟基咔唑在0.04mg/ml～0.06mg/ml范围内，回收率在98.0％-101.0％范围内，回收率的rsd为0.5％，证明准确度良好。
[0081]
表6：溶液浓度与回收率对比表
[0082][0083]
综上所述，本发明提供的4-羟基咔唑含量的hplc检测方法操作简单，准确度高，检测效率高，专属性好，线性良好，采用本发明检测方法能进一步有效控制4-羟基咔唑的质量，同时，适合含量的4-羟基咔唑对成功合成卡维地洛也具有十分重要的意义。
[0084]
最后应说明的是，本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明，而并非对本发明的实施方式的限定。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具有实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，这里无需也无法对所有的实施方式予以全例。而这些属于本发明的实质精神所引申出的显而易见的变化或变动仍属于本发明的保护范围，把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。