一种猫血型快速检测卡及其检测方法与流程

1.本发明涉及猫血型检测技术领域，尤其涉及一种猫血型快速检测卡及其检测方法。


背景技术：

2.猫的血型有a型、b型和ab型三种类型，其中a型最多，b型次之，ab型最为罕见。与狗不同，猫具有针对“非自身”或外来红细胞的抗体，这些抗体可引起致命的免疫反应。b型猫体内有很强的附属抗a型抗体，当a型猫的血输给b型猫时，会引起强烈的免疫反应，输入的红细胞半衰期只有几分钟至几小时，进而引发输血急性或亚急性溶血反应，导致被输血的猫死亡。临床上只要1毫升a型猫血，就足以让b型猫产生严重的免疫反应。a型猫体内有较弱的附属抗b型抗体，当b型猫的血输给a型猫时，也会引起免疫反应，其反应较轻但也会缩短红细胞寿命，使其半衰期为2天。由于输血血型不合会导致致命的急性溶血反应，因此猫在输血前，确定其血型非常重要。另外，对于猫的繁育，确定血型也尤为重要，临床上猫新生儿溶血的现象时有发生，究其原因是母猫的奶中含有“非自身”血型的抗体，当b血型的母猫母乳喂养a型或ab型血的幼猫时，会使幼猫在两周内产生溶血，黄疸、褐色尿的症状甚至死亡。因此，猫血型的确认对繁育也至关重要。
3.目前，使用猫血型快速检测试剂盒检测猫血型是使用最广泛的检测方法，市面上猫血型快速检测试剂盒的主流品牌为rapid和这三种试剂盒都存在成本偏高，准确性偏低的问题。这是因为猫的ab血型系统不同于人的abo血型系统，在人群中各血型分布相对平均，其检测血型的原料可以从样本中大量制备，而猫的a型、b型和ab型数量差距较大，b型血远远少于a型血，ab型血更是稀缺，因此从b型血和ab型血中获得相应的抗原较为困难。再次，猫和人的红细胞大小不同，市面上锁血的试剂一般都针对人红细胞开发，并不能有效的对猫的红细胞进行吸附定植。最后，临床上猫的贫血症状较为隐蔽，并且猫不具有与人沟通的能力，因此较难发现有自身血凝和血凝抑制障碍的猫，而现有的猫血型快速检测试剂盒的性能不足以准确辨别这些猫咪的血型。


技术实现要素：

4.本发明为了克服现有技术下猫血型检测成本较高，检测结果准确性较差问题，提供一种猫血型快速检测卡，该检测卡结果读取直观快速，能检测普通猫血液样本、贫血样本和血凝异常样本的血型，且价格便宜。本发明还提供了一种使用猫血型快速检测卡的检测方法，该检测方法操作简单，检测准确度高。
5.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种猫血型快速检测卡，所述检测卡包括上壳以及与上壳固定连接的下壳；所述上壳设有a窗口、b窗口、c窗口以及缓冲液孔；所述下壳内侧卡扣a型血试纸条、b型血试纸条和质控c试纸条，a型血试纸条、b型血试纸条和质控c试纸条均包括依次叠加在片材底板上的样品垫i、反应垫、样品垫ii和吸水垫，其中a型血试纸条、b型血试纸条和质控c试纸条的
反应垫分别与a窗口、b窗口和c窗口对应，样品垫i一端与缓冲液孔对应。
6.本发明利用不同蛋白对含有不同抗原的猫红细胞的特异性凝集效果检测猫的血型。待测样品从a窗口、b窗口、c窗口加入并通过a窗口、b窗口、c窗口观察血液凝集情况以得到结果，该检测卡能够准确检测猫的血型，并且该检测卡体积小巧美观，滴加简便，有效期长，检测结果准确度高。
7.作为优选，所述a型血试剂条的反应垫包含抗猫a型血多克隆抗体，b型血试剂条的反应垫包含小麦凝集素，质控c试剂条的反应垫包含红细胞凝集素。
8.抗猫a型血多克隆抗体可结合含有a型血抗原的红细胞；适量的小麦凝集素可会与b型猫抗原的红细胞产生明显凝集反应，而对a型猫红细胞则无凝集现象；红细胞凝集素可凝集所有血型的红细胞以达到验证本发明装置的检测结果的效果。
9.作为优选，所述抗猫a型血多克隆抗体的制备方法为将猫a型血离心，去除上清，用0.005-0.05m氯化铵溶液进行破碎，去除上清，再用生理盐水清洗，去除上清，将血浆沉淀稀释，用等比量佐剂配制抗原，乳化完全后于兔脊背处免疫，待兔血清效价达到1：100000以上，采集兔血，静置后离心，取上面的血清，纯化完成后即获得抗猫a型血多克隆抗体。
10.作为优选，所述的猫a型血试纸条的反应垫经处理液i处理后干燥；所述处理液i的ph为7.5-8.5，其组分包括水、5-10g/l磷酸氢二钠、5-20g/l bsa、10-15g/l蔗糖、2-20g/l海藻糖、0.01-0.02％proclin300、0.01-1mg/ml抗猫a型血抗体。
11.作为优选，所述的猫b型血试纸条的反应垫经处理液ii处理后干燥；所述处理液ii的ph为7.5-8.5，其组分包括水、5-10g/l磷酸氢二钠、5-15g/l bsa、10-15g/l蔗糖、2-20g/l海藻糖、0.01-0.02％proclin300、0.01-0.2mg/ml小麦凝集素。
12.小麦凝集素的浓度过高时会使a型猫红细胞凝集，影响检测结果。
13.作为优选，所述质控c试纸条的反应垫经处理液iii处理后干燥；所述处理液iii的ph为7.5-8.5，其组分包括水、5-10g/l磷酸氢二钠、5-15g/l bsa、10-15g/l蔗糖、2-20g/l海藻糖、0.01-0.02％proclin300、0.01-0.8mg/ml红细胞凝集素。
14.作为优选，所述红细胞凝集素为接骨木凝集素或怀槐凝集素。
15.作为优选，所述猫a型血试纸条、猫b型血试纸条和质控c试纸条的反应垫干燥过程为冷冻干燥10-15h。
16.作为更优选，所述冷冻干燥的温度为-50
±
5℃。
17.作为优选，所述处理液i、处理液ii和处理液iii还包括染料，染料为溴酚蓝、柠檬黄或苋菜红。
18.染料可监测跑板是否正常进行，并且降低试纸生产过程中的混料风险。
19.一种使用猫血型快速检测卡的猫血型检测方法，其特征是，包括如下步骤：(1)在a窗口、b窗口和c窗口中分别加入8-12μl猫全血样本，静置3-5min；(2)在缓冲液孔加入80-100μl滴缓冲液，2-5min后读取实验结果。
20.a窗口、b窗口和c窗口加样后，静置3-5min，使猫血样本与反应垫先行结合，再在缓冲液孔加缓冲液以冲洗反应垫，能凝集结合的红细胞就被固定在反应垫上而显现阳性结果，不能结合的红细胞因无法固定在反应垫上而显现阴性结果。当a窗口和c窗口有红色血块，b窗口无红色血块，表示猫为a型血；b窗口和c窗口有红色血块，a窗口无红色血块，表示
猫为b型血；a窗口、b窗口和窗口c均有红色血块，表示猫为ab型血；c窗口无红色血块出现，无论a窗口和b窗口是否出现红色血块，结果均无效。
21.作为优选，所述缓冲液为包括液体生物防腐剂的ph为7.0-7.5的磷酸盐缓冲液。
22.缓冲液起到使过滤样本中的杂质和辅助样本跑板进而实现层析的作用，磷酸盐缓冲液中氯化钠和磷酸氢二钠可提供一个稳定的离子检测环境，消除部分干扰性结合，降低临床假阳性，提高临床检出率。
23.因此，本发明具有以下有益效果：(1)a型血试纸条中的抗猫a型血抗体特异性好，能与猫的a型血有强亲和性，而b型血试纸条中的小麦凝集素对猫的b型血特异性好，可减少临床漏检风险；(2)操作简便，结果显示直观清晰，肉眼就可判断，非专业人士也可以使用；(3)特有的先静置吸附固定再冲洗杂质的样本反应方式，配合优化过的缓冲液配方，可实现对特殊样本如自身血凝样本、血凝抑制样本、贫血样本的纠偏，进而实现血型的准确检测。
附图说明
24.图1为本发明猫血型快速检测卡中上壳结构的俯视图。
25.图2为本发明猫血型快速检测卡中上壳内侧结构示意图。
26.图3为本发明猫血型快速检测卡中下壳内侧结构示意图。
27.其中，1-上壳，11-a窗口，12-b窗口，13-c窗口，14-缓冲液孔，15-信息扫描区域，16-信息记录区，17-固定辅助柱，18-试纸压紧柱，19-试纸压紧块，2-下壳，21-试剂条卡槽，211-固定凸起，22-连接条，23-玻纤池，24-固定凹槽，3-a型血试纸条，31-a型血试纸条的反应垫，4-b型血试纸条，41-b型血试纸条的反应垫，5-质控c试纸条，51-质控c试纸条的反应垫，6-空白玻纤。
具体实施方式
28.下面结合附图与具体实施方法对本发明做进一步的描述。
29.实施例1一种猫血型快速检测卡，其结构如图1-3所示，包括上壳1和下壳2，上壳1和下壳2的材质均为塑料，上壳1和下壳2的边缘结构设有可将上壳1和下壳2结合固定的卡扣结构。上壳1中间部分从左至右依次设有a窗口11、b窗口12和c窗口13，在a窗口11、b窗口12和c窗口13的下方设有缓冲液孔14，在a窗口11、b窗口12和c窗口13的上方设有可印刷二维码的信息扫描区域15，上壳1的顶部设有可填写、记录宠物名和血型结果的信息记录区16。下壳2内侧最上端设有三个试剂条卡槽21，试剂条卡槽21从左至右依次固定a型血试纸条3、b型血试纸条4和质控c试纸条5，下壳2在a型血试纸条3的左侧以及质控c试纸条5右侧对应设置了两对固定凸起211，下壳2下端还设有玻纤池23，玻纤池23中设有空白玻璃纤维。a型血试纸条3、b型血试纸条4和质控c试纸条5均包括依次黏贴在片材底板的样品垫i、反应垫、样品垫ii和吸水垫，其中样品垫i设置在片材底板最低端，样品垫i的一端被玻纤池23的空白玻纤覆盖，样品垫i另一端的顶部与反应垫一端底部相贴合，反应垫另一端顶部与样品垫ii一端底部贴合，样品垫ii另一端顶部与吸水垫一端底部贴合。a型血试纸条的反应垫31中含有抗猫a型血抗体，b型血试纸条的反应垫41中含有小麦凝集素，质控c试纸条的反应垫51中含有红细胞凝集素。上壳1内侧设有与下壳2内侧沿边缘分布的九个固定凹槽24对应的固定辅助柱
17，缓冲液孔14四周设有五个可在上壳1和下壳2卡扣时压住玻纤池23的小号试纸压紧柱18，上壳1内侧在玻纤池23上方设有三个分别与a型血试纸条3、b型血试纸条4和质控c试纸条5的样品垫i对应的试纸压紧块19。
30.该猫血型快速检测卡由如下步骤制备得到：(1)样品垫i制备：取8964空白玻纤切成2.7cm宽、30cm长；(2)a型血试纸条的反应垫制备：事先配制好反应垫处理液i，所述处理液i组分为水、7.1g/l磷酸氢二钠、10g/l bsa、12g/l蔗糖、3g/l海藻糖、0.02％proclin300、0.1mg/ml抗猫a型血抗体、0.04％溴酚蓝，调节ph为7.8；将处理液i按170ul/条均匀处理在30cm长、0.9cm宽的8964空白玻纤上，-50℃下冷冻干燥12h；抗猫a型血多克隆抗体由如下步骤制备得到：将猫a型血离心，去除上清，用生理盐水清洗红细胞，去除上清，再0.05m氯化铵溶液进行破碎，去除上清，再用生理盐水清洗，去除上清，将血浆沉淀稀释10倍，用等比量佐剂配制抗原，乳化完全后于兔脊背处免疫，待兔血清效价达到1：100000以上，采集兔血，静置后离心，取上面的血清，纯化完成后即获得抗猫a型血多克隆抗体；(3)b型血试纸条的反应垫制备：事先配制好反应垫处理液ii，所述处理液ii组分为水、7.1g/l磷酸氢二钠、10g/l bsa、12g/l蔗糖、3g/l海藻糖、0.02％proclin300、0.15mg/ml小麦凝集素、0.02％柠檬黄，调节ph为7.8；将处理液ii按170ul/条均匀处理在30cm长、0.9cm宽的8964空白玻纤上，-50℃下冷冻干燥12h；(4)质控c试纸条的反应垫制备：事先配制好反应垫处理液iii，所述处理液iii组分为水、7.1g/l磷酸氢二钠、10g/l bsa、12g/l蔗糖、3g/l海藻糖、0.02％proclin300、0.7mg/ml接骨木凝集素、0.02％苋菜红，调节ph为7.8；将处理液iii按170ul/条均匀处理在30cm长、0.9cm宽的8964空白玻纤上，-50℃下冷冻干燥12h；(5)样品垫ii制备：取8964空白玻纤切成0.5cm宽、30cm长；(6)吸水垫制备：取空白滤纸切成0.5cm宽、30cm长；(7)玻纤池的空白玻纤制备：取空白玻纤切成1.5cm宽、2cm长；(8)检测试剂条制备：将样品垫i、a型血试纸条的反应垫、样品垫ii和吸水垫依次黏贴在片材底板上再切割得到a型血试纸条，同样的步骤得到b型血试纸条和质控c试纸条，再装在各自对应的卡槽内，再加上玻纤池的空白玻纤，盖上上塑料壳，即得猫血型快速检测卡。
31.使用该猫血型快速检测卡的检测步骤为：(1)在a窗口、b窗口、和c窗口中分别加入10μl猫全血样本，静置3min；(2)在缓冲液孔加入80μl缓冲液，5min后读取实验结果；其中缓冲液的制备过程为将5g/l氯化钠、5g/l磷酸氢二钠及0.02％的液体生物防腐剂混合于水溶液中，调节混合液最终ph为8.0即得缓冲液。
32.实施例2一种猫血型快速检测卡，与实施例1的不同之处在于，其处理液i组分为水、10g/l磷酸氢二钠、15g/l bsa、15g/l蔗糖、10g/l海藻糖、0.02％proclin300、0.2mg/ml抗猫a型血抗体和0.04％溴酚蓝，ph为8.0；处理液ii组分为水、10g/l磷酸氢二钠、15g/l bsa、15g/l蔗糖、10g/l海藻糖、0.02％proclin300、0.2mg/ml小麦凝集素和0.02％柠檬黄，ph为8.0；处理液iii组分为水、10g/l磷酸氢二钠、15g/l bsa、15g/l蔗糖、10g/l海藻糖、0.02％
proclin300、0.7mg/ml接骨木凝集素和0.02％苋菜红，ph为8.0。
33.实施例3一种猫血型快速检测卡，与实施例1的不同之处在于，其处理液i组分为水、5g/l磷酸氢二钠、5g/l bsa、10g/l蔗糖、2g/l海藻糖、0.02％proclin300、0.1mg/ml抗猫a型血抗体和0.04％溴酚蓝，ph为7；处理液ii组分为水、5g/l磷酸氢二钠、5g/l bsa、10g/l蔗糖、2g/l海藻糖、0.02％proclin300、0.15mg/ml小麦凝集素和0.02％柠檬黄，ph为7；处理液iii组分为水、5g/l磷酸氢二钠、5g/l bsa、10g/l蔗糖、2g/l海藻糖、0.02％proclin300、0.7mg/ml怀槐凝集素和0.0.2％苋菜红，ph为7。
34.使用实施例1-3所得猫血型快速检测卡检测临床猫a型血、b型血、ab型血阳性样本以验证本发明检测卡的准确性，待测样品中30例猫a型血、15例猫b型血、5例猫ab型血、2例猫a型贫血样本、2例a型自体血凝样本、2例血凝抑制样本(1例a型，1例b型)的临床样本，以alvedia的easy quick test a+b检测结果为参照，检测结果见表1。
35.表1.alvedia、实施例1-3对猫不同血型样本检测结果样本alvedia实施例1实施例2实施例3a型血(30例)pos(30+)pos(30+)pos(30+)pos(30+)a型血贫血(2例)pos(2+)pos(2+)pos(2+)pos(2+)a型血自体血凝(2例)pos(1+)pos(2+)pos(2+)pos(2+)a型血血凝抑制(1例)pos(1+)pos(1+)pos(1+)pos(1+)b型血(15例)pos(15+)pos(15+)pos(15+)pos(15+)b型血血凝抑制(1例)pos(1+)pos(1+)pos(1+)pos(1+)ab型血(5例)pos(6+)pos(5+)pos(5+)pos(5+)“+”注：代表对应样本数量均为阳性。
36.结果表明，本发明所述的猫血型快速检测卡具有较高的准确度，对于正常血液样本，实施例1-3的准确率达到100％；对于异常血液样本，alvedia有错判的风险，而实施例1-3可得到有正确的检出结果。
37.对比例1一种猫血型快速检测卡，与实施例1的不同之处在于，其处理液ii中小麦凝集素的浓度为0.3mg/ml。
38.对比例2一种猫血型快速检测卡，与实施例1的不同之处在于，其样品垫经处理液处理后采用37℃烘干12h替代-50℃冷冻干燥12h。
39.对比例3一种猫血型快速检测卡，与实施例1的不同之处在于，其检测时使用的缓冲液制备方法为将30g/l氯化钠、2.13g/l磷酸氢二钠及0.02％的液体生物防腐剂混合于水溶液中，调节混合液最终ph为8.0。
40.表2.实施例1及对比例1-3对猫不同血型样本检测结果样本实施例1对比例1对比例2对比例3a型血(30例)pos(30+)pos(30+)pos(29+)pos(29+)a型血贫血(2例)pos(2+)pos(2+)pos(2+)pos(2+)
a型血自体血凝(2例)pos(2+)pos(2+)pos(2+)pos(2+)a型血血凝抑制(1例)pos(1+)pos(1+)pos(1+)pos(1+)b型血(15例)pos(15+)pos(14+)pos(15+)pos(14+)b型血血凝抑制(1例)pos(1+)pos(1+)pos(1+)pos(1+)ab型血(5例)pos(5+)pos(6+)pos(6+)pos(7+)“+”注：代表对应样本数量均为阳性。
41.对比例1与实施例1的对比结果表明，反应垫上的小麦凝集素浓度提高至0.3mg/ml时，原本只结合b型血的反应垫，可同时与猫的a型和b型血的红细胞结合，显示出ab型血的错误结果。降低小麦凝集素浓度至0.2mg/ml以下时，显色正确，因此装置中b型血反应垫上的小麦凝集素浓度不可过高。对比例2中反应垫改为37℃烘干后，原本只结合a型血的反应垫，可同时与猫的a型和b型血的红细胞结合，显示出ab型血的错误结果。因此，反应垫的干燥方式应选用冷冻干燥。而对比例3的检测结果表明，在提高检测时使用的缓冲液的离子浓度和ph值后，原本只结合a型血和b型血的反应垫，可同时与猫的a型和b型血的红细胞结合，显示出ab型血的错误结果。