致幻剂认知功能增强作用的检测方法

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种致幻剂认知功能增强作用的检测方法。


背景技术：

2.致幻剂是人类已知的最古老的一类精神活性物质，经典致幻剂特指5-羟色胺2a受体(5-ht2a受体)激动剂或部分激动剂，主要通过结合5-ht2a受体从而激活与其偶联的多个细胞内信号通路，导致机体的听觉，视觉，情绪以及对环境、时间的感知的变化，从而对心理精神疾病，疼痛以及认知产生影响。其中认知功能是致幻剂现阶段研究的热点之一，认知包括学习、记忆、识别、感知、信息处理等功能，常以此作为衡量认知的指标。目前现有的研究表明5-ht2a受体与认知功能密切相关，因此研究者们认为致幻剂对于认知功能有影响，但致幻剂对认知功能的研究和报道稀少，不同的范式得到的结果并不统一，使得对致幻剂认知功能的评价并不统一。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于一种致幻剂认知功能增强作用的检测方法，具有方便、快捷、简便的特点。
4.秀丽隐杆线虫是一种在世界各地都可以自由生存的一种微小的线虫，刚孵化的幼虫长0.25mm，成虫长1mm，因此需要在解剖显微镜或复合显微镜观察。秀丽隐杆线虫具有较短的生命周期，20℃从胚胎发育至成虫仅需要3天。此外，秀丽隐杆线虫野生型拥有不变的细胞谱系，已成为第一个具有完整的基因组序列的多细胞动物，且60％～80％的人类基因都可以在秀丽隐杆线虫基因组中找到直系同源。成年的雌雄同体秀丽隐杆线虫有302个神经元，构成了完整的神经系统，具有多种形式的学习和记忆行为，是研究神经系统功能的模式动物。
5.本发明以秀丽隐杆线虫作为检测致幻剂认知功能增强作用的模型动物，考察致幻剂对秀丽隐杆线虫识别熟悉细菌行为的影响，从而评价致幻剂认知增强作用。
6.本发明提供了一种致幻剂认知功能增强作用的检测方法，包括以下步骤：
7.a)将秀丽隐杆线虫分别在对照培养基和实验培养基中进行培养，分别获得对照组秀丽隐杆线虫和实验组秀丽隐杆线虫；所述对照培养基包括基础培养基和秀丽隐杆线虫食用的第一细菌；所述实验培养基包括基础培养基、秀丽隐杆线虫食用的第一细菌和致幻剂；
8.b)分别测试步骤a)获得的对照组秀丽隐杆线虫和实验组秀丽隐杆线虫对第一细菌和第二细菌的选择指数，获得致幻剂认知功能增强作用的检测结果，其中，第二细菌是秀丽隐杆线虫不熟悉的细菌。
9.本发明以秀丽隐杆线虫为模型动物，分别将其在对照培养基和实验培养基中进行培养，获得对照组秀丽隐杆线虫和实验组秀丽隐杆线虫；其中，所述对照培养基包括基础培养基和秀丽隐杆线虫食用的第一细菌；所述实验培养基包括基础培养基、秀丽隐杆线虫食用的第一细菌和致幻剂。
10.具体而言，本发明首先将秀丽隐杆线虫同期化培养至l2时期，然后将其转移至对照培养基和实验培养基进行后续实验。在同期化培养过程中，采用的培养基为基础培养基，所述基础培养基可以为ngm培养基，其配方组成为：2.4g nacl，2g蛋白胨，16g琼脂，kpi溶液(ph＝6)13ml，1m的mgso4800μl，1m的cacl
2 800μl，去离子水定容至800ml，高压灭菌后加入800μl 5mg/ml的胆固醇无水乙醇溶液。在同期化培养过程中，秀丽隐杆线虫以第一细菌为食物，具体而言，可以在培养基中涂满第一细菌。
11.在一些可能的实现方式中，所述对照培养基包括基础培养基和秀丽隐杆线虫食用的第一细菌，所述实验培养基包括基础培养基、秀丽隐杆线虫食用的第一细菌和致幻剂。实验培养基与对照培养基的区别在于，实验培养基中加入致幻剂，而对照培养基中无需加入致幻剂。在一些典型的实施例中，所述基础培养基可以为ngm培养基，其配方组成为：2.4g nacl，2g蛋白胨，16g琼脂，kpi溶液(ph＝6)13ml，1m的mgso
4 800μl，1m的cacl
2 800μl，去离子水定容至800ml，高压灭菌后加入800μl 5mg/ml的胆固醇无水乙醇溶液。在一些可能的实现方式中，实验培养基中含有1:1000的致幻剂溶液，对照培养基中含有1:1000的溶解致幻剂所用的溶剂。在一些可能的实现方式中，实验培养基中含有1:1000的致幻剂的二甲基亚砜(dmso)溶液，对照培养基中含有1∶1000的dmso。在一些可能的实现方案中，所述致幻剂为麦角酸二乙基酰胺或赛洛新。在一些可能的实现方案中，所述致幻剂的浓度为0.1～100μm。
12.具体而言，实验培养基或对照培养基可以按照以下方法制备：将ngm培养基高压灭菌后，冷却至60～70℃，按照1∶1000的比例加入致幻剂溶液，对照培养基则加入1∶1000的dmso。
13.在一些可能的实现方式中，在实验培养基或对照培养基中进行培养时，保证秀丽隐杆线虫食用的第一细菌是充足的，例如将第一细菌涂满基础培养基。培养70～80h，特别是72h后即可对秀丽隐杆线虫进行测试。在一些可能的实现方案中，所述第一细菌为e.coil op50。
14.本发明采用秀丽隐杆线虫熟悉的第一细菌和不熟悉的第二细菌测试秀丽隐杆线虫的认知功能，从而获得致幻剂认知功能增强作用的检测结果，具体可以包括以下步骤：
15.步骤b1)将第一细菌和第二细菌以同等距离置于步骤a)获得的秀丽隐杆线虫的两侧，静置后，分别统计第一细菌区域秀丽隐杆线虫的数量和第二细菌区域秀丽隐杆线虫的数量；
16.步骤b2)按照以下公式计算秀丽隐杆线虫的相对选择指数：
[0017][0018]
δchoice index＝choice index(0)-choice index(drug)
[0019]
其中，choice index代表选择指数，#animals in unfamiliar bacteria代表在第二细菌区域秀丽隐杆线虫的数量，#in op代表在第一细菌区域秀丽隐杆线虫的数量，δchoice index代表相对选择指数，choice index(0)代表对照组的相对选择指数，choice index(drug)代表实验组的相对选择指数。
[0020]
秀丽隐杆线虫可以识别到接触过的细菌信号，但新出现的细菌会干扰秀丽隐杆线虫对熟悉细菌的识别，而识别是认知的重要指标之一。本技术以秀丽隐杆线虫熟悉的第一
index(drug)代表实验组的相对选择指数。
[0033]
本发明以秀丽隐杆线虫作为模型动物，与大鼠、小鼠等常用哺乳动物模型相比，秀丽隐杆线虫繁殖能力强、生命周期短、培养成本低、体积小的特点使其易于培养和控制，保证其可在短时间内完成大批量筛查，并降低的哺乳动物模型的成本和复杂性。具体而言，本发明将秀丽隐杆线虫同期化至l2时期开始给药致幻剂，持续72h，全程提供e.coil op50为食物；在op50与另一未接触过的细菌同时存在时，测试秀丽隐杆线虫对于op50的选择指数，并与对照组相比，计算出相对选择指数以评价致幻剂认知增强作用，可在短时间内实现高通量测试，易操作，易控制。
附图说明
[0034]
图1是秀丽隐杆线虫细菌识别模型检测试验模式图；
[0035]
图2是秀丽隐杆线虫在不同浓度的lsd给药组对op50的选择指数；
[0036]
图3是秀丽隐杆线虫在不同浓度的赛洛新给药组对op50的选择指数；
[0037]
图4是秀丽隐杆线虫对致幻剂偏好测试模式图；
[0038]
图5是10μm lsd培养的秀丽隐杆线虫对lsd的偏好指数；
[0039]
图6是10μm赛洛新培养的秀丽隐杆线虫对lsd的偏好指数。
具体实施方式
[0040]
本发明提供了一种致幻剂认知功能增强作用的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0041]
以下实施例中所用到的秀丽隐杆线虫生长培养基均为ngm培养基，其配方组成为：2.4g nacl，2g蛋白胨，16g琼脂，kpi溶液(ph＝6)13ml，1m的mgso
4 800μl，1m的cacl
2 800μl，去离子水定容至800ml，高压灭菌后加入800μl 5mg/ml的胆固醇无水乙醇溶液。
[0042]
加药培养基以及对照培养基的配置：致幻剂用dmso溶解配置成所需浓度1000倍的溶液，当ngm培养基高压灭菌后，冷却至60～70℃，根据1:1000的比例加入配置好的致幻剂溶液，对照组则加入1:1000的dmso。
[0043]
测试菌液的制备如下：
[0044]
(1)测试前10～12h开始制备测试所需菌液，在接种前将lb培养基置于超净台紫外灭菌30min，挑取测试需要的两种菌的单菌落分别接种至两份lb培养基中，接种全程在超净台中进行无菌操作，接种后用封口膜封好放入37℃恒温摇床震荡培养10～12h。
[0045]
(2)10～12h后将摇好的菌液取出，用紫外分光光度计测量其od值。测量前需提前30min打开仪器预热，先测量lb培养基的od值在调零进行背景扣除，再取摇好的菌液测量其od值，测量期间不断加入lb培养基稀释，直至od值为1，记录测量时的稀释比例，并根据用量及比例配置好测试菌液。
[0046]
认知测试的测试板的准备如下：
[0047]
(1)此测试所用到的测试板是未加药ngm培养基与9cm规格的培养皿。配置好后置
于20℃晾干，取晾干好的测试板在其底部用记号笔标注出圆心，以及在同一直径两端距边缘1cm的两个点，即测试菌的菌落圆心，并在这两点附近标注好测试菌名称。
[0048]
(2)在标注好的位置分别滴相应的测试菌液20μl，待菌液水分挥发后改好皿盖备用。
[0049]
认知测试的具体步骤为：
[0050]
(1)培养好的秀丽隐杆线虫用m9 buffer反复冲洗并吸取至4ml离心管，静置后吸去上清，继续加入m9 buffer清洗反复几次至菌液清洗干净。
[0051]
(2)最后一次吸去上清尽量将上清液去除至最少得到秀丽隐杆线虫沉淀。每个9cm测试板滴2μl沉淀(约80～200条秀丽隐杆线虫)在测试板的圆心处，待水分蒸发，秀丽隐杆线虫开始爬行时盖好培养皿。将秀丽隐杆线虫放置在安静避光处后约2h观察秀丽隐杆线虫的选择情况。
[0052]
认知测试的相对选择指数通过以下公式计算：
[0053][0054]
δchoice index＝choice index(0)-choice index(drug)
[0055]
其中，choice index代表选择指数，#animals in unfamiliar bacteria代表在不熟悉细菌区域秀丽隐杆线虫的数量，#in op代表在op区域秀丽隐杆线虫的数量，δchoice index代表相对选择指数，choice index(0)代表空白组的相对选择指数，choice index(drug)代表药物组的相对选择指数。
[0056]
参见图1，图1是秀丽隐杆线虫细菌识别模型检测试验模式图，首先将秀丽隐杆线虫以op50为食物进行培养，培养约12h至l2时期，然后将其分别置于含有致幻剂的实验组和不含致幻剂的对照组继续培养72h，然后在测试板上分别放置op50和其他不熟悉的菌种，观察秀丽隐杆线虫的选择情况。其检测原理为：秀丽隐杆线虫可以识别到接触过的细菌信号，但新出现的细菌会干扰秀丽隐杆线虫对熟悉细菌的识别，而识别是认知的重要指标之一，该模型基于秀丽隐杆线虫的非联想学习建立，通过检测秀丽隐杆线虫对熟悉细菌的选择指数，以检测致幻剂对秀丽隐杆线虫认知能力的增强作用。
[0057]
实施例1致幻剂lsd对秀丽隐杆线虫识别熟悉细菌的影响
[0058]
首先培养秀丽隐杆线虫，将同期化至l2时期的秀丽隐杆线虫分别转至麦角酸二乙基酰胺(lsd)浓度为0，0.1μm，1μm，10μm，100μm的涂满e.coil op50的培养基中，在20℃恒温培养箱中培养72h后收集；培养过程中如出现食物不够的情况，及时转到食物丰富的培养基中。其次准备9cm测试板和测试菌液(1)op50+铜绿假单胞菌pa14；(2)op50+大肠杆菌ht115。最后进行认知测试，拍摄每个测试板秀丽隐杆线虫的分布情况，并根据公式计算出相对选择指数δchoice index，用graphpad prism分析数据和绘制图表，结果如图2所示，图2是秀丽隐杆线虫在不同浓度的lsd给药组对op50的选择指数，a是秀丽隐杆线虫对于pa14与op50的选择结果，b是秀丽隐杆线虫对于ht115与op50的选择结果。由图2可知，在1～10μm浓度下，lsd可以增强秀丽隐杆线虫对于op50的识别，与空白组具有极显著差异。
[0059]
实施例2致幻剂赛洛新(psilocin)对秀丽隐杆线虫识别熟悉细菌的影响
[0060]
将同期化至l2时期的秀丽隐杆线虫分别转至赛洛新浓度为0，10μm，100μm，500μm
的涂满op50的培养基中，在20℃恒温培养箱中培养72h后收集；培养过程中如出现食物不够的情况，及时转到食物丰富的培养基中。其次准备9cm测试板和测试菌液(1)op50+pa14；(2)op50+ht115。最后进行认知测试，拍摄每个测试板秀丽隐杆线虫的分布情况，并根据公式计算出相对选择指数δchoice index，用graphpad prism分析数据和绘制图表，结果如图3所示，图3是秀丽隐杆线虫在不同浓度的赛洛新给药组对op50的选择指数，a是秀丽隐杆线虫对于pa14与op50的选择，b是秀丽隐杆线虫对于ht115与op50的选择。由图3可知，在10～10μm浓度下，赛洛新可以增强秀丽隐杆线虫对于op50的识别，与空白组具有极显著差异。
[0061]
实施例3致幻剂(lsd和赛洛新)的偏好测试
[0062]
步骤一：秀丽隐杆线虫的培养
[0063]
将同期化至l2时期的秀丽隐杆线虫分别转至致幻剂浓度为0和10μm且铺满op50的ngm培养基，在20℃恒温培养箱中培养72h；培养过程中如出现食物不够的情况，及时转到食物丰富的培养基中。
[0064]
步骤二：偏好测试板的准备
[0065]
(1)偏好测试所用到的测试板是未加药ngm培养基与6cm规格的培养皿。配置好后置于20℃晾干，取晾干好的测试板在其底部用记号笔画出四象限标注好，如图4，图4是秀丽隐杆线虫对致幻剂偏好测试模式图，其中a、c象限为致幻剂测试区域，b、d象限为无致幻剂区域。
[0066]
(2)分别配制致幻剂浓度为0，1m，100mm，10mm的dmso溶液，用去离子水将这些溶液以1:1000的比例稀释至致幻剂的浓度为0，1mm，100μm，10μm。
[0067]
(3)将6cm四象限测试板分为三组，在a、c区域分别滴加10μl已稀释好的致幻剂溶液：
①
10μm；
②
100μm；
③
1mm；b、d区域均滴加10μl致幻剂浓度为0的对照溶液。
[0068]
步骤三：偏好测试
[0069]
(1)收集步骤一培养好的秀丽隐杆线虫，m9 buffer反复冲洗下吸取至4ml离心管，静置后吸去上清，继续加入m9 buffer清洗反复几次至菌液清洗干净。
[0070]
(2)最后一次吸去上清尽量将上清液去除至最少得到秀丽隐杆线虫沉淀。每个6cm偏好测试板滴2μl沉淀(约80～200条线虫)在测试板的圆心处，待水分蒸发，秀丽隐杆线虫开始爬行时盖好培养皿。将秀丽隐杆线虫放置在安静避光处后约0.5h后拍摄每个测试板秀丽隐杆线虫的分布情况，并根据公式计算出偏好指数，本实施例中偏好指数通过以下公式计算：
[0071][0072]
其中，preference index(pi)是偏好指数，a、b、c、d分别代表a、b、c、d象限的秀丽隐杆线虫数量，total代表a、b、c、d象限的秀丽隐杆线虫总数量。
[0073]
(3)用graphpad prism分析数据和绘制图表，lsd偏好测试结果如图5所示，图5是10μm lsd培养的秀丽隐杆线虫对lsd的偏好指数其中a是秀丽隐杆线虫在浓度为0和10μm致幻剂之间的偏好结果，b是秀丽隐杆线虫在浓度为0和100μm致幻剂之间的偏好结果，c是秀丽隐杆线虫在浓度为0和1mm致幻剂之间的偏好结果；赛洛新偏好测试结果如图6所示，图6是10μm赛洛新培养的秀丽隐杆线虫对lsd的偏好指数，a是秀丽隐杆线虫在浓度为0和10μm
赛洛新之间的偏好结果，b是秀丽隐杆线虫在浓度为0和100μm赛洛新之间的偏好结果，c是秀丽隐杆线虫在浓度为0和1mm赛洛新之间的偏好结果。
[0074]
以上结果表明，在一定浓度下，lsd和赛洛新可以增强秀丽隐杆线虫对于op50的识别，且这种增强不是因为秀丽隐杆线虫对lsd产生偏好导致。
[0075]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。