测定食品中挥发性N-亚硝胺的新方法与流程

测定食品中挥发性n-亚硝胺的新方法
技术领域
1.本发明属于化学检分析技术领域；更具体地，本发明涉及一种测定食品中挥发性n-亚硝胺的新方法，所述方法基于quechers净化技术。


背景技术：

2.亚硝胺作为强致癌物，是最重要的化学致癌物之一，不但长期小剂量可以使动物或人致癌，而且只要一次较高剂量的“冲击”就可引起癌症发生。因此n-亚硝胺引起了广泛关注，尤其对其如何防控更是值得关注的课题。
3.2017年世界卫生组织发布的致癌物清单中，多种n-亚硝胺类化合物位列一类、二类致癌物，亚硝胺类化合物是n-亚硝基化合物中最重要的一类，共有200多种，是本领域公认的最重要的化学致癌物之一。1987年，国际癌症研究机构(iarc)将亚硝胺归类为具有强致癌性的物质。其中，n-亚硝基二甲胺(ndma)和n-亚硝基二乙胺(ndea)被列为2a类致癌物(有充分的动物试验证据证明其具有潜在致癌性)。其中n-二甲基亚硝胺对眼睛、皮肤具有刺激作用，即使较小剂量，只要长期接触也能增加人体患癌风险。
4.鉴于亚硝胺的毒性和分布情况，世界上不同国家和地区已经在推动建立食品中亚硝胺的标准和指导值。国标gb2762-2017中对n-二甲基亚硝胺的限量控制为肉制品(肉类罐头除外)、熟肉干制品为3.0μg/kg，水产制品(水产品罐头除外)、干制水产品为4.0μg/kg。n-二甲基亚硝胺在cac、欧盟、澳新等国家未见限量控制要求。由于n-亚硝胺类化合物的结构与性质具有较大的差异，且其在不同食品中具有不同的含量分布，需要针对不同的食品体系中不同含量的n-亚硝胺类化合物开发有效的分析方法。
5.现行gb 5009.26-2016标准中检测食品中n-亚硝胺类化合物的第二法气相色谱-热能分析仪法，由于热能分析仪的价格昂贵，应用范围窄，适应性不强，仅局限于n-亚硝胺类化合物的分析，一般实验室都没有该配备，而且检测器的日常维护较麻烦，这也限制了它的广泛应用。gb 5009.26-2016的第一法采用水蒸气蒸馏-气相色谱-质谱/质谱法，前处理采用水蒸馏装置蒸馏提取，二氯甲烷多次萃取，蒸发浓缩的方式进行净化富集n-亚硝胺。但蒸馏条件不易控制，二氯甲烷在萃取过程中也会提取部分杂质，干扰测定，同时该方法操作过步骤较多，导致回收率不高，仅为40-70％，且费时费试剂费人工，不利于批量化检测，并且检测目标物单一等问题(国标方法仅检测n-二甲基亚硝胺)，不能持续满足人们对亚硝胺检测的技术要求。
6.在一些专利申请中(cn112730663a、cn110389188a、cn210626153u、cn110208444b)提及可以有效检测食品中挥发性n-亚硝胺的方法及装置。但是，这些方法存在回收率低、净化效果差、装置复杂、操作繁琐以及适用范围有限等问题。
7.因此，需要找到一种可以在保证高回收率的情况下既能有效除杂，又能优化前处理工艺，减少试剂损耗，缩短处理时间，并且可以同时应用于处理检测多种n-亚硝胺化合物和配套的实验方法。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种测定食品中挥发性n-亚硝胺的新方法，所述方法基于quechers净化技术。
9.在本发明的第一方面，提供一种同时检测食品中多种(两种或两种以上)n-亚硝胺含量的方法，所述方法包括：(1)从食品中提取含有(或潜在含有)n-亚硝胺的提取物；(2)利用quechers净化方法对(1)的提取物进行净化，获得经净化的提取物；所用净化管存在以下的填料的组合：c18填料或c8填料、psa填料及si(silica)填料，可选地还存在gcb填料；(3)利用气相色谱-质谱分析法检测前述经净化的提取物，测定n-亚硝胺含量。
10.在一或多种实施方案中，所述n-亚硝胺为挥发性n-亚硝胺；较佳地，所述多种n-亚硝胺选自：n-二甲基亚硝胺(ndma)、n-甲基乙基亚硝胺、n-二乙基亚硝胺、n-二丙基亚硝胺、n-二丁基亚硝胺、n-亚硝基哌啶、n-亚硝基吡咯烷、n-亚硝基吗啉(nmorph)、n-二苯基亚硝胺(ndpha)。
11.在一或多种实施方案中，步骤(2)中，按照重量比：c18填料、psa填料及si填料的比例为(2-10):(1-5):(1-5)。
12.在一或多种实施方案中，按照重量比：c18填料、psa填料及si填料的比例为(4-8):(2-4):(2-4)；更佳地2:1:1。
13.在一或多种实施方案中，步骤(2)中，按照重量比：c8填料、psa填料及si填料的比例为(6-30):(4-20):(1-5)。
14.在一或多种实施方案中，c8填料、psa填料及si填料的比例为(12-24):(8-16):(2-4)；更佳地为6:4:1。
15.在一或多种实施方案中，步骤(2)中，按照重量比：c18填料、psa填料、si填料及gcb填料的比例为(6-30):(6-30):(1-5):(0.2-1)。
16.在一或多种实施方案中，c18填料、psa填料、si填料及gcb填料的比例为(12-24):(12-24):(2-4):(0.4-0.8)；更佳地为30:30:5:1。
17.在一或多种实施方案中，步骤(1)中包括：利用有机溶剂对食品进行提取，获得含有n-亚硝胺的提取物，将该提取物作为待测样品；较佳地，所述有机溶剂为乙腈；更佳地，所述乙腈为5ml～50ml/样品。
18.在一或多种实施方案中，加入有机溶剂的同时，还包括加入无水硫酸镁和氯化钠。
19.在一或多种实施方案中，所述无水硫酸镁为50mg～2g/样品；
20.在一或多种实施方案中，所述氯化钠为50mg～2g/样品。
21.在一或多种实施方案中，步骤(1)中：在提取之前，还包括粉碎食品的步骤。
22.在一或多种实施方案中，步骤(1)中：在提取之后，还包括离心获取上清的步骤。
23.在一或多种实施方案中，步骤(3)气相色谱-质谱分析法检测时：采用气相色谱-质谱联用仪；较佳地，色谱柱为cd-basewax。
24.在一或多种实施方案中，步骤(3)气相色谱-质谱分析法检测时，气相条件：色谱柱：cd-basewax，长度：30m，内径：0.25mm膜厚：0.25μm色谱柱最高温度：240℃升温程序：40℃保持0.5min，以15℃/min的速率升至190℃，再以40℃/min的速率升至230℃，保持10min进样口衬管：不分流，进样口温度：220℃，载气：氦气、恒流模式(1ml/min)。
25.在一或多种实施方案中，步骤(3)气相色谱-质谱分析法检测时，质谱条件：溶剂延
二丁基亚硝胺、n-亚硝基哌啶、n-亚硝基吡咯烷、n-亚硝基吗啉(nmorph)、n-二苯基亚硝胺(ndpha)。
39.如本发明所用，“基质”指的是待测样品(包括目标分析物以及其它物质、杂质)，由于目标分析物以外的物质常常对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性，这些影响和干扰被称为基质效应(matrix effect)。
40.如本发明所用，“目标分析物”也称为“目标物”、“目标检测物”或“检测物”；除非另外说明，所述“目标分析物”指“n-亚硝胺”。
41.如本发明所用，所述的“食品(样品)”包括天然食品样品、人工加工后的食品样品、或食品废弃物等。
42.如本发明所用，“/个样品”或“/样品”中，样品的量可以指重量约为5～10g的样品；可以根据实际样品的种类进行重量上的上下浮动，如
±
50％、
±
40％、
±
30％、
±
20％、
±
10％、
±
5％、
±
3％、
±
2％、
±
1％。
43.检测食品样品中n-亚硝胺
44.降低基质效应的关键之一为气相色谱-质谱分析法分析的前处理优化。样品前处理步骤主要包括提取和净化，常见的样品前处理方法包括：固相萃取法(spe)、磁性固相萃取法(mspe)、分散液-液微萃取法(dllme)、quechers(quick,easy,cheap,effective,rugged and safe)、免疫亲和柱(iac)浓缩、多功能净化柱(mfc)净化等。现有技术中针对食品中n-亚硝胺的检测，尽管已经有一些标准在运作，然而还面临较多的需要优化的方面。而本发明提供了优化的检测方法。
45.本发明的检测食品样品中n-亚硝胺的方法，包括：(1)从食品中提取含有(或潜在含有)n-亚硝胺的提取物；(2)利用quechers净化方法对(1)的提取物进行净化，获得经净化的提取物；以及，(3)利用气相色谱-质谱分析法检测前述经净化的提取物，测定n-亚硝胺含量。
46.预处理
47.本发明的方法包括预处理的步骤，包括从食品样品中提取尽可能含有接近全部量的n-亚硝胺，从而为后续的准确检测提供支持。
48.一些有机溶剂可被应用于本发明中，例如甲醇，乙醇，乙腈等。作为本发明的优选方式，利用乙腈对食品样品进行提取，获得含有n-亚硝胺的提取物。本发明人观测到，乙腈和乙醇提取液的基质效应较其它有机溶剂提取液弱。
49.预处理步骤的前期，还包括粉碎食品样品的步骤，可通过机械处理的方式来进行这一步骤，本发明对此没有特别的限制。
50.作为本发明的优选方式，利用乙腈对食品样品进行提取，获得提取液后，还包括进行离心，获取上清的步骤。
51.作为本发明的优选方式，利用乙腈对食品样品进行提取时，每个食品样品使用5ml～50ml乙腈。在具体实施例中，本发明人优化了提取剂与样品的用量，回收率是相对高的。
52.从预处理方案而言，本发明可以解决采用水蒸气蒸馏的预处理方法(gb5009.26-2016水蒸气蒸馏-气相色谱-质谱/质谱法)中存在的回收率较低，费时费试剂费人工的问题。本发明人发现，水蒸气蒸馏的前处理方法的回收率较低的原因主要是蒸馏条件不易控制，二氯甲烷在多次萃取过程中也会提取部分杂质，干扰测定，同时该方法操作过步骤较
多，最终导致回收率偏低；在这一发现基础上，本发明人产生了进行改进的动机，进而获得如本发明的技术方案。
53.利用有机溶剂对食品进行提取，获得含有n-亚硝胺的提取物，将该提取物作为待测样品；较佳地，所述有机溶剂为乙腈；更佳地，所述乙腈为5ml～50ml/个样品。
54.作为本发明的优选方式，加入有机溶剂的同时，还包括加入无水硫酸镁和氯化钠；较佳地，所述无水硫酸镁为50mg～2g/个样品；较佳地，所述氯化钠为50mg～2g/个样品。
55.无水硫酸镁和氯化钠的添加是适用而恰当的。无水硫酸镁可以发挥除水的作用；与之相协同地，氯化钠可以发挥降低目标物在水中的溶解性的作用，增加有机溶剂的提取效率。除此以外，其它的局具有除水作用的试剂例如无水硫酸钠，其有遇水易结块的问题，本发明人发现其会造成基质无法在溶液中充分分散的问题。而且，其他除水剂或降低水中溶解性的试剂成本较高、效果不如本发明所选择的无水硫酸镁和氯化钠。
56.quechers净化
57.在经过预处理步骤，获得含有n-亚硝胺的提取物后，利用quechers净化方法对所述提取物进行净化，以获得经净化的、有利于后续的高效、准确检测的提取物。
58.为了获得良好的净化效果，本发明人优化了用于quechers净化的净化管中的填料种类，包括使用填料c18或c8、psa、si及可选地gcb作为主要的填料。进一步地，本发明人也优化了所述填料的用量配比，按照重量比，填料中c18填料、psa填料及si填料的比例为(2-10):(1-5):(1-5)；或，c8填料、psa填料及si填料的比例为(6-30):(4-20):(1-5)；或，c18填料、psa填料、si填料及gcb填料的比例为(6-30):(6-30):(1-5):(0.2-1)。
59.应用本发明的混合填料，最终获得的净化回收率显著高于商品化净化柱、高于现有国标，效果优异。
60.利用气相色谱-质谱分析法检测
61.经过净化步骤获得的经净化的提取物，可以利用气相色谱-质谱分析法定性和/或定量检测目标物。
62.在确定了测定条件后，可以运用公知的定性/定量的计算方法来进行目标物的定性/定量。作为本发明的优选方式，利用标准曲线法来进行定性和/或定量分析。较佳地，可通过测定不同浓度的基质加标样品溶液，得到基质加标曲线，利用基质外标法同时实现定性定量分析。
63.作为本发明的优选方式，利用标准曲线法来进行定性和/或定量分析；较佳地，可通过配制基质加标溶液：取不含n-亚硝胺的空白待测样品溶液，然后加入n-亚硝胺标准溶液，配制成不同浓度的基质加标样品(标准品)溶液；较佳地，利用所述气相色谱-质谱分析法检测的检测条件测定所述不同浓度的基质加标样品溶液，得到基质加标曲线，利用基质外标法实现定性和/或定量分析。
64.本发明可解决采用气相色谱-热能分析仪法(gb 5009.26-2016气相色谱-热能分析仪法)及一些专利(cn112730663a、cn110389188a、cn210626153u、cn110208444b)中所涉及的方法前处理装置复杂、实验成本高的问题。通过采取简单易行的实验方法，结合n-亚硝胺专用quechers方法包中合适的填料，采用低成本的通用耗材，可以有效地去除不同基质中的杂质，实现对9种亚硝胺类化合物的检测。
65.本发明可解决cn106053634b、cn111707769a等专利中的适用性问题，本方法的适
用性广，不仅可以应用于传统的水产品基质、调味料基质，含油脂和添加剂较多的复杂基质，如：香辣小鱼仔等也同样能够适用，可应用于需要进行亚硝胺类物质检测的食品类基质，不同基质，采用的实验方案统一，大幅度地节约时间和人工成本，减低人员操作难度。
66.本发明的方法，相比于于该国标方法，使用的基质量大大减少，国标中需200g，本专利中为5g～10g。
67.应用及试剂盒
68.本发明的技术方案中，结合本发明优化的quechers预处理技术，建立了一种简单高效的测定食品中n-亚硝胺测定方法。可被应用于各种食品/食品制品/加工品的测定。
69.本发明建立的基于新的quechers净化技术结合气相色谱-质谱分析法检测食品基质中n-亚硝胺的方法，提取溶液经优化的净化管净化，使得预处理工作简单快速，获得理想的待测提取物。优选地食品样品用乙腈震荡提取，优选地色谱检测时使用cd-basewax色谱柱分离。本发明的方法对食品基质的净化效果好、分析速度快、灵敏度高、重现性好，为评价食品中n-亚硝胺含量提供了新的检测方法。本发明的方法具有快速、简单、廉价、有效、稳定和安全等特点。
70.基于本发明人的新发现，本发明还提供了一种用于检测食品样品中n-亚硝胺的试剂盒，包括：用于从食品样品中提取含有(或潜在含有)n-亚硝胺的提取物的有机试剂；以及适用于quechers净化方法的净化管，所述净化管中包括以下的填料：c18或c8、psa、si、gcb。
71.作为本发明的优选方式，所述试剂盒中还包括：n-亚硝胺的标准品；对照品；洗脱试剂；和/或说明检测食品样品中n-亚硝胺的方法的使用说明书。
72.本发明的有益效果主要在于：
73.(1)本发明中的检测方法及配套使用的n-亚硝胺专用quechers方法包能够大幅提高n-亚硝胺的回收率，采用本发明实验方法，配合n-亚硝胺专用quechers方法包，可将复杂基质中n-亚硝胺的回收率提高至85％以上，实验方法准确、高效，专用方法包性能优异。
74.(2)本发明与国标(gb 5009.26-2016)相比，操作过程简单，全程无需氮吹，可以节省时间(一批样品处理周期约40min-60min)，节约购置氮吹仪、氮气等仪器的成本，并排除对氮吹的程度不好把控时会出现平行性较差进而影响测试结果的情况。本发明方法可避免氮吹造成的一系列影响，方法简单，可操作性强。此外，将标准中所用的超过500ml二氯甲烷缩小至50ml乙腈，大幅度减少试剂用量，属于环境友好的产品和方法。
75.(3)本发明中的实验方法以及配套使用的n-亚硝胺专用quechers方法包的适用范围广，可应用于多种基质，包括鲜鱼肉、烤鱼片、香辣小鱼仔等较为复杂的基质，实验方法统一，不必根据不同的基质选择不同的填料和方法，大大方便了实验人员，节约了时间和人工成本。
76.(4)测定的目标化合物比较单一)相比，本方法前处理简单、快速；可以检测的化合物种类多，方法涵盖了ndma，nmea，ndea，npyr，nmorph，ndpa，npip，ndba，ndpha等9种挥发性n-亚硝胺，可满足目前大部分化合物快速、安全筛查的需要。
77.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的具体实施例对本发明的技术方案进行清楚的描述。显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
78.n-亚硝胺类目标物及内标的保留时间和mrm离子对信息如表1；表中，n-二甲基亚硝胺-d6为内标。
79.表1
[0080][0081][0082]
实施例1、以鲜鱼肉为基质的检测
[0083]
本实施例中，以鲜鱼肉为基质，以quechers净化技术测定食品中多种挥发性n-亚硝胺。
[0084]
1、检测过程
[0085]
具体操作步骤如下：
[0086]
(1)样品提取
[0087]
称取5g均质后的鲜鱼肉于离心管中，对应5g试样，加入15ml乙腈；加入2g无水硫酸镁、2g氯化钠。混匀超声后离心，取上清液，待净化。
[0088]
(2)样品净化
[0089]
将部分上清液转移至装有固相萃取填料的净化管中，固相萃取填料如表2。
[0090]
表2
[0091][0092]
混匀后离心，取上清液，过滤膜，上机测定。
[0093]
(3)气相色谱-质谱联用仪检测
[0094]
利用气相色谱-质谱联用仪进行检测，检测条件如下：
[0095]
气相条件：色谱柱：cd-basewax，长度：30m，内径：0.25mm膜厚：0.25μm色谱柱最高温度：240℃升温程序：40℃保持0.5min，以15℃/min的速率升至190℃，再以40℃/min的速率升至230℃，保持10min进样口衬管：不分流，进样口温度：220℃，载气：氦气、恒流模式(1ml/min)。
[0096]
质谱条件：溶剂延迟：5.5min离子化方式：ei离子源温度：230℃接口温度：220℃检测模式：mrm增益因子：60；定量方法：内标法。
[0097]
n-亚硝胺类目标物及内标的保留时间和mrm离子对信息如表1。
[0098]
2、检测结果
[0099]
以鲜鱼肉为基质，检测获得各种n-亚硝胺化合物的回收率数据如表3。
[0100]
表3
[0101][0102]
根据表3所示，在鲜鱼肉基质中，9种n-亚硝胺的回收率均可达到90％以上，回收率极高；且大多数数值趋于靠近100％，平行性好。
[0103]
这一结果说明，n-亚硝胺专用quechers方法性能优异，且该实验方法能够有效地收集目标物9种n-亚硝胺类目标物，兼容性佳。
[0104]
分析对比显示，表2的填料及其配比非常使用、优于它的填料选择，提供了良好的净化产物。
[0105]
从处理时间上进行统计，这一方法前处理部分所用时间仅约为30分钟。
[0106]
实施例2、以烤鱼片为基质的检测
[0107]
本实施例中，以烤鱼片(超市里购买的散装产品)为基质，以quechers净化技术测定食品中多种挥发性n-亚硝胺。
[0108]
1、检测过程
[0109]
具体操作步骤如下：
[0110]
(1)样品提取
[0111]
称取5g均质后的烤鱼片于离心管中，对应5g试样，加入5ml水和15ml乙腈；加入2g无水硫酸镁、2g氯化钠。混匀超声后离心，取上清液，待净化。
[0112]
(2)样品净化
[0113]
将部分上清液转移至装有固相萃取填料的净化管中，固相萃取填料如表4。
[0114]
表4
[0115][0116]
混匀后离心，取上清液，过滤膜，上机测定。
[0117]
(3)气相色谱-质谱联用仪检测条件。
[0118]
利用气相色谱-质谱联用仪进行检测，检测条件同实施例1中。
[0119]
2、检测结果
[0120]
以烤鱼片为基质，检测获得各种n-亚硝胺化合物的回收率数据如表5。
[0121]
表5
[0122][0123]
本实施例的烤鱼片作为基质与实施例1鲜鱼肉相比，由于经过了加工过程，含有添加剂、调味料等，成分相对复杂。在烤鱼片基质中，9种n-亚硝胺的回收率可达到85％以上，回收率较高；且大多数数值趋于靠近100％，平行性较好。
[0124]
这一结果说明，n-亚硝胺专用quechers方法性能优异，且该实验方法能够有效地收集目标物9种n-亚硝胺类目标物，兼容性佳。
[0125]
分析对比显示，表4的填料及其配比非常使用、优于它的填料选择，提供了良好的净化产物。
[0126]
从处理时间上进行统计，这一前处理部分所用时间仅约为30分钟。
[0127]
实施例3、以麻辣小鱼仔为基质的检测
[0128]
本实施例中，以麻辣小鱼仔(超市里购买的产品)为基质，以quechers净化技术测定食品中多种挥发性n-亚硝胺。
[0129]
1、检测过程
[0130]
具体操作步骤如下：
[0131]
(1)样品提取
[0132]
称取5g均质后的小鱼仔于离心管中，对应5g试样，加入5ml水和15ml乙腈，加入2g无水硫酸镁、2g氯化钠。混匀超声后离心，取上清液，待净化。
[0133]
(2)样品净化
[0134]
将部分上清液转移至装有固相萃取填料的净化管中，固相萃取填料如表6。
[0135]
表6
[0136][0137]
混匀后离心，取上清液，过滤膜，上机测定。
[0138]
(3)气相色谱-质谱联用仪检测条件
[0139]
利用气相色谱-质谱联用仪进行检测，检测条件同实施例1中。
[0140]
2、检测结果
[0141]
以麻辣小鱼仔为基质，检测获得各种n-亚硝胺化合物的回收率数据如表7。
[0142]
表7
[0143][0144]
本实施例的麻辣小鱼仔作为基质与实施例1中鲜鱼肉相比，由于经过了加工过程，含有添加剂、调味料等，成分更为复杂；与实施例2的烤鱼片相比，其添加剂、调味料的品类更多、更为复杂。在麻辣小鱼仔这种复杂的基质中，9种n-亚硝胺的回收率可达到90％以上，回收率很高；且大多数数值趋于靠近100％，平行性较好。
[0145]
这一结果说明，n-亚硝胺专用quechers方法性能优异，且该实验方法能够有效地收集目标物9种n-亚硝胺类目标物，兼容性佳。
[0146]
分析对比显示，表6的填料及其配比非常使用、优于它的填料选择，提供了良好的净化产物。
[0147]
从处理时间上进行统计，这一前处理部分所用时间仅约为30分钟。
[0148]
根据本发明的构思，本领域的技术人员还可以对此作出各种变化和修改，但这些变化和修改均属于本发明权利要求范围以内。