高效液相色谱法测定酒石酸伐尼克兰中酒石酸衍生物方法与流程

1.本发明涉及的是一种高效液相色谱法测定酒石酸伐尼克兰中酒石酸衍生物的方法，属于化学检测分析技术领域。


背景技术：

2.伐尼克兰是一种非尼古丁类药物，也是一种高选择性α4β2神经元烟碱样乙酰胆碱受体部分激动药。α4β2烟碱样乙酰胆碱受体是尼古丁在大脑结合的部位，当尼古丁与其结合后，就会刺激大脑伏隔核释放大量多巴胺，从而获得愉悦和尼古丁奖赏效应；当尼古丁浓度降低，这种愉悦感就会消失，吸烟者就会出现戒断症状。伐尼克兰用于戒烟的主要原理是部分激动α4β2烟碱样乙酰胆碱受体，释放少量多巴胺，可以缓解吸烟者对尼古丁的渴望，减轻戒断症状；同时通过拮抗尼古丁与α4β2烟碱样乙酰胆碱受体结合，阻断吸烟者吸烟时的欣快感，降低吸烟欲望，从而提高戒断率，降低复吸率。
3.2006年5月和8月，美国食品药品管理局（fda）和欧盟医药局（emea）先后批准了辉瑞公司研发的新型非尼古丁戒烟药酒石酸伐尼克兰上市。目前已在超过100个国家获得批准上市，被《美国烟草使用与依赖实践指南》最新版推荐作为戒烟治疗的一线药物。2008年12月，辉瑞公司宣布该药获得中国国家食品药品监督管理局（sfda）批准，正式在中国市场销售（商品名：畅沛），成为我国第一个戒烟处方药。
4.在酒石酸伐尼克兰的制备过程中，原料药中的杂质j（酒石酸单甲酯）和杂质k（酒石酸二甲酯）为合成过程中酒石酸不可避免地接触溶剂甲醇而产生的酒石酸衍生杂质，应按照ich原则进行控制。由于酒石酸和甲醇接触后的酯化反应，在成品中杂质j为主要工艺杂质，针对该杂质的含量测定和控制是酒石酸伐尼克兰的制备工艺要点之一，可以很大程度地决定终产品质量。然而目前并无针对杂质j和杂质k的精确定量检测方法，不利于酒石酸伐尼克兰的药品质量控制体系的完整建立。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于填补现有酒石酸伐尼克兰药品制备和质量检测过程中存在的技术空缺，提出一种高效液相色谱法测定酒石酸伐尼克兰中杂质j、杂质k的方法。
6.本发明的技术解决方案：一种高效液相色谱法测定酒石酸伐尼克兰中酒石酸衍生物的方法，采用离子交换色谱法，以弱酸性溶液作为流动相体系，选择以磺化交联的苯乙烯、二乙烯苯基共聚物为填充剂的色谱柱进行分离；流动相为弱酸性溶液，其中弱酸性溶液采用的酸性试剂包括甲酸、乙酸、三氟乙酸、磷酸、枸橼酸、盐酸中的一种或多种混合，质量浓度范围为0.05%～0.2%。
7.该方法具体包括如下步骤：1）取待测酒石酸伐尼克兰产品，精密称重，放置于量瓶中，加入流动相进行溶解并稀释成每1ml中含有1.5mg酒石酸伐尼克兰的溶液，作为供试品溶液；2）取杂质j、杂质k及酒石酸对照品适量，精密称重，放置于量瓶中，加入流动相进
行溶解并稀释成每1ml约含酒石酸0.6mg及杂质j 7.5μg、杂质k 1.5μg的溶液，作为系统适用性溶液；3）取酒石酸对照品适量，精密称重，放置于量瓶中，加入流动相进行溶解并稀释成每1ml约含酒石酸0.6mg的溶液，精密量取2ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为酒石酸对照溶液；4）高效液相色谱检测：以磺化交联的苯乙烯、二乙烯苯基共聚物为填充剂（如shodexrspak kc-811柱或等效柱），以弱酸性溶液作为流动相，检测波长为 220nm，柱温为40℃。
8.精密量取系统适用性溶液30μl注入液相色谱仪，记录系统适用性溶液的色谱图，保证酒石酸、杂质j、杂质k依次出峰；然后精密量取酒石酸对照溶液30μl注入液相色谱仪，记录酒石酸对照溶液的色谱图，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的10%～20%；最后精密量取流动相、供试品溶液和酒石酸对照溶液各30μl，分别注入液相色谱仪，记录供试品溶液的色谱图。扣除溶剂峰后，供试品溶液色谱图中如有杂质j、杂质k，杂质j的含量按照外标法计算不得大于0.50%；杂质k的含量按照加校正因子的外标法计算（乘以校正因子1.3）不得大于0.10%。
9.与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明可定量检测酒石酸伐尼克兰药品中的杂质j和杂质k，并通过大量实验严格进行方法验证，保证方法的科学严谨，从而有效控制上述杂质的含量，满足研发和生产的需求，对于酒石酸伐尼克兰的质量控制有着不可或缺的意义。从提高产品质量、提高临床用药安全性、优化工艺流程角度，本发明均有着较为突出的商业化价值，并能在企业标准中形成技术壁垒，提高企业产品的附加值。
附图说明
10.附图1是本发明实施例中杂质j、杂质k检测方法典型色谱图。
11.附图2是本发明实施例中杂质j、杂质k检测供试品典型色谱图。
12.附图3是本发明实施例中杂质j、杂质k检测空白溶剂典型色谱图。
具体实施方式
13.下面根据实施例进一步说明本发明的技术方案。在本说明书的描述中，各实施例的内容意指结合其描述的具体技术特征包含于本发明的至少一个实施方式中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施方式或示例。而且，描述的具体技术特征可以在任何的一个或多个实施方式或示例中以合适的方式结合。
14.针对酒石酸伐尼克兰的合成工艺、降解途径，总结出酒石酸伐尼克兰合成成盐工艺中酒石酸与甲醇之间酯化反应可能出现的杂质如下表1所示：
表1酒石酸伐尼克兰杂质相关参数由于其在常规反相色谱系统下无保留，难以实现分离。查询文献并结合实验经验，本发明创造性地摸索了流动相体系，采用离子交换色谱法对杂质j、杂质k进行控制，调整流动相比例及检测灵敏度，最终确立了本发明所述的高效液相色谱体系，并进行了方法学验证。
15.（1）波长确定采用二极管阵列检测器对各杂质进行了190nm-400nm的紫外吸收波长全扫描，检测各物质紫外吸收曲线。酒石酸、杂质j和杂质k均趋于末端吸收，而本品在趋近末端处也有较强吸收，暂拟220nm作为检测波长，酒石酸及各杂质在该波长下均有较强的吸收。
16.本方法拟采用离子交换色谱法，以弱酸性溶液作为流动相体系，选择以磺化交联的苯乙烯、二乙烯苯基共聚物为填充剂的色谱柱进行分离。
17.（2）检测浓度确定取酒石酸对照品、杂质j、杂质k适量，配制成相对于检测浓度为1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml的系统适用性溶液，含酒石酸、杂质j、杂质k分别约为60%、0.5%、0.1%，每个浓度的系统适用性溶液分别进样30μl、40μl、50μl，同步考察各组分的色谱行为，选择适宜的检测浓度及进样量。样品浓度及进样量选择如下表2所示：表2样品浓度及进样量选择由结果可知，当检测浓度为2mg/ml时，酒石酸峰较宽，基线波动较大；而较大的进样量后期试验中对于色谱柱的损失亦会增加。相较而言，供试品浓度1.5mg/ml、进样量30μl的条件下各峰峰型对称，基线平稳，分离效果良好；根据灵敏度试验可知结果也充分满足了杂质检测灵敏度的要求，适宜于对酒石酸伐尼克兰中杂质j、杂质k的精确测定。
18.（3）方法学验证根据中国药典2015年版的要求，对本发明提出的方法进行了方法学验证。有关物质的方法学验证结果具体如下：
①
专属性i、破坏试验
可接受标准：降解产物各组分分离度＞1.5，主成分峰纯度＞0.999。
19.验证结果：空白溶剂无干扰、强制降解试验说明主成分与各有关物质峰能完全分离，专属性良好；主成分峰与各已知杂质峰的峰纯度均符合要求，破坏前后物料基本守衡。结果符合规定。
20.ii、分离度试验可接受标准：降解产物各组分分离度＞1.5，主成分峰纯度＞0.999。
21.验证结果：空白溶剂无干扰、强制降解试验说明主成分与各有关物质峰能完全分离，专属性良好；主成分峰与各已知杂质峰的峰纯度均符合要求，破坏前后物料基本守衡。结果符合规定。
②
定量限可接受标准：信噪比s/n=10。
22.验证结果：按信噪比s/n=10计算：酒石酸：定量限0.31 μg/ml，浓度比例0.021%；杂质j：定量限0.41 μg/ml，浓度比例0.027%；杂质k：定量限0.20 μg/ml，浓度比例0.013%。
23.③
检测限可接受标准：信噪比s/n=3。
24.验证结果：按信噪比s/n=3计算：酒石酸：定量限0.10 μg/ml，浓度比例0.007%；杂质j：定量限0.10 μg/ml，浓度比例0.007%；杂质k：定量限0.08 μg/ml，浓度比例0.005%。
25.④
线性和范围可接受标准：线性相关系数r＞0.999。
26.验证结果：酒石酸在0.40μg/ml～9.57μg/ml范围内线性良好，r=0.9995；杂质j在0.41μg/ml～9.82μg/ml范围内线性良好，r=0.9998；杂质k在0.39μg/ml～9.46μg/ml范围内线性良好，r=0.9998。
27.⑤
校正因子验证结果：杂质j：1.0；杂质k：1.3。
28.⑥
进样精密度可接受标准：相对标准偏差rsd＜2%。
29.验证结果：外标法对照溶液连续进样6次，峰面积的rsd小于2%。
30.⑦
重复性可接受标准：相对标准偏差rsd＜2%。
31.验证结果：配制6份相同浓度的供试品溶液，测得6份有关物质数据的rsd小于2.0%。
32.⑧
准确度可接受标准：回收率限度90%~108%，相对标准偏差rsd＜3%。
33.验证结果：杂质j回收率：96.01%，rsd：1.0%；杂质k回收率：96.08%，rsd：6.1%。
34.⑨
耐用性可接受标准：测定条件小的变动应能满足系统适用性试验要求。
35.验证结果：考察了流速相对值变化
±
10％、柱温变化
±
5℃、流动相中酸溶液浓度的变化、检测波长变化
±
2nm的不同检测条件，主峰的拖尾因子均小于1.5，各组分之间均能良好分离，本法耐用性良好。
36.⑩
溶液稳定性验证结果：系统适用性样品和供试品溶液在冷藏（约5℃）条件下11天内稳定。
37.验证结果表明本方法的各项指标均符合中国药典2015年版的要求，适用于精准检测酒石酸伐尼克兰中的杂质j和杂质k。
38.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。
39.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。