快速检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的荧光免疫层析试纸条及其制备方法

本发明属于生物，具体涉及快速检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的荧光免疫层析试纸条及其制备方法。

背景技术：

1、猪急性腹泻综合征冠状病毒（swine acute diarrhea syndrome virus，sads-cov），是一种蝙蝠来源的新型猪冠状病毒。sads-cov与猪流行性腹泻病毒（porcineepidemic diarrhea virus，pedv）、猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissiblegastroenteritis virus, tgev）和猪δ冠状病（porcine delta coronavirus，pdcov）是目前为止发现的四种猪肠道冠状病毒，其临床症状均表现为急性腹泻、呕吐、新生仔猪由于严重脱水、体重下降而死亡。

2、目前为止，sads-cov还没有商品化的诊断试剂盒。sads-cov的检测主要停留在实验室的检测，主要采用的技术方法有：病毒分离、免疫组化、免疫荧光、酶联免疫吸附试验（elisa）或聚合酶链式反应（pcr）和实时定量pcr等方法。然而，这些方法比较耗时，需要专业的技术人员和特定的仪器才可以完成，很难满足临床样品的快速、廉价、高效监测的要求。

3、免疫层析技术是近些年新发展起来的基于抗原抗体特异性反应的新型诊断检测技术，标记物主要为胶体金、量子点及时间分辨荧光微球等。其中，时间分辨荧光免疫层析检测技术（time-resolved fluorescence immunochromatographic assay，trfia）是一种利用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效排除非特异性荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。trfia的灵敏度是胶体金的10～100倍。

技术实现思路

1、本发明基于trfia的特点，结合sads-cov n蛋白特异性抗体，研制出一种可以快速检测sads-cov的时间分辨荧光免疫层析试纸条，该试纸条操作简单，灵敏度强，费时短，可用于sads-cov临床样本的检测，为控制该病的传播和流行提供了一种便捷的检测方法。

2、本发明具体包括以下内容：

3、第一方面，本发明提供了一种用于快速检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的荧光免疫层析试纸条，包括pvc底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接在pvc底板上；所述的硝酸纤维素膜上设有检测线t和质控线c，所述的检测线t设置于靠近结合垫的一端，所述的质控线c设置于靠近吸水垫的一端；所述结合垫包被有荧光微球标记的抗sads-cov n蛋白的单克隆抗体和兔igg（购自abcam公司，货号：ab6702）；所述检测线t包被有抗sads-cov n蛋白的单克隆抗体；所述质控线c包被有羊抗兔igg。

4、其中，抗sads-cov n蛋白的单克隆抗体，命名为6e8；该抗体采用公开号为cn113956353a的专利制备得到，单克隆抗体6e8的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示、轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:2所示。

5、优选地，所述结合垫的制备方法为：

6、（1）将结合垫采用结合垫封闭液浸泡处理；

7、（2）将荧光微球用n-乙基-n′-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺（edc）和n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）活化后，离心，用硼酸缓冲液重悬，超声使荧光微球充分分散，随后分别加入抗sads-cov n蛋白的单克隆抗体6e8、羊抗兔igg，室温孵育，再加入荧光微球标记物封闭液，室温孵育，离心；用荧光微球标记物保护剂将沉淀重悬，即得抗sads-cov n蛋白的单克隆抗体6e8标记溶液和羊抗兔igg的荧光微球标记溶液；

8、（3）将制备的抗sads-covn蛋白的单克隆抗体6e8标记溶液和羊抗兔igg的荧光微球标记溶液按体积比1:1混合后喷洒在封闭好的结合垫上。所述sads-cov n蛋白单克隆抗体6e8荧光微球标记溶液组成为：每1ml荧光微球溶液含80µg sads-cov n蛋白单克隆抗体6e8。所述羊抗兔igg荧光微球标记溶液组成为：每1ml荧光微球溶液含100µg羊抗兔igg。

9、所述结合垫封闭液为含有5%m/v海藻糖、2%m/v bsa、0.5%v/v tween-20、0.5%m/vtritonx-100的硼酸溶液。

10、所述荧光微球标记物封闭液为含有10% m/v bsa的超纯水溶液；

11、所述荧光微球标记物保护剂为含有3% m/v蔗糖、1% m/v pvp-40、0.5% v/vtween-20的pbs溶液。

12、优选地，所述检测线t包被有1mg/ml的sads-cov n蛋白单克隆抗体6e8。

13、优选地，所述质控线c包被有0.5mg/ml的羊抗兔igg。

14、优选地，所述样品垫采用样品垫封闭液浸泡处理；所述样品垫封闭液为含有0.5%v/v tween-20、2%m/v peg20000、2% m/v bsa的硼酸溶液。

15、第二方面，本发明提供了一种上述快速检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的荧光免疫层析试纸条的制备方法，所述方法包括以下步骤：

16、（1）制备包被有荧光微球标记抗体的结合垫；

17、（2）将抗sads-cov n蛋白单克隆抗体6e8（1mg/ml）和羊抗兔igg抗体（0.5mg/ml）间隔5～8mm喷在硝酸纤维膜上，分别作为检测线t和质控线c；

18、（3）将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接在pvc底板上，得到检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的荧光免疫试纸条。其中，样品垫的一端搭在结合垫的一端上方，结合垫的另一端搭在硝酸纤维素膜的一端上方，硝酸纤维素膜的另一端上方搭接有吸水垫。

19、第三方面，本发明试纸条的检测方法，其步骤如下：

20、（1）待检样品的处理

21、（a）细胞样品：将sads-cov接种铺满单层的huh7细胞，接毒60h后，置-80℃冰箱反复冻融3次，12000rpm，4℃离心10min，去除细胞碎片，取上清作为被检抗原。取未接毒的huh7细胞，以同样方法处理作为阴性对照。

22、（b）肛拭子样品：收集肛试纸，加入1ml pbs（ph7.4），涡旋振荡，12000rpm，离心10min，收集上清。

23、（2）样品检测

24、取10μl上述（a）或（b）任一样品加入90μl pbs（ph7.4）进行稀释，然后滴入样品垫，12min后放入便携式荧光定量检测仪中观察结果。

25、（3）结果判定

26、反应结束后，将试纸条插入荧光定量检测仪中，通过读取荧光信号的大小进行定量检测。

27、本发明的有益效果为：

28、本发明提供的检测sads-cov的荧光定量试纸条可用于sads-cov病原的特异性检测，与荧光定量仪连用可以实现定量检测，检测结果的数字化避免了人主观性偏差。试纸条能够检出培养物中病毒的最低限位为102.69tcid50/0.1ml，且与临床症状相似的其他猪源肠道冠状病毒，如：tgev、pedv和pdcov不发生反应。所制备的试纸条具有较好的特异性、灵敏性、操作简单、时间短等优点，为猪急性腹泻综合征冠状病毒的现场或者实验室的检测提供了一种快速检测方法。