一种食用植物油中黄曲霉毒素的快速测定方法与流程

1.本发明涉及食品检验技术领域，尤其涉及一种食用植物油中黄曲霉毒素的快速测定方法。


背景技术：

2.黄曲霉毒素(aflatoxins，afs)是一类有毒的次级代谢产物，主要由特曲霉(aspergillus nomius)、黄曲霉(aspergillus flavus)和寄生曲霉(aspergillus parasiticus)等霉菌产生，是二氢呋喃和香豆素的衍生物。afs是目前发现的毒性最强的毒素，其结构稳定且耐高温，不易被破坏，具有急、慢性毒性，可致畸、致癌、致突变。
3.afs属肝毒素，肝脏是afs的主要作用器官，能不同程度的破坏肝脏组织，但其毒性与不同种类或结构有关。目前发现的afs种类达20多种，已鉴定出超过10种类型的结构。其中：黄曲霉毒素b1(aflatoxin b1，afb1)、黄曲霉毒素b2(aflatoxin b2，afb2)、黄曲霉毒素g1(aflatoxin g1，afg1)、黄曲霉毒素g2(aflatoxin g2，afg2)是最重要的成员，已知毒性afb1＞afb2＞afg1＞afg2，其中afb1的存在量最大，而且具有最强的毒性，半数致死量(ld
50
)为0.36μg/kg(体重)，为氰化钾的10倍，砒霜的68倍，致癌力是六六六的10000倍，甚至更毒于眼镜蛇的毒汁。
4.1993年，世界卫生组织(world health organization，who)国际癌症研究机构(international agency for research on cancer，iarc)将afb1列为i类致癌物iarc-who，而afg1的致癌能力相比于afb1低得多，且afb2和afg2本身不具有致癌作用，但有研究表明经过体内生物转化afb2可小部分转化为afb1，因此，afb2也有一定致癌性。
5.食用植物油主要成分为甘油三酯(95％-98％)和其它化学物质(2％-5％)，为人体提供能量、脂溶性维生素和抗氧化物等，是人类饮食中的重要组成部分。据报道，世界上每年有超过25％的食物受到afs的污染，尤其是花生、大豆、芝麻和玉米等油料作物，在生产、加工、运输、储藏等环节控制不当易受霉菌侵染而产生黄曲霉毒素。
6.食用植物油是油料作物经过压榨或浸出以及一系列的工艺制取的。而受到afs污染的油料作物会引起食用植物油中afs超标。油脂中afs的存在极大地增加了食用植物油的食用风险，严重危害着人们的身体健康。afs的耐高温性与稳定性使得很难被杀灭，但用紫外线、微波和光催化可解毒，最新研究表明基因工程及拮抗菌也有望在抑制产毒菌株生长和毒素产生方面发挥作用。
7.然而优先的预防措施是制定限量标准，因此各国政府及组织根据各国实际国情专门制定了严格的afs的限量标准。我国现行有效标准《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》(gb 2761－2017)规定，afb1在花生油、玉米油中限量为20μg/kg，afb1在其它植物油脂中的限量为10μg/kg，除此之外并未对其它afs做出限量规定；欧盟颁布的ec no.1525/98号法令规定了食品中afb1的限量为2μg/kg，afb1+afb2+afg1+afg2四种afs的总量不得超过15μg/kg；日本规定了食品中afb1不得检出，afb1+afb2+afg1+afg2四种afs的总量不得超过15μg/kg。
8.目前检测afs常用方法有薄层色谱法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱-荧光检测法和液相色谱-质谱联用法等，gb 5009.22-2016《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素b族和g族的测定》均把以上方法列入其中。上述方法中前3种方法灵敏度低、操作步骤多、流程复杂、抗干扰能力差，易出现假阳性。高效液相色谱质谱联用技术以其灵敏度高、选择性好、抗干扰能力强的优点，已成为近年来黄曲霉毒素检测的主要方法。
9.在样品前处理方面，免疫亲和柱法是afs目前主要的提取净化方法，但其成本高、耗时长。由于食用植物油样品中afs的浓度较低，而甘油三酯、维生素和植物甾醇等内源性化合物的浓度较高，因此迫切需要一种有效的样品预处理方法来提取和富集afs，避免最终溶液中残留大量脂肪。


技术实现要素：

10.针对上述问题，现提供一种处理操作简单、净化效果好、前处理时间短、检测成本低、灵敏度和准确性好的食用植物油中黄曲霉毒素的快速测定方法。
11.具体技术方案如下：
12.一种食用植物油中黄曲霉毒素的快速测定方法，具有这样的特征，包括如下步骤：
13.1)固相微萃取滤头的制备：通过水热反应制备mil-101(cr)材料，再将mil-101(cr)材料均匀分散于异丙醇中，取适量分散液注入带有滤膜的针头式尼龙过滤器中；
14.2)混合外标工作液和混合内标工作液的配制：将10μg/ml的afb1、afb2、afg1、afg2混合外标标准品稀释在乙腈中，制备形成浓度为1.0μg/ml的黄曲霉毒素混合外标储备液，并储存在-20℃下；移取适量外标标准储备液，用乙腈稀释成浓度为100ng/ml的混合外标工作液；以10ml乙腈将0.5μg/ml的afb
1-13c17
、afb2-13c17
、afg1-13c17
、afg2-13c17
混合内标标准品稀释成浓度为50.0ng/ml的黄曲霉毒素混合内标标准储备液，并储存在-20℃下；移取适量内标标准储备液，用乙腈稀释成浓度为5.0ng/ml的混合内标工作液；
15.3)混合标准工作曲线的配制：移取适量系列混合外标工作液和适量混合内标工作液，用不含待测物的食用植物油样品的基质提取液配制成浓度分别为0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的基质匹配工作溶液；
16.4)样品分析检测：采用液相色谱串联谱法对基质匹配标准工作溶液进行测定，绘制标准曲线；以相同的仪器参数检测待测样品，获得待测样品中afs的质量色谱图，以保留时间和离子比率对目标物进行定性分析，以内标法定量计算得到待测物的浓度；
17.其中，高效液相色谱-串联谱法中流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为乙腈；线性梯度洗脱中流动相a+流动相b＝100％，线性梯度洗脱条件为：0-2min，10.0％b；2-5min，10.0-95.0％b；5-8min，95.0％b；8-8.01min，10.0％b；8.01-10min，10.0％b。
18.上述的快速测定方法，还具有这样的特征，步骤3)中前处理方法为：将0.2g食用植物油准确称重至5ml离心管中，添加适量的混合内标工作液，再添加2.0ml正己烷稀释油样，将混合物涡旋1min后装入注射器中，以1.0ml/min流速推过mil-101(cr)固相微萃取滤头，再装入2.0ml乙酸乙酯/正己烷(1:9，v/v)进行淋洗，去除残留的基质成分，最后装入3.0ml丙酮将分析物从mil-101(cr)材料上洗脱下来；再在室温下将洗脱液在温和氮气流下蒸发至干燥，残留物溶解在0.2ml 20％乙腈水中，通过0.22μm尼龙滤膜过滤器过滤，将3μl滤液注入hplc
–
ms/ms系统。
19.上述的快速测定方法，还具有这样的特征，步骤4)中标准曲线绘制方法为：移取适量系列混合外标工作液和适量混合内标工作液，用不含待测物的食用植物油样品的基质提取液配制成浓度分别为0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的基质匹配工作溶液，用高效液相色谱-串联质谱仪进行检测，获得标准溶液的质量色谱图，以内外标峰面积比为纵坐标，以内外标标准溶液的浓度比为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程。
20.上述的快速测定方法，还具有这样的特征，质谱条件为：离子源为电喷雾离子源；检测方式为多反应监测；扫描方式为正离子模式扫描；幕气气压为35psi；离子源气体为gs1、50psi；离子源气体为gs2、55psi；离子喷射电压为4500v；源温度为450℃；碰撞气体为氮气。
21.上述的快速测定方法，还具有这样的特征，色谱条件为：色谱柱为waters xbridge c18柱；进样体积为3μl；柱温为40℃；流速为0.3ml/min。
22.上述方案的有益效果是：
23.1)本发明以mil-101(cr)作为填充材料构建针头式过滤器固相微萃取装置，实现了对食用植物油中黄曲霉毒素的选择性地萃取，介孔mil-101(cr)材料具有大孔笼、高孔隙率、大比表面积和良好稳定性，可通过金属-羧基或金属-o、π-π、疏水性等多种作用有选择性的吸附黄曲霉毒素；
24.2)本发明中通过一步固相萃取技术实现食用植物油中黄曲霉毒素快速的富集净化，可以有效去除食用植物油内源性物质，净化效果好，回收率高，避免了传统液液萃取、离心和凝胶渗透色谱有机溶剂消耗多、步骤繁琐等缺点；
25.3)本发明提供的前处理方法结合灵敏度高、准确性好的高效液相色谱-串联质谱(hplc-ms/ms)，实现了对黄曲霉毒素的快速、准确分析测定，建立了食用油中黄曲霉毒素快速、有效和灵敏的分析方法。本发明提供的测定方法具有检测灵敏度和准确性高、重现性好的优点，并成功应用于市场上多种食用植物油中黄曲霉毒素的分析检测；
26.4)本发明使用mil-101(cr)作为黄曲霉毒素的吸附剂，避免了高成本的免疫亲和柱、黄曲霉毒素专用柱以及其他化学吸附剂的使用，分析成本较传统方法降低10倍，且前处理效率约为免疫亲和柱的6倍，具有环境友好、成本低、萃取效率高等优点。
附图说明
27.图1为本发明中测定方法的步骤图；
28.图2为mil-101(cr)的xrd图谱(2a)及sem图(2b)；
29.图3食用植物油中黄曲霉毒素的的色谱图；
30.图4为本发明中吸附剂用量-萃取效率图(4a)及负载溶剂-萃取效率图(4b)；
31.图5为本发明中洗淋条件-萃取效率图；
32.图6为本发明中萃取速度-萃取回收率图。
具体实施方式
33.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于
本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
35.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
36.本发明的实施例中提供了一种食用植物油中黄曲霉毒素的快速测定方法，包括如下步骤：
37.1)固相微萃取滤头的制备：通过水热反应制备mil-101(cr)材料，再将mil-101(cr)材料均匀分散于异丙醇中，取适量分散液注入带有滤膜的针头式尼龙过滤器中；
38.2)混合外标工作液和混合内标工作液的配制：将10μg/ml的afb1、afb2、afg1、afg2混合外标标准品稀释在乙腈中，制备形成浓度为1.0μg/ml的黄曲霉毒素混合外标储备液，并储存在-20℃下；移取适量外标标准储备液，用乙腈稀释成浓度为100ng/ml的混合外标工作液；以10ml乙腈将0.5μg/ml的afb
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、afb2-13c17
、afg1-13c17
、afg2-13c17
混合内标标准品稀释成浓度为50.0ng/ml的黄曲霉毒素混合内标标准储备液，并储存在-20℃下；移取适量内标标准储备液，用乙腈稀释成浓度为5.0ng/ml的混合内标工作液；
39.3)混合标准工作曲线的配制：移取适量系列混合外标工作液和适量混合内标工作液，用不含待测物的食用植物油样品的基质提取液配制成浓度分别为0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的基质匹配工作溶液；
40.4)样品分析检测：采用液相色谱串联谱法对基质匹配标准工作溶液进行测定，绘制标准曲线；以相同的仪器参数检测待测样品，获得待测样品中afs的质量色谱图，以保留时间和离子比率对目标物进行定性分析，以内标法定量计算得到待测物的浓度；
41.其中，高效液相色谱-串联谱法中条件为：waters xbridge c18柱(内径150mm
×
2.1mm，粒径5μm)；进样体积为5μl；柱温为40℃；流速为0.3ml/min；离子源为电喷雾离子源；检测方式为多反应监测；扫描方式为正离子模式扫描；幕气气压为10psi；离子源气体为gs1、50psi；离子源气体为gs2、50psi；离子喷射电压为5500v；源温度为500℃；碰撞气体为氮气；流动相a为甲酸-乙酸铵的水溶液，水溶液中甲酸浓度为0.1％(v/v)，乙酸铵浓度为5mmol/l，流动相b为0.1％甲酸乙腈溶液；线性梯度洗脱中流动相a+流动相b＝100％，线性梯度洗脱条件为：0-2min，10.0％b；2-5.5min，10.0-90.0％b；5.5-8min，90.0％b；8-8.1min，90.0-10.0％；8.1-10min，10.0％b；
42.其中，固相微萃取滤头的制备方法为：称取4g cr(no3)
3 9h2o、1.64g对苯二甲酸(pta)置于100ml烧杯中，随后加入125μl的hf(40％)、70ml水，超声辅助混合30min，混合均匀后倒入100ml反应釜内胆中，然后将反应釜密封后置于220℃干燥箱中加热反应8h，冷却至室温，用250目不锈钢过滤网过滤反应后的溶液，用离心机将得到的滤液离心后弃去上清液。沉淀物用去离子水洗涤3次，超声离心后于70℃下真空干燥24h，得到绿色粉末状的最终产物，即mil-101(cr)材料；取40mg mil-101(cr)于容量瓶中，用异丙醇定容至10ml，超声使其分散均匀，制成浓度为4mg/ml分散液，取1.5ml分散液注入带有0.22μm滤膜的针头式尼龙过滤器，使mil-101(cr)晶体被拦截于过滤器内，以制成mil-101(cr)固相微萃取滤头；
43.其中，色谱柱为waters x-bridge c18柱(内径150mm
×
2.1mm，粒径5μm)；进样体积为3μl；柱温为40℃；流速为0.3ml/min；流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为乙腈；线性
梯度洗脱中流动相a+流动相b＝100％，线性梯度洗脱条件为：0-2min，10.0％b；2-5min，10.0-95.0％b；5-8min，95.0％b；8-8.01min，10.0％b；8.01-10min，10.0％b；
44.其中，质谱条件为：离子源为电喷雾离子源；检测方式为多反应监测；扫描方式为正离子模式扫描；幕气气压为35psi；离子源气体为gs1、50psi；离子源气体为gs2、55psi；离子喷射电压为4500v；源温度为450℃；碰撞气体为氮气；
45.其中，步骤3)中前处理方法为：将0.2g食用植物油准确称重至5ml离心管中，添加适量的混合内标工作液，再添加2.0ml正己烷稀释油样，将混合物涡旋1min后装入注射器中，以1.0ml/min流速推过mil-101(cr)固相微萃取滤头，再装入2.0ml乙酸乙酯/正己烷(1:9，v/v)进行淋洗，去除残留的基质成分，最后装入3.0ml丙酮将分析物从mil-101(cr)材料上洗脱下来；再在室温下将洗脱液在温和氮气流下蒸发至干燥，残留物溶解在0.2ml 20％乙腈水中，通过0.22μm尼龙滤膜过滤器过滤，将3μl滤液注入hplc
–
ms/ms系统。
46.其中，步骤4)中标准曲线绘制方法为：移取适量系列混合外标工作液和适量混合内标工作液，用不含待测物的食用植物油样品的基质提取液配制成浓度分别为0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的基质匹配工作溶液，用高效液相色谱-串联质谱仪进行检测，获得标准溶液的质量色谱图，以内外标峰面积比为纵坐标，以内外标标准溶液的浓度比为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程。
47.由图1所示，本发明制备的mil-101(cr)材料与标准品xrd吻合。
48.本发明中黄曲霉毒素的hplc-ms/ms条件如下表所示：
[0049][0050]
5)萃取条件的优化
[0051]
通过研究目标分析物的绝对回收率，优化了spme-fsf参数，考察了吸附剂用量、装载液、淋洗液、洗脱液、萃取时间等。使用添加1.0μg/kg afb1、afb2、afg1和afg2的空白油样来优化spme-fsf参数(固相微萃取滤头不重复使用，所有实验均重复3次)。
[0052]
5.1)吸附剂用量的优化
[0053]
吸附剂是固相微萃取的核心，吸附剂的用量对萃取效率有显著影响。为了评估吸附剂用量对萃取效率的影响，将不同量的mil-101(cr)(2-12mg)应用于油样中afb1、afb2、afg1和afg2的spme-fsf。如图4a所示，当吸附剂用量从2mg增加到6mg时，萃取效率有明显的提高。当mil-101(cr)的用量大于6mg时，更多的吸附剂对萃取效率没有显著提高。为了确保萃取充分，萃取剂用量选择6mg。
[0054]
5.2)样品加载条件的优化
[0055]
由于油样的粘度很大，有必要选择适当的溶剂稀释油样，以便通过基于mil-101(cr)的spme-fsf方法提取目标分析物。本研究对二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯三种溶剂进行了比较。结果如图4b所示。使用正己烷作为负载溶剂时萃取效率最高，所有分析物的回收率均大于80％；而乙酸乙酯和二氯甲烷极性较高，能从mil-101(cr)中洗脱部分afs，导致萃取效率低，不适合作为负载溶剂。因此，本发明中选择正己烷作为负载溶剂进行进一步实验。
[0056]
5.3)淋洗条件的优化
[0057]
样品装载后，清理程序是至关重要的，尤其是具有复杂样品基质的食用植物油样品，这将会给目标物的分析带来严重的干扰。合适的淋洗液能在减小基质影响的同时避免造成分析物的损失。因此，本研究测试了不同比例乙酸乙酯与正己烷作为淋洗溶液。结果如图5a所示。随着乙酸乙酯含量从0％增加到10％，四种分析物的回收率无明显差异；当乙酸乙酯含量高于10％时，回收率逐渐下降，尤其是afb2回收率下降明显，可能是乙酸乙酯比afb1、afg1、afg2更容易从mil-101(cr)吸附剂中洗脱afb2。因此，选择乙酸乙酯/正己烷(1:9，v/v)作为淋洗液。我们进一步优化了淋洗液的体积，从1ml到5ml，如图5b所示，随着洗涤液体积从1ml增加到2ml，目标物的回收率没有明显变化。当洗涤液的体积为高于2ml时，部分分析物的回收率明显降低，因为当淋洗液体积过大时，部分分析物被淋洗液洗脱，导致回收率降低。因此，2ml乙酸乙酯/正己烷(1:9，v/v)被认为是理想的淋洗液，以尽可能消除基质干扰，也利于后续的分析物洗脱，保持令人满意的回收率。
[0058]
5.4)洗脱液的优化
[0059]
进一步优化洗脱条件。采用甲醇、乙腈、丙酮等不同溶剂作为洗脱剂，考察不同洗脱剂对afs的洗脱效率。如图5c所示，三种溶剂均显示能有效的洗脱目标物，考虑到丙酮浓缩时间短，更便于下一步分析，因此选择丙酮作为洗脱溶剂。本研究还进一步研究了洗脱液体积对回收率的影响。如图5d所示，3.0ml丙酮足以有效洗脱spme-fsf中的afs，而1-2ml丙酮作为洗脱液时，有部分目标物未完全洗脱下来，导致回收率降低。
[0060]
5.5)萃取时间的优化
[0061]
通过控制萃取过程中样品溶液通过吸附剂的速度来控制分析物与吸附剂接触时间，研究萃取时间对萃取结果的影响。分别探究了0.5、1.0、1.5、2.0和2.5ml/min五个流速对萃取效果的影响。如图6所示，当流速小于1.0ml/min时，回收率无显著差异；但当注射流速大于1.0ml/min时，四种目标物的回收率明显下降，这可能是因为流速过快导致afs与mil-101(cr)/nylon的接触时间短，从而导致吸附不完全、回收率下降的原因。因此，出于省时高效的目的，在后续实验中选择注射速度为1.0ml/min，萃取时间约为2min。
[0062]
本发明中采用如上测定方法测得食用植物油样品中黄曲霉毒素的线性范围、基质匹配标准曲线、lod、loq和me如下表所示：
[0063][0064]
基质效应是指在测定目标化合物时样品基质对目标化合物产生增强或抑制作用。me表示如下：me＝k1/k2，其中k1和k2分别是食用植物油基质背景和溶剂背景下校准曲线的斜率。当me超过1.15时，说明有增强效应；但如果me低于0.85，则说明有抑制作用；当me在0.85和1.15之间时，me不显著。由上表可知，本发明中afb1、afb2、afg1和afg2的me-estd分别为1.83、1.91、1.93和2.03，均大于1.15，均显示强的基质增强效应；故在对吸附剂用量、装载液、淋洗液、洗脱液、萃取时间等几个萃取因素进行优化时采用基质匹配外标法定量以得到最优条件，减少me的影响。
[0065]
由上表可知，本发明中afb2和afg1的me-istd分别为1.23和1.21，均大于1.15，均显示较强的基质增强效应；afg2的me-istd为0.83，小于0.85，显示出较弱的基质抑制作用；afb1的me-istd为1.07，在0.85和1.15之间，基质效应不显著。故在进行方法学验证和实际样品检测时采用基质匹配内标法定量使结果更准确。
[0066]
本发明中采用基质匹配内标法对在四种浓度下加标的未污染食用植物油样品所有分析物进行鉴定和量化，结果表明afb1、afb2、afg1和afg2的loq分别为0.1、1.0、2.0、5.0μg/kg，均在线性范围0.1-20ng/ml内，相关线性系数(r)均大于0.9998；目标分析物的lod和loq分别均为0.03和0.1μg/kg(lod和loq的计算分别基于信噪比(s/n)的3倍和10倍)。为了获得准确的定量限，本发明中以定量限浓度添加的空白食用植物油样品分六次重复测试，定量限的rsd在2.02％-4.56％之间。
[0067]
本发明中四种浓度水平下的准确度和精密度测试如下表所示：
[0068][0069]
为了验证方法的可重复性，本发明中通过分析三种浓度水平(1.0μg/kg、2.0μg/kg和5.0μg/kg)的加标食用植物油计算回收率，共进行了六次重复实验。实验表明，四种目标物的回收率在94.7％-105.9％之间，rsd在2.41％到6.88％之间。
[0070]
本发明中通过添加1.0μg/kg的未污染的食用植物油样品评估日间和日内重复性(六天内重复分析六个食用植物油样品)，以确定日间回收率和精密度(通过每天分析六个食用植物油样品来确定日内回收率和精密度)。实验表明，本发明中日间和日内试验的回收率分别为93.0％-98.5％和97.6％-100.7％。日间和日内分析精密度分别在6.09％-7.68％和2.56％-4.30％，由此说明本发明中提供的快速检测方法完全满足食用植物油样品中黄曲霉毒素的监测要求。
[0071]
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范
围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。