一种利用UPLC-HRMS对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向分析方法与流程

一种利用uplc-hrms对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向分析方法
技术领域
1.本发明涉及可疑的和未知的外源物质分析技术，尤其是一种利用uplc-hrms对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向分析方法。


背景技术：

2.农兽药和合法批准的添加剂的使用受到世界各地相关法律法规的严格监管。对这些受管制化学品进行常规检测和定量分析，一般使用标准方法和有针对性的分析方法，如使用液相色谱-三重四极杆质谱的多反应检测方法。然而，新的或改良的兽药、杀虫剂和其他未知的外源化学物质经常被有意地添加到食品中。此外，在生产、加工、运输和储存过程中也可能发生非故意的食品污染。这些未知的或不受控的外源物质很难用有针对性的分析方法进行检测。例如，三聚氰胺被添加到牛奶和婴儿配方奶粉中，常规的食品检测无法检测出来，直到大量儿童发病时才被发现。此外，在监管农药时，当需要检测的外源性化学品数量增加到数百种甚至超过1000种时，通过有针对性的分析方法对食品中的药物和其他外源性化学品进行监测就变得非常具有挑战性。
3.高效液相色谱-高分辨率质谱联用(lc-hrms)正越来越多地应用于食品中兽药和农药的定量定性分析。lc-hrms应用可分为(1)使用标准方法对测试样品中大量已知分析物进行针对性分析；(2)可疑物筛查(在不使用标准方法的情况下搜索测试样品中“已知”或预测的兽药及其代谢产物)，(3)对检测样本中未知的外源物质进行非靶向分析。这三种方法也被应用于其他类型的外源性药物的分析，如毒理学检测和兴奋剂分析。
4.数据非依赖性采集定量技术(dia)是使用lc-hrms对农药和兽药进行目标分析的一种成熟方法。dia方法包括基于四极杆飞行时间(q-tof)质谱联合swath质谱、基于轨道离子阱的可变dia(vdia)和多重dia(mdia)的序贯窗口采集。在lc-hrms的可疑物分子筛选中，离子列表相关的ms/ms获取(il-dda)是一种选择方法。在分析过程中，将可疑外源性离子列入自动质谱/质谱采集列表中，将可疑外源性离子的质谱数据与检索结果进行匹配，完成对检测样品中可疑外源性离子的初步识别，从而获得了准确的测试样品的质谱和质谱/质谱数据。由于清单中所列离子的限制，这种方法可能无法成功筛选大量可疑的外来生物制剂。相比之下，dia并不适合于可疑物筛选，因为由dia产生的片段光谱通常含有来自洗脱内生组分的离子，这使得数据库搜索非常困难。
5.生物样品中未知外源性物质的鉴定是一个巨大的分析挑战，因为未知外源性物质的元素公式、分子离子和产物离子光谱是未知的，而且它在生物测试样品中的浓度可能相对较低。离子强度相关数据采集(ii-dda)在全质谱扫描中根据未知离子强度触发质谱/质谱数据。该采集方法适用于分析高浓度未知外源生物，但不适用于复杂生物样品中低浓度未知外源生物的自动质谱/质谱采集。虽然dia方法已被用于未知物的非靶向分析，但由dia产生的片段光谱通常包含来自内生组分的离子，这使得他们的初步鉴定非常困难。此外，未知因素的非靶向分析需要非靶向数据处理方法，而为药物代谢物鉴定而开发的靶向数据处
理方法，如质量缺陷过滤法、萃取离子色谱法、产物离子过滤法等，在分析中是没有用的。


技术实现要素：

6.本发明的目的是为了克服现有的vdia和ii-dda方法在数据采集分析中存在的不足，提供一种利用uplc-hrms对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向分析方法。
7.本发明的主要目标是开发一种新的基于高分辨率质谱(hrms)的分析策略，用于回顾性分析可疑的和未知的外源物质，并评估其在猪肉样品中添加的48种“未知”兽药初步鉴定中的性能。在分析过程中，采用新开发的背景消除数据依赖采集(be-dda)技术触发“未知”的产物离子(ms/ms)光谱采集，并采用内部精确彻底的背景消除法(patbs)技术检测这些“未知物”。
8.本发明采用一个新的分析策略，用于生物样品中未知外源物质的回顾性可疑筛查和非靶向分析(如图1所示)。它依赖于新近引入的背景消除数据依赖采集(be-dda)技术，用于检测样品中未知外源物质的非靶向ms/ms光谱采集。注意，这些外源性物质在对照样品中不存在。
9.进一步的，本发明采用内部精确彻底的背景消除法(patbs)技术，对采集到的检测样品的全扫描lc-ms数据集中的这些未知外源物质离子进行非针对性数据挖掘。该分析策略的有效性是通过检测和识别48种被认为未知的兽药，并将其添加到猪肉样本中来评估的。
10.本发明在自动ms/ms获取未知信息的成功率和获得的ms/ms光谱数据的质量方面，对比了be-dda与vdia和ii-dda的性能。发现在猪肉兽药回顾性检测与鉴定中，基于be
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dda的工作流程与目前采用的dda或dia方法相比具有显著优势。
11.因此，通过be-dda和patbs技术不断改进，形成的分析策略有可能成为筛选大量或不定数量的可疑物质的实用工具，以及诸多未知的外源性物质在生物样品的分析，如分析食品中新的非法农药，人体血浆中草药的成分，以及运动员或赛马尿液中含有的提高成绩的药物等等。
12.具体方案如下：
13.一种利用uplc-hrms对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向分析方法，包括以下步骤：
14.(1)将兽药混合标准溶液加入新鲜猪肉匀浆，制备试验猪肉样品；另取新鲜猪肉作为对照猪肉样品，进行同样的匀浆，只是不添加兽药混合标准溶液；
15.(2)分别称取所述试验猪肉样品和所述对照猪肉样品，进行预处理和纯化，分别得到检测样品和对照样品，具体包括：
16.2a预处理：将所述试验猪肉样品或所述对照猪肉样品放入离心管中，加入生理盐水和乙腈，得到的混合物进行兽药提取：用旋涡混合器将所述混合物充分混合，超声提取后进行离心，取上清液，即为a；吸取部分a转移至另一个离心管中，用同样的方法再次提取兽药残留，再取上清液，即为b；
17.2b纯化：将a与b两份上清液标本混合后使用hypersep retain-pep spe柱进一步纯化，在相同的流速下进行样品富集，用乙腈洗脱完成富集过程后，将滤液收集起来，用氮气干燥，然后将干燥后的残渣重新溶解后进行离心，收集上清液用于uplc-hrms分析；
18.(3)进行uplc-hrms分析
19.利用超高效液相色谱串联高分辨率质谱，分别对所述检测样品和所述对照样品进行分析，分析过程中采用be-dda智能数据采集方式获取高分辨率全扫描ms和ms/ms数据，包括：分析物的全扫描质谱数据集使用acqurex获得，产品离子光谱数据集使用阶进更高能量碰撞诱导解离碰撞能量；
20.采用背景消除数据依赖采集be-dda方法获得检测猪肉样品的产品离子光谱和片段数据集，在be-dda的数据采集中，连续n次lc-hrms注射，其中n为≥3的正整数，第一次和第二次注射作为准备步骤，在没有获取任何产品离子或片段光谱数据的情况下，记录控制和测试猪肉样品的全扫描质谱数据集，将这些数据集用来自动构建排除列表和包含列表；接下来的第三次注射进行ms/ms采集步骤，在每次注入后，包含和排除列表会自动更新；在ms/ms采集步骤过程中，根据纳入和排除名单中获得的信息，自动记录检测猪肉样品中感兴趣的分析物的产品离子光谱数据，并进行筛查和分析，以获得兽药可疑物信息。
21.进一步的，步骤(2)中分别准确称取1.0g的所述试验猪肉样品和所述对照猪肉样品，进行预处理和纯化，分别得到检测样品和对照样品，具体包括：
22.2a预处理：将所述试验猪肉样品或所述对照猪肉样品放入10ml聚丙烯离心管中，加入2ml生理盐水和4ml乙腈，得到的混合物进行兽药提取：用旋涡混合器将所述混合物充分混合30s，超声提取15min，然后在室温下5000rpm离心10min，取上清液，即为a；吸取部分a转移至另一个10ml离心管中，用同样的方法再次提取兽药残留，再取上清液，即为b；
23.2b纯化：将a与b两份上清液标本混合后使用hypersep retain-pep spe柱进一步纯化，在开始纯化上清液之前，先通过3ml蒸馏水和1ml/min流速的甲醇活化spe柱；然后，在相同的流速下进行样品富集，用3ml乙腈洗脱完成富集过程后，将滤液收集起来，用37℃的氮气干燥，然后将干燥后的残渣溶于100μl体积浓度为67％的甲醇的水溶液中，涡旋混合溶解后，12000rpm离心5min，收集上清液用于uplc-hrms分析。
24.进一步的，步骤(3)中超高效液相色谱的色谱柱为hypersil gold c18色谱柱，尺寸为2.1mm*100mm*1.9μm，流动相由甲酸水溶液和乙腈混合组成，所述甲酸水溶液作为a相，甲酸体积浓度为0.1％，乙腈作为b相；所述流动相的流速为0.3ml/min，进样量为3μl；采用以下梯度洗脱:初始洗脱5％(b)，保持2分钟，然后5-50％(b)2-20min,50-95％(b)20-29min,95％(b)29-30min,95-5％(b)30-30.5min,5％(b)30.5-35min，％表示体积浓度，保持40℃柱温。
25.进一步的，步骤(3)中高分辨率质谱的+esi运行参数为:喷雾电压3.5kv；离子转移管温度，275℃；蒸发器温度，350℃；护套气流速，n2，40个任意单位；辅助气体的流速，n2，10个任意单位；扫描气体流速，n2，任意1个单位；扫描范围设置为m/z 100到1200。
26.进一步的，步骤(3)中分析物的全扫描质谱数据集使用acqurex获得，分辨率为60,000，半峰全宽，m/z为200；产品离子光谱数据集使用阶进更高能量碰撞诱导解离碰撞能量，％:10,30和50，半峰全宽m/z为200时，分辨率为15,000。
27.进一步的，步骤(3)中对记录控制和测试猪肉样品的全扫描质谱数据集进行patbs处理。
28.进一步的，所述食品为猪肉。
29.进一步的，所述兽药混合标准溶液为m种不同兽药混合的水溶液，m为40-50的正整
数。
30.进一步的，m为48，所述兽药混合标准溶液由以下兽药的水溶液组成：特布他林、甲硝唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、甲氧苄啶、依诺沙星、磺胺异恶唑、磺胺嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、氟洛沙星、诺氟沙星、磺胺甲嘧啶、氧氟沙星、环丙沙星、磺胺甲氧基二嗪、氯丙肾上腺素、洛美沙星、达诺沙星、恩诺沙星、奥比沙星、磺胺甲氧基哒嗪、托洛布特罗、沙拉沙星、替氟沙星、磺胺甲噁唑、司帕沙星、磺胺多辛、磺胺莫索、磺胺苯甲酰胺、喹酸、氟羟烯索、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹喔啉、萘氧丙醇胺、泼尼松、萘啶酸、氟霉素、甲基泼尼松龙、隐性孔雀石绿、曲安奈德、β-苯勃龙、戊布洛尔、去甲睾酮、睾酮、17-甲基睾酮和醋酸甲地孕酮。
31.有益效果：
32.本发明中，利用patbs技术对所获得的lc-ms数据集进行非靶向数据挖掘，成功找到全部48种兽药，其中46种兽药被be-dda触发，生成准确的ms/ms谱图。所记录的猪肉样品中所有外源物的全扫描质谱和ms/ms谱数据集被定义为外源物图谱。利用mzcloud光谱库中选定的兽药(疑似兽药)的质谱数据搜索测试猪肉样品的外源性物质图谱，得到了正确的结果。通过对mzcloud光谱库进行检索，从外源性物质图谱中选取个别兽药(未知)的质谱数据，初步确认了它们的特性。相比之下，使用离子强度数据相关采集的同一样品分析仅记录了34种兽药的ms/ms谱。此外，独立采集方法能够获得44种兽药的片段光谱，但其光谱数据仅显示出一个或几个感兴趣的个别分析物的真实产物离子，以及许多来自洗脱后的物质成分和背景噪声的片段。
33.总之，本发明提供的利用uplc-hrms对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向分析方法，有潜力成为一种实用检测工具，可用于生物样本(如食品中的兽药和农药)中未知物的回顾性筛查和非靶向分析。
附图说明
34.为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施例，而非对本发明的限制。
35.图1是本发明一个实施例提供的猪肉或其他生物样品中可疑物筛查和非靶向分析整体流程图；
36.图2a是本发明一个实施例提供的未处理的全扫描lc/ms离子色谱图；
37.图2b是本发明一个实施例提供的lc/ms数据集生成的喹诺酮类兽药的eics图；
38.图2c是本发明一个实施例提供的patbs处理全扫描lc/ms离子色谱图；
39.图2d是图2c的局部放大图；
40.图3a是本发明一个实施例提供的处理过的磺胺吡啶的质谱图(m/z 250.0646)；
41.图3b是本发明一个实施例提供的氧氟沙星(m/z 362.1509)处理的质谱图；
42.图3c是本发明一个实施例提供的β-群勃龙(m/z 271.1690)处理的质谱图；
43.图3d是本发明一个实施例提供的未处理的磺胺吡啶的质谱图(m/z 250.0646)；
44.图3e是本发明一个实施例提供的氧氟沙星(m/z 362.1509)未处理的质谱图；
45.图3f是本发明一个实施例提供的β-群勃龙(m/z 271.1690)未处理的质谱图；
46.图3g是本发明一个实施例提供的集中了磺胺吡啶、氧氟沙星和β-群勃龙的lc/ms
数据的eics图；
47.图4a是本发明一个实施例提供的在未处理的lc/ms数据集中保留时间为12.04min时，磺胺喹噁啉的质谱图；
48.图4b是本发明一个实施例提供的来自patbs处理的lc/ms数据集的磺胺喹噁啉的质谱图；
49.图4c是本发明一个实施例提供的从mzcloud检索到的磺胺喹噁啉标准品的产品离子色谱图；
50.图4d是本发明一个实施例提供的从be-dda采集的lc/ms/ms数据集中获得的磺胺喹噁啉的离子色谱图；
51.图4e是本发明一个实施例提供的vdia采集的lc/ms/ms数据集上的磺胺喹噁啉片段色谱图；
52.图4f是本发明一个实施例提供的来自lc/ms数据集的m/z 301.0754的eic图。
具体实施方式
53.下面给出本发明中使用的部分术语的定义，其他未述及的术语具有本领域所公知的定义和含义：
54.uplc-hrms：超高效液相色谱串联高分辨率质谱。
55.非靶向分析：利用高分辨质谱分析方法，采集样品中所有能检测到的离子的所有一级和二级质谱信息。通过数据处理，对采集到的信息进行数据的定性和定量分析，从而发现样品中有哪些化合物，并确定其含量。
56.be-dda：背景消除数据依赖采集技术，相关内容参见c.y.zhu,t.t.cai,y.jin,j.y.chen,g.q.liu,n.s.xu,r.shen,y.h.chen,l.y.han,s.p.wang,c.s.wu,m.s.zhu,artificial intelligence and network pharmacology based investigation of pharmacological mechanism and substance basis of xiaokewan journal pre-proof in treating diabetes,pharmacol.res.159(2020)104935,https://dx.doi.org/10.1016/j.phrs.2020.104935或者c.s.wu,h.y.zhang,c.h.wang,h.l.qin,m.s.zhu,j.l.zhang,an integrated approach for studying exposure,metabolism,and disposition of multiple component herbal medicines using high-resolution mass spectrometry and multiple data processing tools,drug metab.dispos.44(2016)800-808,https://dx.doi.org/10.1021/jasms.0c00436。
57.patbs：内部精确彻底的背景消除法，相关内容参见c.s.wu,h.y.zhang,c.h.wang,h.l.qin,m.s.zhu,j.l.zhang,an integrated approach for studying exposure,metabolism,and disposition of multiple component herbal medicines using high-resolution mass spectrometry and multiple data processing tools,drug metab.dispos.44(2016)800-808,https://dx.doi.org/10.1124/dmd.115.068189或者h.y.zhang,l.ma,k.he,m.s.zhu,an algorithm for thorough background subtraction from high-resolution lc/ms data:application to the detection of troglitazone metabolites in rat plasma,bile,and urine,j.mass spectrom.43(2008)1191-1200,https://dx.doi.org/10.1002/jms.1432。
405m/z和395-1205m/z)，覆盖前一次全扫描的整个质量范围。
70.具体来说，在be-dda的数据采集中，连续5次lc-hrms注射。第一次和第二次注射被认为是准备步骤。在没有获取任何产品离子或片段光谱数据的情况下，记录了控制和测试猪肉样品的全扫描质谱数据集。这些数据集用来自动构建排除列表和包含列表。接下来的三次注射被认为是ms/ms采集步骤，在此过程中，根据纳入和排除名单中获得的信息，自动记录检测猪肉样品中感兴趣的分析物的产品离子光谱数据。在每次注入后，包含和排除列表会自动更新。
71.在ms/ms采集步骤过程中，根据纳入和排除名单中获得的信息，自动记录检测猪肉样品中感兴趣的分析物的产品离子光谱数据，并进行筛查和分析，以获得兽药可疑物信息。
72.实施例3uplc-hrms分析工作流
73.本实施例对uplc-hrms分析工作流进行具体介绍，如图1所示：(a)为可疑物筛查流程图。(b)为非靶向分析流程图。
74.使用uplc-hrms分析工作流分析一个含有48种未知兽药的测试猪肉样品。通过连续注射，be-dda自动获取检测样品中兽药及其他未知外源物质的全扫描ms数据集和ms/ms光谱数据集。整个数据采集包括前两次注射，以获得质控猪肉样品和测试猪肉样品的全扫描质谱数据集，另外三次注射，以获得测试猪肉样品中感兴趣的分析物的质谱/质谱数据集，共计5次，即n＝5。
75.本实施例中测试和对照样品的全扫描质谱数据集被patbs处理，以揭示存在于测试样品中，但在对照样品中不存在或存在于低得多的浓度的任何未知外源物质的分子离子。此外，本实施例还从be-dda获得的ms/ms数据集中检索了检测到的外源物质的ms/ms光谱。将检测生物样品中所有外源物质的精确质谱和质谱/质谱数据集定义为单个生物样品的外源物质谱。这种猪肉样本的外源物质特征进一步用于回顾性怀疑未知外源物质的扫描和非靶向筛查。
76.在回顾性怀疑物扫描中，通过将其精确的处理器离子和产品离子光谱与检测样品的外源物质剖面中列出的命中离子光谱进行初步识别。相比之下，对未知物的回顾性非靶向分析是通过使用准确的质谱和质谱/质谱数据在xenobitics谱中记录的未知物的质谱数据库中搜索完成的。一旦未知物质的光谱数据与数据库中搜索到的匹配，对未知物质的初步识别就完成了。然后，利用相同的lc-hrms方法将未知化合物的lc-hrms数据与其参比标准品进行匹配，即可对可疑物筛查或非靶向分析中初步鉴定出的未知外源物质进行最终鉴定或确认。
77.实施例4猪肉中兽药检测
78.本实施例采用实施例3中的分析工作流，对猪肉中兽药进行检测，采用patbs法检测试验猪肉样品中的兽药(即未知的外源物质)。
79.通常，未经处理的生物样品的全扫描lc/ms谱显示没有或少数高度丰富的外源物质成分，而大多数外来生物离子埋藏在背景噪声和生物基质的内源成分之下。如图2a所示，虽然兽药可以通过靶向离子色谱分析(eic)揭示出来，但在未加工的检测猪肉样品的基峰色谱图中并没有出现兽药(图2b)。相比之下，所有48个猪肉样品中的兽药清晰地显示在背景消除法处理后的基峰离子色谱图中(图2c、2d)，其干涉峰较少，而不考虑其分子量、质量缺陷、同位素模式和碎片。此外，patbs数据处理显著去除了大部分未处理的全扫描质谱中
出现的内源性成分的强离子和背景噪声(图3d、3e和3f)。
80.结果表明，经patbs处理的感兴趣被分析物的全扫描质谱显示，被分析物主要是前体离子，没有或有少量干扰物质(图3a、3b、3c)。
81.图3g集中了磺胺吡啶、氧氟沙星和β-群勃龙的lc/ms数据的eics。
82.实施例5猪肉兽药的ms/ms获取及分析
83.本实施例展示实施例4中猪肉兽药的ms/ms获取结果，分别对比了3种方法，即be-dda法、ii-dda和vdia。
84.在使用be-dda法添加48种兽药的猪肉样品的数据采集中，连续三次注射自动记录了46种兽药(95.8％)的准确ms/ms光谱。在第一针注射中，触发38种兽药进行质谱/质谱采集。在第二轮和第三轮中，分别触发了5种和3种兽药的ms/ms收购。be-dda获得的检测猪肉样品中兽药代表性产品离子光谱如图4d(磺胺喹诺嗪)所示；ms/ms谱图与mzcloud谱库中相应参考标准的谱图相同或非常相似。
85.为了比较，同样的测试猪肉样品用ii-dda进行数据采集，以及vdia方法进行数据采集。发现：ii-dda能够自动获取检测猪肉样品中48种感兴趣的分析物中34种兽药(70.1％)的产品离子光谱数据。同时，使用vdia获取的数据生成了44种兽药的片段光谱数据，这些数据包含许多来自洗脱的内源性成分的片段离子，只有一个或几个来自单个分析物的真实产物离子(表1)。
86.例如，在vdia获得的磺胺喹诺酮的片段光谱(图4e)中，只有一个磺胺喹诺酮的真实产物离子(m/z 156.0114)，同时存在多个干扰离子。同样，通过vdia获得的4个磺胺类化合物的片段光谱(表1)显示了许多与分析物无关的强离子，其中只有1个(m/z 156.011)或2个(m/z 156.011和108.044)离子来自兽药。
87.表1猪肉兽药的ms/ms获取结果表
[0088][0089]
说明：表1中计数为使用准确的前体离子(mh+)搜索macloud光谱库进行复合鉴定的次数。
[0090]
本实施例将测试生物样品中所有外源物质的准确的ms和ms/ms数据集定义为样品的外源物质剖面。通过回顾性分析，该外源性基因图谱可用于检测和表征样本中已知或未知的外源性基因。通过使用patbs在正离子和/或负离子模式下处理全扫描lc/ms数据集，可以获得检测样品的外源物质剖面中列出的所有外源物质前体离子的数据。作为一种替代方法，非靶向代谢组学分析可用于识别生物样品中未知外源性离子。在本实施例中，对猪肉样品的外源物质特性进行回顾性分析，用于可疑筛选查和非靶向筛选兽药(未知)。48种兽药的前体离子是通过使用patbs处理检测和控制猪肉样品的全扫描质谱数据集发现的(图2d和2c)。通过使用be-dda自动获取存储在外源物质图谱中的46种兽药的准确产品离子光谱。
[0091]
在图1展示的嫌疑物筛查工作流程中，嫌疑物的准确前体离子和产品离子光谱可以直接用于在检测猪肉样品的异种生物剖面中搜索并匹配。例如，mzcloud光谱文库中的磺胺喹恶啉在m/z 301.0754处有质子化分子(质量误差为0.090ppm)，在m/z 156.0114、146.0713、108.0444和92.0495处有四个主要产物离子(图4c)。使用磺胺喹诺嗪(被认为是一种可疑物质)的光谱信息搜索测试猪肉样品的外源物质谱，可以在12.04分钟的保留时间内获得正确的检测结果(图4f)，因为其ms/ms谱与可疑物质的谱几乎相同(图4d)。
[0092]
因此，采用图1展示的嫌疑物筛查工作流程，不仅显著简化了嫌疑物筛查流程，而且显著提高了嫌疑物筛查的置信度。
[0093]
为了进行比较，采用vdia获得的检测猪肉样品的lc/ms数据集进行疑似筛查。首先，对目标嫌疑物的分子离子进行了搜索。一旦产生一个或几个命中点，则利用vdia获得的相应片段光谱进行初步识别。因为这样的碎片光谱数据可能不能提供可靠的或有用的信息，原因是coelted内源组分中存在许多碎片离子，如图3d,3e和3f所示，因此有必要重新分析测试样品，使用目标质谱/质谱采集生成真实的产品离子光谱。例如，在本实施例中，在vdia获得的lc/ms数据集中查找匹配的磺胺喹诺沙林，结果只有一个，磺胺喹诺沙林；然而，它的片段光谱数据(图4e)对初步鉴定没有用处，因为它只显示了分析物的一个真实产物离子和许多不相关离子。
[0094]
为了同样的比较目的，本实施例使用il-dda获得的lc/ms数据集进行可疑筛查。il-dda产生的兽药产品离子光谱与mzcloud标准品的离子光谱相同或非常相似，对疑似化学物质的初步鉴定具有较高的可信度。但是，由于il-dda不能对猪肉样品中的14种兽药产生离子光谱，对这些兽药的可疑筛查将失败。
[0095]
在图1展示的非靶向分析工作流程中，检测猪肉样品中未知异种生物的初步识别是通过mzcloud参考光谱库中使用外源物质剖面中记录的准确的质谱和产品离子光谱数据查找其匹配项进行的。mzcloud参考光谱库目前列出了超过18700种化合物，并拥有700万个精确的质谱数据。例如，寻找一种保存时间为12.04min的兽药(未知)，用mzcloud分子离子at m/z 301.0756(图4b)和产物离子谱(图4c)导致了两种非常相似的单同位素质量(表1)；然而，两种选择的匹配分数却存在显著差异。比赛得分很高(93.8)的最佳击球是正确的；其产物离子谱(图4d)与“未知”离子谱几乎相同。实际上就是磺胺喹恶灵。第二次命中的匹配分数很低(51.3)，产品离子光谱完全不同(数据未显示)。类似地，在针对mzcloud的未知外源性兽药(如洛美沙星、睾酮和曲安奈德)中，使用它们的前体离子和产品离子谱，在外源性谱中寻找它们的前体离子和产品离子谱，可以获得较高的匹配分数(表1)。洛美沙星的产品离子谱(图s1d)，睾酮(图s2d)和曲安奈德(图s3c)与mzcloud中正确命中点非常相似(图
s1c、s2f和s3d)。相比之下，非选择性vdia获得的片段光谱数据不能为未知外源物质的光谱数据库搜索提供足够的信息。例如，利用vdia获得的洛美沙星、睾酮和曲安奈德(作为未知的外生物质)的准确前体离子和片段光谱，寻找它们对mzcloud的匹配分别得到1个、2个和0个匹配。然而，这些撞击的产物离子光谱与未知物质的片段离子光谱有明显的不同，这使得未知外源性物质的初步鉴定不可靠。
[0096]
实施例5回顾性分析
[0097]
在食品安全检测过程中，无论是可疑筛选还是未知外源物质的非靶向分析，都非常需要回顾性的数据分析，因为在第一次样本分析之后，数据库中往往可以获得关于可疑物的新信息和新的外源物质的质谱数据。
[0098]
本实施例通过对4种具有代表性的兽药(磺胺喹诺酮、洛美沙星、睾酮、曲安奈德等未知外源性药物)作为未知添加物在猪肉样品中成功进行疑似筛选和非靶向分析。
[0099]
理想情况下，如果生物检测样品中所有外源物质的全扫描ms和产品离子光谱数据集被记录并作为外源物质剖面存档，样品中所有未知的外来物的初步鉴定可以通过回顾性的可疑筛选或非靶向分析来完成，一旦获得了单个参考标准的准确质谱数据，无需重新分析存储的样品。事实上，对生物样本中未知外源物质的可疑筛查和非靶向分析的回顾性分析工作流程(图1)可能广泛应用于有机食品检测、运动增强药物检查、法医化学分析和生物样本中任何未知外源物质的初步鉴定。相比之下，通过vdia生成的片段光谱数据不适合回顾性分析可疑的或未知的外来物，因为它们可能导致较低的识别可信度，如表1中的例子所示。
[0100]
实施例6目标分析
[0101]
生物样品中已知外源性物质的分析通常是在三联四联质谱仪上使用有针对性的分析方法或在hrms仪器上使用各种dia方法进行的。在be-dda的数据采集中，可以将目标外物质的离子添加到包含列表中，当这些离子物质在实时全扫描质谱分析中显示时，可以触发ms/ms光谱采集。因此，如图1所示的工作流程也可以同时应用于已知外源性的靶向分析以及生物样品中对未知外源性的可疑筛选和非靶向分析。
[0102]
总结：在上述研究中提供了一种新的分析策略(图1)，主要的流程如下：
[0103]
首先，be-dda技术被用于没有针对性采集准确的ms和ms/ms未知的外源性物质的光谱数据集测试样本。然后，利用非目标数据挖掘工具patbs对采集的全扫描lc-ms数据集中的这些外来离子进行识别。据此，获得了未知化合物的产物离子光谱。样品中发现的所有外源物质的准确的ms和ms/ms数据集被定义为样品的外源物质剖面，可以直接用于回顾性的可疑筛选和非针对性的已知分析。通过检测和鉴定猪肉样品中添加的48种兽药(作为未知的异种生物制剂)，评估了该分析策略的有效性和有效性。
[0104]
结果表明，非靶向性be-dda能够自动获取待测猪肉样品中的46种兽药，生成准确的产品离子光谱，与mzcloud标准光谱库中的标准品离子光谱相同或非常相似。所有的兽药均是通过patbs对所获得的全扫描lc/ms数据进行非靶向处理后发现的。使用patbs对获得的测试样品的全扫描ms数据集进行非定向数据挖掘，发现测试猪肉样品中添加了所有兽药，但在对照猪肉样品中不存在或存在浓度明显较低的兽药。
[0105]
相比之下，ii-dda仅触发检测样品中34种兽药的产品离子光谱采集。虽然vdia生成了44种兽药的片段光谱数据，但这些光谱仅含有一个或几个来自感兴趣的个别分析物的
真
[0106]
实产物离子，以及来自洗脱的内源性成分和背景噪声的许多强离子。
[0107]
本研究结果还表明，使用be-dda进行数据采集，patbs进行数据挖掘，在对已知外源物质的回顾性可疑筛选和非靶向分析中，与目前使用的dda或dia方法相比，具有显著优势。
[0108]
此外，在be-dda收购中使用包含清单，预计在进行未知的外源物质分析时，可以很好地对已知的外源物质进行靶向分析。
[0109]
尽管还需要进一步改进be-dda和patbs技术，并对不同生物样品中真正未知的外源物质进行进一步的分析，可以预测，上述分析策略可以应用在回顾怀疑许多类型的筛选和没有针对性分析未知的外源性物质在各种各样的生物样品，如水果中的非法农药、人体血浆中的草药组件、运动员和赛马尿液中能增强体力的药物等等，具有广泛的运用前景。
[0110]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0111]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0112]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。