血型抗原三糖偶联物在血型抗体检测中的应用的制作方法

1.本发明属于血型抗体检测领域，涉及血型抗原三糖偶联物在血型抗体检测中的应用，具体涉及血型抗原三糖a类似物蛋白偶联物和血型抗原三糖b类似物蛋白偶联物的在血型抗体检测中的应用。


背景技术：

2.血型鉴定是临床输血前的首要工作，因为不同血型的血液相互输血时会因为抗原和抗体的凝聚作用而发生溶血现象，进而可能危及人的生命安全，因此正确的血型鉴定是保证输血安全的前提条件。目前血型鉴定的方法包括正定型法和反定型法。正定型法检测红细胞抗原，反定型法检测血清中的抗体，其中以人a、b、o血型抗原/抗体检测最为重要。根据人体血液中红细胞膜表面抗原的不同可分为不同的血型。a型血的红细胞上带有血型抗原a（以下简称“a抗原”），血清中有血型抗体b（以下简称“b抗体”）；b型血的红细胞上带有血型抗原b（以下简称“b抗原”），血清中有血型抗体a（以下简称“a抗体”），ab型血的红细胞上既有a抗原也有b抗原，血清中没有a抗体和b抗体；o型血的红细胞上a抗原和b抗原都没有，血清中同时存在a抗体和b抗体。
3.目前常见的血型正反定型一般采用凝集法，其原理是利用血型抗原和抗体反应引起肉眼可见的红细胞凝集来判断结果。正定时，使用igm抗-a或抗-b试剂检测样本的红细胞抗原；反定时，使用已知a或b型的红细胞试剂测定样本血清中的igm血型抗体。但鉴于新鲜红细胞不易保存（红细胞表面血型抗原的抗原性随保存时间延长而逐渐下降），因此用于反定检测的a或b型的红细胞试剂对保存条件、运输条件的要求较高，增加了反定检测的成本、限制了反定检测的应用。现有技术中的一些技术方案尝试提取天然血型抗原（例如，通过红细胞膜来提取天然a抗原和b抗原）在反定检测中替代完整红细胞，但相关提取和制备工艺往往较为复杂、不易量产，并且提取出的天然血型抗原对保存条件依然有较高要求。人工合成血型抗原是解决上述技术问题的研究方向之一，但目前已知的人工合成血型抗原在特异性、亲和力、稳定性等方面都存在技术问题，无法有效应用到反定检测中。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提供了血型抗原三糖偶联物在血型抗体检测中的应用。本发明所述的血型抗原三糖偶联物为一种血型抗原三糖类似物蛋白偶联物，为方便区分，在未偶联蛋白之前，以下统一称为“血型抗原三糖类似物”。
5.血型抗原三糖类似物在制备血型抗体检测试剂中的应用，其特征在于，所述血型抗原三糖类似物包括血型抗原三糖b类似物；所述血型抗原三糖b类似物与血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin, klh）或牛血清蛋白（bovine serum albumin，bsa）偶联形成血型抗原三糖b类似物蛋白偶联物；当所述血型抗原三糖b类似物为b2型时，所述血型抗原三糖b类似物与所述血蓝蛋白偶联的偶联比值为5:1
–
40:1，所述血型抗原三糖b类似物与所述牛血清蛋白偶联的偶联比值为20:1；当所述血型抗原三糖b类似物为b1型、b3型或b4型
时，所述血型抗原三糖b类似物与所述血蓝蛋白的偶联比值为40:1。
6.在一些实施例中，所述血型抗原三糖b类似物为b2型，所述血型抗原三糖b类似物与所述血蓝蛋白偶联的偶联比值为20:1。
7.在一些实施例中，所述血型抗原三糖类似物还包括血型抗原三糖a类似物；所述血型抗原三糖a类似物与血蓝蛋白或牛血清蛋白偶联形成血型抗原三糖a类似物蛋白偶联物。
8.在一些实施例中，当所述血型抗原三糖a类似物为a2型时，所述血型抗原三糖a类似物与所述血蓝蛋白的偶联比值为10:1
–
80:1；当所述血型抗原三糖a类似物为a3型或a4型时，所述血型抗原三糖a类似物与所述血蓝蛋白的偶联比值为10:1
–
80:1。
9.在一些实施例中，所述血型抗原三糖a类似物为a2型，所述血型抗原三糖a类似物与所述血蓝蛋白偶联的偶联比值为40:1。
10.在一些实施例中，当所述血型抗原三糖a类似物为a2型时，所述血型抗原三糖a类似物与牛血清蛋白的偶联比值为10:1
–
80:1；当所述血型抗原三糖a类似物为a3型或a4型时，所述血型抗原三糖a类似物与牛血清蛋白的偶联比值为10:1或者40:1
–
80:1。
11.在一些实施例中，所述血型抗原三糖a类似物为a2型，所述血型抗原三糖a类似物与所述牛血清蛋白偶联的偶联比值为40:1。
12.在一些实施例中，所述血型抗体检测试剂用于免疫层析检测、光密度法检测或柱凝集法检测。
13.在一些实施例中，所述血型抗体检测试剂用于免疫层析检测，当所述血型抗原三糖a类似物为a3型或a4型时，所述血型抗原三糖a类似物与所述血蓝蛋白的偶联比值为10:1或者40:1
–
80:1。
14.本发明还提供了一种免疫层析检测试剂盒，其特征在于，包含检测卡，所述检测卡采用硝酸纤维素膜；所述检测卡上包被血型抗原三糖b类似物与血蓝蛋白或牛血清蛋白的偶联物，用于检测血清样本中的血型抗体；当所述血型抗原三糖b类似物为b2型时，其与血蓝蛋白偶联的偶联比值为5:1
–
40:1，其与牛血清蛋白偶联的偶联比值为20:1；当所述血型抗原三糖b类似物为b1型、b3型或b4型时，其与血蓝蛋白的偶联比值为40:1。
15.在一些实施例中，所述检测卡上还包被有血型抗原三糖a类似物与血蓝蛋白的偶联物或者与牛血清蛋白的偶联物。
16.在一些实施例中，当所述血型抗原三糖a类似物为a2型时，所述血型抗原三糖a类似物与血蓝蛋白的偶联比值为10:1
–
80:1；当所述血型抗原三糖a类似物为a3型或a4型时，所述血型抗原三糖a类似物与血蓝蛋白的偶联比值为10:1或者40:1
–
80:1。
17.在一些实施例中，当所述血型抗原三糖a类似物为a2型时，所述血型抗原三糖a类似物与牛血清蛋白的偶联比值为10:1
–
80:1；当所述血型抗原三糖a类似物为a3型或a4型时，所述血型抗原三糖a类似物与牛血清蛋白的偶联比值为10:1或者40:1
–
80:1。
18.本发明还提供了一种柱凝集试剂盒，其特征在于，包含abo血型反定型检测卡、血型抗原三糖类似物蛋白偶联物；所述血型抗原三糖类似物蛋白偶联物包括血型抗原三糖b类似物与血蓝蛋白或牛血清蛋白偶联；当所述血型抗原三糖b类似物为b2型时，所述血型抗原三糖b类似物与血蓝蛋白偶联的偶联比值为10:1
–
40:1，所述血型抗原三糖b类似物与牛血清蛋白的偶联比值为20:1；当所述血型抗原三糖b类似物为b1型、b3型或b4型时，所述血型抗原三糖b类似物与血蓝蛋白偶联的偶联比值为40:1。
19.在一些实施例中，所述血型抗原三糖类似物蛋白偶联物还包括血型抗原三糖a类似物与血蓝蛋白或牛血清蛋白偶联；当所述血型抗原三糖a类似物为a2型时，所述血型抗原三糖a类似物与血蓝蛋白或牛血清蛋白的偶联比值为10:1
–
80:1；当所述血型抗原三糖a类似物为a3型或a4型时，所述血型抗原三糖a类似物与血蓝蛋白的偶联比值为10:1
–
80:1，所述血型抗原三糖a类似物与牛血清蛋白的偶联比值为10:1或40:1
–
80:1。
20.有益技术效果。
21.1）经实验证明，本发明技术方案所采用的上述血型抗原三糖a类似物（a1
–
a4）蛋白偶联物（偶联bsa或klh）和上述血型抗原三糖b类似物（b1
–
b4）蛋白偶联物（偶联bsa或klh）（参见表格7a和7b）有良好的特异性，作为人工合成的血型抗原，可以区别识别相应的血型抗体，检测的准确性高，可以用于各类型血型抗体检测，具有巨大潜在的临床应用价值。尤其是在应用在免疫层析检测中，本发明技术方案所采用的部分血型抗原三糖类似物蛋白偶联物可以稳定地固定在检测试纸上，并且高效捕捉对应的血型抗体，显色效果（例如，通过胶体金标记显色）易于识别、肉眼可见，因此有应用到快速血型筛查、poct检测、普通人血型自查等场景中的潜力。
22.2）本发明采用的血型抗原三糖类似物蛋白偶联物通过化学工艺合成，比较容易实现工业级量产，可以作为各类实验体系中的血型抗原原料使用，从而可以在例如反定检测中替代红细胞试剂或天然血型抗原，避免了天然血型抗原提取及制备的繁琐工艺，降低了血型检测的成本。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
24.图1为本发明血型抗原三糖b类似物i型合成路线图。
25.图2为本发明血型抗原三糖b类似物ii型合成路线图。
26.图3为本发明血型抗原三糖b类似物iii型合成路线图。
27.图4为本发明血型抗原三糖b类似物iv型合成路线图。
具体实施方式
28.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5%，更典型的是所述值的+/-4%，更典型的是所述值的+/-3 %，更典型的是所述值的+/-2 %，甚至更典型的是所述值的+/-1 %，甚至更典型的是所述值的+/-0.5%。
30.在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化
限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围1
〜
6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
31.本发明所述的“血型抗原三糖a类似物”指的是基础化学式如化学式a1-a4所示的四种化合物及其衍生物，分别为i型a抗原化合物（化学式a1，以下简称“a1”或“a1型”）、ii型a抗原化合物（化学式a2，以下简称“a2”或“a2型”）、iii型a抗原化合物（化学式a3，以下简称“a3”或“a3型”）和iv型a4抗原化合物（化学式a4，以下简称“a4”或“a4型”）。
32.（化学式a1）。
33.（化学式a2）。
34.（化学式a3）。
35.（化学式a4）。
36.本发明所述的“血型抗原三糖b类似物”指的是基础化学式如化学式b1-b4所示的四种化合物及其衍生物，分别为i型b抗原化合物（化学式b1，以下简称“b1”或“b1型”）、ii型b抗原化合物（化学式b2，以下简称“b2”或“b2型”）、iii型b抗原化合物（化学式b3，以下简称“b3”或“b3型”）和iv型b抗原化合物（化学式b4，以下简称“b4”或“b4型”）。
37.（化学式b1）。
38.（化学式b2）。
39.（化学式b3）。
40.（化学式b4）。
41.本发明所述的“血型抗原三糖类似物蛋白偶联物”是指上述血型抗原三糖a类似物与bsa或klh蛋白偶联形成的蛋白偶联物（以下简称“a-bsa”、“a-klh”），以及上述血型抗原三糖b类似物与bsa或klh蛋白偶联形成的蛋白偶联物（以下简称“b-bsa”、“b-klh”）。
42.实施例一、血型抗原三糖类似物蛋白偶联物的制备1.1 血型抗原三糖a类似物蛋白偶联物的制备。
43.在一些实施例中，可以按照bovin课题组（drouillar s, et al., large-scale synthesis of h-antigen oligosaccharides by expressing helicobacter pyloria1,
2-fucosyltransferase in metabolically engineered escherichia coli cells[j]. angew chem, 2006, 118(11):1810-1812）的模块化组装策略方法,首先合成两个目标糖砌块，之后通过糖苷化反应合成目标糖链，主要反应步骤示意如下。
[0044]
。
[0045]
然后由上述方法生成的目标糖链末端位与连接羧基的丁酰胺发生加成反应生成本发明抗原三糖a类似物，共四型（a1-a4），化学结构式如化学式a1-a4所示。最后再使用一种免疫原性低、反应活性好、偶联率高的线性连接臂将所述血型抗原三糖a类似物与bsa蛋白或klh蛋白的赖氨酸残基上的氨基进行偶联（例如，在糖链合成时预先装在起始底物上的一段连接有叠氮基的烷烃链，作为连接臂，再通过双活化酯试剂实现血型抗原三糖类似物与载体蛋白的偶联），进而合成本发明的血型抗原三糖a类似物蛋白偶联物（a1-bsa，a2-bsa，a3-bsa，a4-bsa；a1-klh，a2-klh，a3-klh，a4-klh），其化学式如下所示。
[0046]
a1-bsa（化学式a1-bsa）。
[0047]
a2-bsa（化学式a2-bsa）。
[0048]
a3-bsa（化学式a3-bsa）。
[0049]
a4-bsa
（化学式a4-bsa）。
[0050]
a1
‑ꢀ
klh（化学式a1
‑ꢀ
klh）。
[0051]
a2
‑ꢀ
klh（化学式a2
‑ꢀ
klh）。
[0052]
a3
‑ꢀ
klh（化学式a3
‑ꢀ
klh）。
[0053]
a4
‑ꢀ
klh（化学式a4
‑ꢀ
klh）。
[0054]
其中，n = 10、20、40、60、80，即血型抗原三糖a类似物与蛋白（bsa或klh）偶联的比值范围为10:1~80:1，具体参见表格1。
[0055]
1.2 血型抗原三糖b类似物蛋白偶联物的制备。
[0056]
首先合成4种二糖前体，采用的策略是在起始单糖（glcnac，glanac）的还原端通过化学法引入含有叠氮基团的链接臂，之后再以化学合成的glcnacβpron3，galnacαpron3，galnacβpron
3 单糖作为受体，通过一锅多酶法完成4个型别前体的合成，化学式如下。
[0057]
血型抗原三糖b类似物二糖前体一型
。
[0058]
血型抗原三糖b类似物二糖前体二型。
[0059]
血型抗原三糖b类似物二糖前体三型。
[0060]
血型抗原三糖b类似物二糖前体四型。
[0061]
然后在合成的上述4种二糖前体的非还原端引入一个α1-3半乳糖糖基转移酶gtb合成4种血型抗原三糖b类似物b1-b4（分子结构如化学式b1-b4所示），其具体合成路径如图1-图4所示。
[0062]
最后再使用一种免疫原性低、反应活性好、偶联率高的线性连接臂将所述血型抗原三糖b类似物（b1-b4）与bsa蛋白或klh蛋白的赖氨酸残基上的氨基进行偶联（例如，在糖链合成时预先装在起始底物上的一段连接有叠氮基的烷烃链，作为连接臂，再通过双活化酯试剂实现血型抗原三糖类似物与载体蛋白的偶联），合成抗原三糖b类似物蛋白偶联物 （b1-bsa，b2-bsa，b3-bsa，b4-bsa；b1-klh，b2-klh，b3-klh，b4-klh），其化学式如下。
[0063]
b1-bsa
（化学式b1-bsa）。
[0064]
b2-bsa（化学式b2-bsa）。
[0065]
b3-bsa（化学式b3-bsa）。
[0066]
b4—bsa（化学式b4-bsa）。
[0067]
b1-klh
（化学式b1-klh）。
[0068]
b2-klh（化学式b2-klh）。
[0069]
b3-klh（化学式b3-klh）。
[0070]
b4-klh（化学式b4-klh）。
[0071]
其中，n = 5、10、20、40，即血型抗原三糖b类似物与klh偶联的比值范围为5:1~40:1，具体参见表格1。
[0072]
表格1 血型抗原三糖类似物和蛋白偶联比
实施例二血型抗原三糖类似物蛋白偶联物的定性验证（抗原固化法免疫层析技术）。
[0073]
为了研究本发明合成的血型抗原三糖类似物蛋白偶联物能否用于简易、快速的定性血型检测，本发明采用抗原固化法免疫层析技术来进行验证。为了检测血清中的抗体a和抗体b，采用赛多利斯sartorius硝酸纤维素（nc）膜cn140组装成的检测卡，nc膜上包括检测线（即t线）和质控线（即c线）。t线上分别固化包被有血型抗原三糖a类似物蛋白偶联物或血型抗原三糖b类似物蛋白偶联物，c线上包被抗鸡igy抗体。胶体金/微球垫中含有标记的抗人μ链抗体和鸡igy抗体。
[0074]
在检测时，将样本从上样孔（在检测卡上标记为s）加入。样本中含有的血型抗体a或抗体b能与胶体金标记的抗人μ链抗体结合，形成复合物并在nc膜上层析，当该复合物层析到t线时，血型抗体a或b与对应的血型抗原三糖a类似物蛋白偶联物或血型抗原三糖b类似物蛋白偶联物特异性结合形成肉眼可见的显色线（即血型抗体a与人工合成抗原a结合；血型抗体b与人工合成抗原b结合）。若样本中无对应的抗体a或抗体b，则不能形成复合物，不能在t线处显色。基于此，当样本中含抗体a，不含抗体b时，为a型血；样本中含抗体b，不含抗体a，为b型血；样本中不含抗体a和抗体b，为ab型血；样本中同时含抗体a和抗体b，为o型血。样本先层析到t线，然后再层析到c线，c线在检测所有样本时均应出现显色，否则试验无效。
[0075]
检测卡在本技术中，包被血型抗原三糖a类似物蛋白偶联物（a-bsa、a-klh）的检测卡在本发明中被称为a检测卡；包被血型抗原三糖b类似物蛋白偶联物（b-bsa、b-klh）的检测卡在本发明中被称为b检测卡。
[0076]
在各个a检测卡上分别加入标准血型抗体a（品牌millipore，批号jhe2103，货号jh-1l-bk）1
µ
l，再加入80
ꢀµ
l样本稀释液（0.01mpbs），静止大约15min
‑ꢀ
20min后，用肉眼观察c线及t线处的显色情况，并拍照记录。
[0077]
在各个b检测卡上分别加入标准血型抗体b（品牌millipore，批号jmc2103，货号jm-1l-bk）1
ꢀµ
l，再加入80
ꢀµ
l样本稀释液（0.01mpbs），静止大约15min-20min，用肉眼观察c线及t线处的显色情况，并拍照记录。
[0078]
上述检测结果总结在表格2a
–
2d中，显色肉眼可见用“+”号表示，肉眼不可见用
“‑”
号表示。
[0079]
上述检测结果显示：对血型抗原三糖b类似物而言，b2型与bsa或klh偶联后都可以在t线上有效显色（肉眼可见）。但b2-bsa的显色效果仅在偶联比例为20:1时效果明显，而b2-klh在较广的偶联比例范围内（从5:1到40：1）均展现较好的显色效果。另外，当b-klh偶联比例为40:1时，b1-klh，b3-klh和b4-klh的显色效果也可以达到肉眼可见。对血型抗原三糖a类似物而言，a2
–
a4无论是和bsa偶联还是和klh偶联，所形成的血型抗原三糖类似物蛋白偶联物均可以在t线上有效显色（偶联比例：10:1, 40:1, 60:1, 80:1），但当a-bsa和a-klh的蛋白偶联比例为20:1时，仅a2-bsa/a2-klh能有效显色，a3-bsa/a3-klh、a4-bsa/a4-klh均不能有效显色。另外，a1无论是和bsa偶联还是klh偶联，在本发明测试过的偶联比值上均未能有效显色。
[0080]
上述实验结果显示，当特定的血型抗原三糖类似物与特定的蛋白偶联后（例如，b2-klh, a2-bsa, a2-klh），或者在特定的偶联比值时（20:1（b2-bsa）；40:1（b1-klh, b3-klh, b4-klh）；10:1、40:1
–
80:1（a3-bsa, a4-bsa, a3-klh, a4-klh）），在检测血型抗体标准品时，在t线上可以有效显色，达到了肉眼可见的程度，证明这些血型抗原三糖类似物经蛋白偶联后可以稳定地、有效地固定在nc膜或者其他类型的固相介质（例如，酶标板、各种材质的微球或者磁珠）上，并且能够有效、特异性地捕捉对应的血型抗体，因此能够用于快速、简易的定性检测血型抗体（例如，因为肉眼可见，普通人即可读取结果），让血型检测可以居家或者在小型诊所即可完成。
[0081]
对本领域技术人员而言，本发明的血型抗原三糖类似物蛋白偶联物也可以用于采用其他标记方式的实验体系（例如，酶标记，荧光标记或其它发光物标记）。另外，除了标记抗体，也可以用不同的标记方法对血型抗原三糖类似物蛋白偶联物进行标记，根据实际需求用于各种异相或者均相检测。
[0082]
表格2a表格2b
表格2c表格2d实施例三血型抗原三糖b类似物蛋白偶联物的定量验证。
[0083]
3.1 血型抗原三糖b偶联klh蛋白实验。
[0084]
1）将标准品抗体稀释100倍的检测结果本实验采用的主要实验试剂包括：乳胶微球（125μl乳胶微球，共标记0.1mg 抗原）；试剂r1（1g bsa，0.24g tris，0.1g pc300，5g peg6000，100ml水，ph8.5）。
[0085]
本实验的上样方式如下：先用r1稀释a、b抗体标准品（品牌millipore，批号jhe2103，货号jh-1l-bk；品牌millipore，批号jmc2103，货号jm-1l-bk）100倍，得到体积为200μl的稀释后的a、b抗体标准品，然后再加入试剂r2（即将上述乳胶微球用tbs稀释100倍）200μl，共得到400μl的待检测样品。在本实验中，检测波长为340nm。
[0086]
上述实验结果汇总如下表：表格3a上述实验结果显示，本发明所采用的抗原b与klh偶联后，无论是采用b1-b4中的哪种型，也无论是采用和klh在5:1
–
40:1范围中的哪种偶联比值，抗原b结合b抗体的od值（大于等于0.334）都明显高于加入a抗体时所得的od值（最高也只能达到0.261），p/n值（阳性血
清od值／阴性血清od值）均可以达到1.4以上，即本发明所采用的抗原b能够在血型抗体的检测中很好地区分a抗体和b抗体，具有较好的特异性。值得注意的是，针对b1-klh、b3-klh和b4-klh，偶联比值为40:1时p/n值最高，即最能区分a抗体和b抗体。b2-klh的p/n值在本发明采用的偶联比值范围内（5:1
–
40:1）都较高，尤其是在偶联比值为20:1时，p/n值最佳，高达2.459。
[0087]
2）将标准品抗体稀释200倍的检测结果为了进一步验证本发明所合成的血型抗原三糖b类似物蛋白偶联物（b-klh）在抗体浓度较低时进行检测的效果，本实验将准品抗体稀释200倍进行检测。本实验采用的主要实验试剂包括：乳胶微球（125μl乳胶微球标记0.1mg 抗原）；试剂r1（1g bsa，0.24g tris，0.1g pc300，5g peg6000，100ml水，ph8.5）。本实验的上样方式如下：用r1稀释a、b抗体标准品200倍（品牌millipore，批号jhe2103，货号jh-1l-bk；品牌millipore，批号jmc2103，货号jm-1l-bk），得到体积为200μl的稀释后抗体标准品，然后再加入试剂r2（将上述乳胶微球用tbs稀释200倍）200μl，共得到400μl的待检测样品。在本实验中，检测波长为340nm。
[0088]
上述实验的结果汇总如下表：表格3b上述实验结果显示，即使是将标准品抗体稀释200倍，本发明所采用的抗原b，无论是采用b1-b4中的哪种型，也无论是采用和klh在5:1
ꢀ–ꢀ
40:1中的哪种偶联比值，抗原b结合b抗体的od值（大于等于0.300）都明显高于加入a抗体时所得的od值（最高也只能达到0.261），p/n值几乎都可以达到1.3以上（仅b1-klh和b3-klh在偶联比值5:1时除外）。换句话说，即使是在抗体浓度较低的情况下，本发明所采用的抗原b能够在血型抗体的检测中很好地区分a抗体和b抗体。
[0089]
3.2 血型抗原三糖b结合bsa蛋白实验。
[0090]
1）将标准品抗体稀释100倍的检测结果。
[0091]
本实验采用的主要实验试剂包括：乳胶微球（125μl乳胶微球，共标记0.1mg 抗原）；试剂r1（1g bsa，0.24g tris，0.1g pc300，5g peg6000，100ml水，ph8.5）。
[0092]
本实验的上样方式如下：用r1稀释a、b抗体标准品（品牌millipore，批号jhe2103，货号jh-1l-bk；品牌millipore，批号jmc2103，货号jm-1l-bk）100倍，得到体积为200μl的稀释后抗体标准品，然后再加入试剂r2（将上述乳胶微球用tbs稀释100倍）200μl，共得到400μ
l的待检测样品。在本实验中，检测波长为340nm。
[0093]
上述实验结果汇总如下表：表格3c上述实验结果显示，本发明所采用的抗原b，无论是采用b1-b4中的哪种型，也无论是采用和bsa在5:1
–
40:1中的哪种偶联比值，抗原b结合b抗体的od值都与加入a抗体时所得的od值虽然也存在差别，但不如抗原b与klh偶联时的od值在识别a抗体和b抗体时的差值，多组数据的p/n值在1.231~1.678之间。上述结果证明，血型抗原三糖b（b1-b4）类似物偶联bsa蛋白也能检测b抗体，在上述实验中区分a抗体和b抗体，但其能力和效果不如血型抗原三糖b（b1-b4）类似物偶联klh蛋白。
[0094]
2）将标准品抗体稀释200倍的检测结果。
[0095]
为了进一步验证本发明所合成的血型抗原三糖b类似物蛋白偶联物（b-bsa）在抗体浓度较低时进行检测的效果，本实验将准品抗体稀释200倍进行检测。本实验采用的主要实验试剂包括：乳胶微球 （125μl乳胶微球标记0.1mg 抗原）；试剂r1（1g bsa，0.24g tris，0.1g pc300，5g peg6000，100ml水，ph8.5）。本实验的上样方式如下：用r1稀释a、b抗体标准品200倍（品牌millipore，批号jhe2103，货号jh-1l-bk；品牌millipore，批号jmc2103，货号jm-1l-bk），得到体积为200μl的稀释后抗体标准品，然后再加入试剂r2（将上述乳胶微球用tbs稀释200倍），共得到400μl的待检测样品。在本实验中，检测波长为340nm。
[0096]
上述实验结果汇总如下表：表格3d上述实验结果与标准品抗体稀释100倍的检测结果类似，无论是采用b1-b4中的哪
种型，也无论是采用和bsa在5:1
–
40:1中的哪种偶联比值，抗原b结合b抗体的od值都与加入a抗体时所得的od值存在差别，但明显不如抗原b与klh偶联时的od值在识别a抗体和b抗体时的差值。仅有b2：bsa=20:1时，p/n值能达到1.421；b3：bsa=20:1时，p/n值能达到1.394。结合nc膜显色实验（表格2a），仅b2：bsa=20:1时，可以用肉眼在检测卡上看到显色反应。上述结果证明，血型抗原三糖b（b1-b4）类似物偶联bsa蛋白也能在一定程度上检测b抗体，区分a抗体和b抗体，但其能力明显不如血型抗原三糖b（b1-b4）类似物偶联klh蛋白。
[0097]
实施例四血型抗原三糖a类似物蛋白偶联物的定量验证（光密度实验）。
[0098]
4.1 血型抗原三糖a结合bsa蛋白实验。
[0099]
1）将标准品抗体稀释100倍的检测结果。
[0100]
本实验采用的主要实验试剂包括：乳胶微球（125μl乳胶微球，共标记0.1mg 抗原）；试剂r1（1g bsa，0.24g tris，0.1g pc300，5g peg6000，100ml水，ph8.5）。
[0101]
本实验的上样方式如下：用r1稀释a、b抗体标准品（品牌millipore，批号jhe2103，货号jh-1l-bk；品牌millipore，批号jmc2103，货号jm-1l-bk）100倍，得到体积为200μl的稀释后抗体标准品，然后再加入试剂r2（将上述乳胶微球用tbs稀释100倍）200μl，共得到400μl的待检测样品。在本实验中，检测波长为340nm。
[0102]
上述实验结果汇总如下表：表格4a上述实验结果显示，本发明所采用的抗原a偶联bsa时，a2-a4中的绝大多数（除a3:bsa=20:1、a4：bsa=20:1之外）无论是采用和bsa在10:1
–
80:1中的哪种偶联比值，抗原a结合a抗体的od值（大于等于0.4）都高于结合b抗体的od值（最高仅达到0.245）。实验证明，本发明所采用的抗原a2
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a4能够在血型抗体的检测中很好地区分a抗体和b抗体，尤其以a2:bsa=40:1的区分效果最好。相比之下，a1-bsa偶联在区分识别a抗体和b抗体的能力较差，p/n值仅略高于1。
[0103]
2）将标准品抗体稀释200倍的检测结果。
[0104]
为了进一步验证本发明所合成的血型抗原三糖a类似物蛋白偶联物（a-bsa）在抗体浓度较低时进行检测的效果，本实验将准品抗体稀释200倍进行检测。本实验采用的主要
实验试剂包括：乳胶微球（125μl乳胶微球标记0.1mg 抗原）；试剂r1（1g bsa，0.24g tris，0.1g pc300，5g peg6000，100ml水，ph8.5）。本实验的上样方式如下：用r1稀释a、b抗体标准品200倍（品牌millipore，批号jhe2103，货号jh-1l-bk；品牌millipore，批号jmc2103，货号jm-1l-bk），得到体积为200μl的稀释后抗体标准品，然后再加入试剂r2（将上述乳胶微球用tbs稀释200倍）200μl，共得到400μl的待检测样品。在本实验中，检测波长为340nm。
[0105]
上述实验结果汇总如下表：表格4b上述实验结果显示，即使是将标准样品稀释200倍后，抗体浓度低的情况下，本发明所采用的抗原a2
–
a4偶联bsa时，无论是采用和bsa在10:1
–
80:1中的哪种偶联比值（a3:bsa=20:1、a4:bsa=20:1除外），p/n值相对较高，即依然能够在血型抗体的检测中很好地区分a抗体和b抗体，尤其以a2:bsa=40:1的区分效果最好。相比之下，a1-bsa偶联在区分识别a抗体和b抗体的能力较差，p/n值仅略高于1。
[0106]
4.2 血型抗原三糖a结合klh蛋白实验。
[0107]
1）将标准品抗体稀释100倍的检测结果。
[0108]
本实验采用的主要实验试剂包括：乳胶微球（125μl乳胶微球，共标记0.1mg 抗原）；试剂r1（1g bsa，0.24g tris，0.1g pc300，5g peg6000，100ml水，ph8.5）。
[0109]
本实验的上样方式如下：用r1稀释a、b抗体标准品（品牌millipore，批号jhe2103，货号jh-1l-bk；品牌millipore，批号jmc2103，货号jm-1l-bk）100倍，得到体积为200μl的稀释后抗体标准品，然后再加入试剂r2（将上述乳胶微球用tbs稀释100倍）200μl，共得到400μl的待检测样品。在本实验中，检测波长为340nm。
[0110]
上述实验结果汇总如下表：表格4c
上述实验结果显示，将标准样品稀释100倍后，本发明所采用的抗原a偶联klh时，a2
ꢀ‑ꢀ
a4中的绝大多数无论是采用和klh在10:1
–
80:1范围中的哪种偶联比值，抗原a结合a抗体的od值（大于等于0.4）都高于结合b抗体的od值（最高仅达到0.293）。实验证明，本发明所采用的抗原a2
–
a4能够在血型抗体的检测中很好地区分a抗体和b抗体，尤其以a2:klh=40:1的区分效果最好。相比之下，a1-klh偶联在区分识别a抗体和b抗体的能力相对较差，p/n值仅略高于1。
[0111]
2）将标准品抗体稀释200倍的检测结果。
[0112]
为了进一步验证本发明所合成的血型抗原三糖a类似物蛋白偶联物（a
ꢀ–ꢀ
klh）在抗体浓度较低时进行检测的效果，本实验将准品抗体稀释200倍进行检测。本实验采用的主要实验试剂包括：乳胶微球（125μl乳胶微球标记0.1mg 抗原）；试剂r1（1g bsa，0.24g tris，0.1g pc300，5g peg6000，100ml水，ph8.5）。本实验的上样方式如下：用r1稀释a、b抗体标准品200倍（品牌millipore，批号jhe2103，货号jh-1l-bk；品牌millipore，批号jmc2103，货号jm-1l-bk），得到体积为200μl的稀释后抗体标准品，然后再加入试剂r2（将上述乳胶微球用tbs稀释200倍）200μl，共得到400μl的待检测样品。在本实验中，检测波长为340nm。
[0113]
上述实验结果汇总如下表：表格4d上述实验结果显示，即使将标准样品稀释200倍后，本发明所采用的抗原a2
–
a4偶
联klh时，无论是采用和klh在10:1
–
80:1中的哪种偶联比值，p/n值相对较高，即依然能够在血型抗体的检测中很好地区分a抗体和b抗体，尤其以a2:klh=40:1的区分效果最好。相比之下，a1-klh偶联在区分识别a抗体和b抗体的能力相对较差，p/n值仅略高于1。
[0114]
实施例五血型抗原三糖类似物蛋白偶联物柱凝集中和实验。
[0115]
本实施例采用人abo血型反定型检测卡（柱凝集法）进行中和实验，即先用人工抗原对一定量的抗体进行中和，然后再加入指示剂细胞查验是否还存在尚未被人工抗原中和的抗体。如果人工抗原的特异性强、与抗体结合的效率高，抗体就能被人工抗原充分中和，则加入（与抗体对应的）指示剂细胞时就已无能和指示剂细胞表面抗原反应的抗体，从而实验结果显示为阴性（无凝集现象）；相反地，如果人工抗原的特异性弱、与抗体结合的效率低，抗体未能被人工抗原充分中和，那么当加入（与抗体对应的）指示剂细胞时，依然存在能和指示剂细胞表面抗原反应的抗体，从而实验结果显示为阳性（有凝集现象）。通过上述实验设计可以有效验证人工合成的抗原（即本发明所述的血型抗原三糖b类似物蛋白偶联物与血型抗原三糖a类似物蛋白偶联物）与抗体的反应性能，即人工合成的抗原在识别其对应的抗体时是否具有良好的特异性。
[0116]
本实验所采用的a抗体标准品信息：品牌millipore，批号jhe2103，货号jh-1l-bk。本实验所采用的b抗体标准品信息：品牌millipore，批号jmc2103，货号jm-1l-bk。
[0117]
5.1 b-bsa抗原检测抗体。
[0118]
1）先将b抗体标准品用生理盐水稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍；然后将稀释后的抗体（用生理盐水作为阴性对照）与不同构型、不同bsa偶联比的b抗原（0.01mg/ml）等体积混合，在室温环境下孵育大约15min；然后再取40μl孵育后的混合物作为待测物加入上述abo血型反定型检测卡中；最后再加入10μl指示剂细胞b（带血型抗原b），离心后读取结果。结果如下表：表格5a2）先将a抗体标准品用生理盐水稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍；然后将稀释后的抗体（用生理盐水作为阴性对照）与不同构型、不同bsa偶联比的b抗原（0.01mg/ml）等体积混合，在室温环境下孵育大约15min；取40μl孵育后的混合物作为待测物加入上述abo血型反定型检测卡中，再加入10μl指示剂细胞b（带血型抗原b），离心后读取结果。结果如下表：表格5b
实验结果：表格5a显示，b抗原（b1-b4）偶联bsa对b抗体的中和能力整体较弱，就b-bsa内部比较，以b2-bsa相对较好（在将b抗体稀释10000倍时，在所有偶联比值上，实验结果都是阴性），尤其以b2:bsa = 20:1时的中和能力相对强一些（将b抗体稀释1000倍时即可以充分中和）。在将b抗体稀释1000倍的情况下，b1-bsa、b3-bsa在偶联比值为20:1时展现相对同型抗原其它偶联比值更好的b抗体中和能力；b4-bsa在偶联比值为40:1时展现相对同型抗原其它偶联比值更好的b抗体中和能力。表格5b是采用a抗体的对照实验，和b抗原（b1-b4）偶联bsa蛋白不应发生中和反应，也不会和指示剂细胞b发生反应，因此实验结果都为阴性，证明本实验体系运行正常。
[0119]
5.2 b-klh抗原检测抗体。
[0120]
1）先将b抗体标准品用生理盐水稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍；然后将稀释后的抗体（用生理盐水作为阴性对照）与不同构型、不同klh偶联比的b抗原（0.01mg/ml）等体积混合，在室温环境下孵育大约15min；然后再取40μl孵育后的混合物作为待测物加入上述abo血型反定型检测卡中；最后再加入10μl指示剂细胞b，离心后读取结果。结果如下表：表格5c2）先将a抗体标准品用生理盐水稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍；然后将稀释后的抗体（用生理盐水作为阴性对照）与不同构型、不同klh偶联比的b抗原（0.01mg/ml）等体积混合，在室温环境下孵育大约15min；然后再取40μl孵育后的混合物作为待测物加入上述abo血型反定型检测卡中；最后再加入10μl指示剂细胞b，离心后读取结
果。结果如下：表格5d实验结果：表格5c显示，b抗原（b1-b4）偶联klh对b抗体的中和能力，以b2-klh相对较好，尤其以b2:klh = 20:1时的中和能力最强（即使是只将b抗体稀释10倍的高浓度环境下，b2:klh = 20:1依然可以将b抗体充分中和）；b2：klh = 40:1时也呈现较好的特异性，可以在将b抗体稀释100倍的较高浓度环境下，依然可以将b抗体充分中和。b1-klh、b3-klh、b4-klh则在偶联比值为40:1时展现相对同型抗原其它偶联比值更好的b抗体中和能力，可以在将b抗体稀释1000倍的环境下将b抗体充分中和。表格5d是采用a抗体的对照实验，和b抗原（b1-b4）偶联klh不应发生中和反应，也不会和指示剂细胞b发生反应，因此实验结果都为阴性，证明本实验体系运行正常。
[0121]
5.3 a-bsa抗原检测抗体。
[0122]
1）先将a抗体标准品用生理盐水稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍；然后将稀释后的抗体（生理盐水作为阴性对照）与不同构型、不同bsa偶联比的a抗原（0.01mg/ml）等体积混合，在室温环境下孵育大约15min；然后再取40μl孵育后的混合物作为待测物加入上述abo血型反定型检测卡中；最后再加入10μl指示剂细胞a，离心后读取结果。结果如下：表格6a
2）先将b抗体标准品用生理盐水稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍；然后将稀释后的抗体（生理盐水作为阴性对照）与不同构型、不同bsa偶联比的a抗原（0.01mg/ml）等体积混合，在室温环境下孵育大约15min；然后再取40μl孵育后的混合物作为待测物加入上述abo血型反定型检测卡中；最后再加入10μl指示剂细胞a，离心后读取结果。结果如下：表格6b实验结果：表格6a显示，a抗原（a1-a4）偶联bsa对a抗体的中和能力，以a2-bsa相对较好，尤其以a2:bsa = 40:1时的中和能力最强（即使是只将a抗体稀释10倍的高浓度环境下，a2:bsa = 40:1依然可以将a抗体充分中和）；a2-bsa 在其它偶联比值（10：1
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20:1、60：1
ꢀ–ꢀ
80：1）也呈现较好的特异性，均可以在将a抗体稀释100倍的较高浓度环境下，依然将a抗体充分中和。a3-bsa、a4-bsa则在偶联比值为40:1
ꢀ–ꢀ
80：1的范围中展现相对同型抗原其它偶联比值更好的a抗体中和能力，可以在将a抗体稀释1000倍的环境下将a抗体充分中和。表格6b是采用b抗体的对照实验，和a抗原（a1-a4）偶联klh不应发生中和反应，也不会和指示剂细胞a发生反应，因此实验结果都为阴性，证明本实验体系运行正常。
[0123]
5.4 a-klh抗原检测抗体。
[0124]
1）先将a抗体标准品用生理盐水稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍；然后将稀释后的抗体（生理盐水作为阴性对照）与不同构型、不同klh偶联比的a抗原（0.01mg/ml）等体积混合，在室温环境下孵育大约15min；然后再取40μl孵育后的混合物作为待测物加入上述abo血型反定型检测卡中；最后再加入10μl指示剂细胞a，离心后读取结果。结果如下：表格6c
2）先将b抗体标准品用生理盐水稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍；然后将稀释后的抗体（生理盐水作为阴性对照）与不同构型、不同klh偶联比的a抗原（0.01mg/ml）等体积混合，在室温环境下孵育大约15min；然后再取40μl孵育后的混合物作为待测物加入上述abo血型反定型检测卡中；最后再加入10μl指示剂细胞a，离心后读取结果。结果如下：表格6d实验结果：表格6c显示，a抗原（a1-a4）偶联klh对a抗体的中和能力，也以a2-klh相对较好，尤其以a2:klh = 40:1时的中和能力最强（即使是只将a抗体稀释10倍的高浓度环境下，a2:klh = 40:1依然可以将a抗体充分中和）；a2-klh 在其它偶联比值（10：1
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20:1、60：1
ꢀ–ꢀ
80：1）也呈现较好的特异性，均可以在将a抗体稀释100倍的较高浓度环境下，依然将a抗体充分中和。a3-klh、a4-klh也在各个偶联比值上（10:1
ꢀ–ꢀ
80:1）展现一定的a抗体中和能力，可以在将a抗体稀释1000倍的环境下将a抗体充分中和。表格6d是采用b抗体的对照实验，和a抗原（a1-a4）偶联klh不应发生中和反应，也不会和指示剂细胞a发生反应，因此实验结果都为阴性，证明本实验体系运行正常。
[0125]
上述实验中，有明显或较明显实验效果的血型抗原三糖a类似物蛋白偶联物总结在表格7a中；有明显或较明显实验效果的血型抗原三糖a类似物蛋白偶联物总结在表格7b
中。
[0126]
表格7a表格7b上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。