快速细菌检测与鉴别的比色传感平台及其制备方法和应用

1.本发明涉及细菌检测技术领域，具体涉及一种快速细菌检测与鉴别的比色传感平台及其制备方法和应用。


背景技术：

2.耐药菌已成为全球第三大死亡原因，每天约造成3500人死亡。由于患者基数大，且为方便、及时治疗病人，临床上常采取的经验性抗生素治疗手段为各类细菌耐药性的产生提供了有利条件。
3.对细菌进行检测与鉴别时，目前的临床检验的金标准是平板培养法以及聚合酶链式反应法(pcr法)，然而这些方法存在耗时长，一般需要48-72小时出结果；同时使用起来需进行一系列的前处理和操作过程，便捷性较差，且需专业设备辅助。基于抗原抗体靶向原理的elisa法尽管可以实现高通量检测，有望提高临床检测效率，但其操作较为繁琐且抗体的分离与生产较为困难且昂贵。因此，开发一种快速准确廉价的细菌检测手段是遏制耐药菌产生的关键。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明提供了一种快速细菌检测与鉴别的比色传感平台，通过表面修饰不同细菌靶向分子的金纳米粒子以及普鲁士蓝纳米粒子与细菌相互作用产生不同的颜色变化，从而实现细菌的快速检测与鉴别，该方法操作简单，反应灵敏，可快速实现细菌的快速检测与鉴定，且不需要昂贵设备。
5.为了解决本发明的上述技术问题，本发明提供采用以下技术方案：
6.本发明的第一目的提供了一种快速细菌检测与鉴别的比色传感平台，比色传感平台包括细菌速检单元、革兰氏菌属鉴别单元；所述细菌速检单元由凝集素功能化的金纳米构成；所述革兰氏菌属鉴别单元包括糖肽类抗生素功能化的金纳米和多肽类抗生素功能化的普鲁士蓝纳米。
7.优选的，所述凝集素为刀豆球蛋白a或大豆凝集素；
8.所述糖肽类抗生素为万古霉素或去甲万古霉素；
9.所述多肽类抗生素为多粘菌素b或多粘菌素e。
10.优选的，所述凝集素功能化的金纳米通过酰胺键和金硫键将凝集素修饰于金纳米表面。
11.优选的，所述糖肽类抗生素功能化的金纳米通过酰胺键和金硫键将糖肽类抗生素修饰于金纳米表面；
12.所述多肽类抗生素功能化的普鲁士蓝纳米通过静电吸附将多肽类抗生素组装在普鲁士蓝纳米表面。
13.本发明的第二目的是提供一种快速细菌检测与鉴别的比色传感平台的制备方法，包括如下步骤：
14.s1，制备细菌速检单元
15.将巯基乙酸分散于tris-hcl缓冲溶液中，加入交联剂，室温活化后，加入凝集素-生理盐水溶液，室温搅拌4-6小时后终止反应。纯化后将金纳米与所得的巯基化的凝集素按体积比1-4:1混合，得凝集素功能化的金纳米构成的细菌速检单元。
16.通过巯基乙酸中的巯基与金纳米形成金硫键使得金纳米表面富含羧基，再使用酰胺键交联剂，将凝集素与金纳米连接，合成凝集素功能化的金纳米。
17.s2，制备革兰氏菌属鉴别单元
18.在pbs缓冲液中，巯基乙酸加入交联剂室温活化，加入糖肽类抗生素，室温搅拌4-6小时后终止反应，纯化后将金纳米与所得的巯基化糖肽类抗生素按体积比1-4:1混合，得糖肽类抗生素功能化的金纳米；通过巯基乙酸中的巯基与金纳米形成金硫键使得金纳米表面富含羧基，再使用酰胺键交联剂，将糖肽类抗生素与金纳米连接，合成糖肽类抗生素功能化的金纳米。
19.普鲁士蓝纳米粉末分散于超纯水中，加入多肽类抗生素，室温搅拌1-10小时后停止搅拌，得多肽类抗生素功能化的普鲁士蓝纳米；通过静电作用，将带正电的多肽类抗生素和带负电的普鲁士蓝纳米粒子组装在一起，合成多肽类抗生素功能化的普鲁士蓝纳米。
20.进一步，所述交联剂为nhs/edc或dmtmm，使用量为1-1.5当量。
21.本发明第三目的是提供一种快速细菌检测与鉴别的比色传感平台在细菌检测中的应用，将细菌速检单元与待测细菌按体积比1-2:1混合加入到96孔板中，速检单元颜色改变时，检测结果呈阳性，反之，则为阴性；
22.将糖肽类抗生素功能化的金纳米的革兰氏菌属鉴别单元与待测细菌按体积比1-2:1混合加入到96孔板中，革兰氏菌属鉴别单元颜色改变时，说明待测细菌为革兰氏阳性菌；
23.将多肽类抗生素功能化的普鲁士蓝纳米的革兰氏菌属鉴别单元与待测细菌按体积比1-2:1混合加入到96孔板中，革兰氏菌属鉴别单元颜色改变时，说明待测细菌为革兰氏阴性菌。
24.通过凝集素识别细菌细胞壁上的糖单元，快速凝集细菌，使得分散状态的金纳米聚集在细菌表面，5-30分钟后发生颜色变化，相比于临床传统细菌检测技术的耗时耗财耗力，本发明实现了在5-30分钟内的细菌裸眼速检，可实现大规模高通量的细菌检测。
25.针对治疗革兰氏阳性菌感染的糖肽类抗生素，在低浓度时可靶向连接革兰氏阳性菌细胞壁的d-ala-d-ala，从而带动金纳米聚集，2-3小时后产生颜色变化；针对治疗革兰氏阴性菌感染的多肽类抗生素，在低浓度时可以靶向革兰氏阴性菌表面脂多糖，使得电致变色材料——普鲁士蓝纳米粒子紧密结合在革兰氏阴性菌表面而参与细菌代谢循环中的电子转移，从而由普鲁士蓝还原为普鲁士白，4-6小时可观测颜色变化。通过上述两点技术可以实现革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的鉴别。
26.本发明的有益效果：
27.1、相比于临床传统细菌检测技术的耗时耗财耗力，本发明实现了在5分钟到6小时内的细菌裸眼速检以及革兰氏阳性菌与阴性菌的裸眼鉴别，可实现大规模高通量的细菌检测。
28.2、相比于elisa法使用的抗原靶向技术，本发明使用的细菌靶向分子为较为廉价，
具备较好的经济性。
29.3、本发明对细菌病原体的检测灵敏度高，可直接通过裸眼观察颜色变化，来检测浓度为10
4-108cfu/ml及以上的细菌。
30.4、本发明使用操作简单，不需要昂贵的设备，可应用于疗养院、偏远地区等医疗资源有限的地区。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
32.图1是所制备的三种功能化纳米材料靶向黏附细菌放大为1μm的电镜图；
33.图2是所制备的三种功能化纳米材料检测金黄色葡萄球菌的紫外可见光吸收光谱；
34.图3是所制备的三种功能化纳米材料检测大肠杆菌的紫外可见光吸收光谱。
具体实施方式
35.为使本发明实施例的目的、技术方案和有点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图和具体实施方式对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。
36.实施例1：制备金纳米
37.在三颈烧瓶中加入新鲜制备的1.47ml haucl4与100ml超纯水，在温和搅拌(400rpm)下加热至160℃，加热至溶液沸腾后立即加入3.5ml质量分数为1％的柠檬酸钠溶液，12分钟后关闭加热，继续搅拌30分钟，等待溶液自然冷却，得到酒红色的aunps水溶液。
38.实施例2：制备普鲁士蓝纳米
39.将1.5g pvp溶解于20ml水中，用6mol/l hcl调节ph至2，搅拌5分钟得到均匀溶液，加入45mg k3[fe(scn)6]后转移至反应釜中，在80℃烘箱中反应2小时。室温冷却，将溶液与丙酮1:1混合，以12000rpm离心10分钟，再依次水洗、醇洗，重复3次，最后60℃真空干燥12小时。
[0040]
实施例3：制备刀豆球蛋白功能化的金纳米
[0041]
一种凝集素功能化的金纳米的细菌速检单元的制备：
[0042]
将10μl巯基乙酸分散于ph＝8.5tris-hcl缓冲溶液中，加入1当量的交联剂，室温搅拌15分钟后，加入25μl 2mg/ml的由生理盐水溶解的刀豆球蛋白，室温搅拌4小时，调节ph＝7终止反应。将所得的溶液在超滤离心管(截留分子量3kd)中使用pbs洗涤两次随后将金纳米与所得的巯基化的刀豆球蛋白按体积比2：1混合，得刀豆球蛋白-金纳米。
[0043]
实施例4：制备万古霉素功能化的金纳米
[0044]
一种糖肽类抗生素功能化的金纳米的革兰氏菌属鉴别单元的制备：
[0045]
在ph＝8.5的pbs缓冲液中，5μl的巯基乙酸加入1.5当量的交联剂室温活化15分钟，加入100μl 0.1mg/ml万古霉素，室温搅拌6小时，调节ph＝7终止反应并使用透析袋(截留分子量1kd)将所得溶液透析纯化，随后将金纳米与所得的巯基化万古霉素按体积比2：1
混合，得万古霉素-金纳米。
[0046]
实施例5：制备多粘菌素b的普鲁士蓝纳米
[0047]
一种多肽类抗生素功能化的普鲁士蓝纳米的革兰氏菌属鉴别单元的制备：
[0048]
用超纯水配制10ml 0.1mg/ml的普鲁士蓝溶液，加入5μl 5mg/ml的多粘菌素b，室温搅拌10小时后停止搅拌，再用超纯水离心洗涤去除游离的多粘菌素b，得多粘菌素b-普鲁士蓝纳米。
[0049]
实施例6：细菌的检测
[0050]
分别取100μl不同浓度的金黄色葡萄球菌以及pbs缓冲液各三份加入96孔板中，在不同的96孔板中，分别加入上述实施例3-5中制备的材料，每隔半小时使用多功能酶标仪测定其吸光值并使用手机拍照记录颜色变化。
[0051]
实施例7：临床样本检测
[0052]
用构建的细菌检测与鉴别的比色传感平台检测滞留导尿袋中的尿液样本。
[0053]
将实施例3-5中制备的刀豆球蛋白-金纳米、万古霉素-金纳米、多粘菌素b-普鲁士蓝纳米，按照实施例6操作方法，分别进行对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌检测，三种功能化纳米材料靶向黏附细菌的电镜图见图1。可以看出，三种功能化纳米材料均可实现对靶向细菌的黏附，其中多粘菌素b-普鲁士蓝纳米对大肠杆菌吸附效果较好；万古霉素-金纳米对金黄色葡萄球菌吸附效果较好；刀豆球蛋白-金纳米则对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌吸附效果均较好。
[0054]
将实施例3-5中制备的刀豆球蛋白-金纳米、万古霉素-金纳米、多粘菌素b-普鲁士蓝纳米，按照实施例6操作方法检测金黄色葡萄球菌，并进行光学分析。肉眼观察，发现刀豆球蛋白-金纳米的速检单元由红色变为灰色，即细菌检验结果为阳性，万古霉素-金纳米的革兰氏菌属鉴别单元由红色变灰色，多粘菌素b-普鲁士蓝纳米的革兰氏菌属鉴别单元不变色，即金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌。
[0055]
三种功能化纳米材料检测金黄色葡萄球菌的紫外可见光吸收光谱见图2，从图2中可以看出三种功能化纳米材料在检测不同浓度的金黄色葡萄球菌时，其紫外可见光吸收光谱均发生不同程度的变化，结果显示金黄色葡萄球菌浓度最低为104cfu/ml时，可裸眼观测到颜色变化。
[0056]
将实施例3-5中制备的刀豆球蛋白-金纳米、万古霉素-金纳米、多粘菌素b-普鲁士蓝纳米，按照实施例6操作方法检测大肠杆菌，并进行光学分析。肉眼观察，发现刀豆球蛋白-金纳米的速检单元由红色变为灰色，即细菌检验结果为阳性，万古霉素-金纳米的革兰氏菌属鉴别单元不变色，多粘菌素b-普鲁士蓝纳米的革兰氏菌属鉴别单元由蓝色变成白色，即大肠杆菌为革兰氏阴性菌。
[0057]
三种功能化纳米材料检测大肠杆菌的紫外可见光吸收光谱见图3，从图3中可以看出三种功能化纳米材料在检测不同浓度的大肠杆菌时，其紫外可见光吸收光谱均发生不同程度的变化，结果显示大肠杆菌浓度最低为104cfu/ml时，可裸眼观测到颜色变化。
[0058]
将实施例7的检测结果与尿常规以及尿培养结果进行比对，结果见表1。
[0059]
表1比色平台对临床尿液样本检测的结果与临床尿常规分析结果的对比
[0060][0061]
表1结果中，g+代表革兰氏阳性菌，g-代表革兰氏阴性菌，可以看出，本发明快速细菌检测与鉴别的比色传感平台与尿检结果基本一致，证明该比色分析方法用于实际细菌感染尿液样品中细菌的浓度检测灵敏度高，准确度好。其中，10号样本的检测结果同临床检验标准中的结果有差异，这可能是由于比色平台受到尿液中其他组分影响所导致的。
[0062]
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。