Cilp1作为肾纤维化生物标志物的应用

cilp1作为肾纤维化生物标志物的应用
技术领域
1.本发明涉及肾纤维化诊断治疗技术领域，具体涉及cilp1作为肾纤维化生物标志物的应用。


背景技术：

2.肾脏纤维化是各种病因所致慢性肾脏病(chronic kidney disease,ckd)进展过程中的主要共同病理环节，包括肾小球硬化和肾间质纤维化，其病理特征表现为肾脏固有细胞损伤、炎症细胞浸润、肌成纤维细胞和成纤维细胞的活化和增殖、细胞外基质(胶原纤维、纤连蛋白、层粘连蛋白)堆积、肾脏固有细胞丢失、肾小管萎缩塌陷和血管稀疏化，最终导致肾脏正常结构破坏。肾纤维化标志着不可逆性肾损伤，因此早期诊断肾纤维化和针对病因进行治疗是延缓ckd进展的关键。
3.目前，超声和核磁共振成像等影像学方法常用于评估患者肾脏纤维化，但是这些技术只能从宏观水平上诊断肾纤维化，无法敏锐捕捉肾纤维化炎症反应期的微观病变信息，而生物标志物既能评估或定量测量某种疾病的生物学和病理学进程，同时也可作为疾病的治疗靶点，生物标志物参与了疾病进程的各个环节，其水平随疾病进程的活动或进展程度发生变化，因此，明确肾纤维化的生物标志物，有助于早期准确诊断肾纤维化和靶向治疗。
4.刘秋玉等.肾纤维化诊断生物标志物研究进展[j].分子生物医学，2019.报道了包括肾损伤类标志物、炎症和促纤维化因子类标志物、微rnas类标志物和新型生物标志物，筛选出敏感性、特异性高的肾纤维化诊断标志物，有望取代经典肾脏病理诊断。
[0005]
软骨中间层蛋白1(cartilage intermediate layer protein 1，cilp1)是抑制心肌间质纤维化作用的细胞外基质蛋白，可为干预心肌纤维化进程提供新策略；文献报道，cilp1是转化生长因子(tgf)-β的拮抗剂，是一种参与心肌纤维化信号传导的细胞外基质(ecm)蛋白。cilp1 rna在左心室(lv)压力超负荷和左室心肌梗死的动物模型中表达上调，主动脉瓣狭窄或心肌梗死患者心肌组织中cilp1蛋白水平显着升高；cilp1作为rv和lv病理重塑的新型生物标志物的潜在作用，其与肺动脉高压环境中的rv适应不良和心室动脉解偶联相关，但是，现有技术还未报道cilp1与肾纤维化相关的研究。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于，提供cilp1作为肾纤维化生物标志物的应用，证实了cilp1与肾纤维化且显著呈正相关，cilp1可作为肾脏纤维化的无创诊断性生物标志物，具备高敏感性和高特异性。
[0007]
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：
[0008]
cilp1作为肾纤维化生物标志物的应用。
[0009]
进一步的，所述生物标志物cilp1相对于未发生肾纤维化的对象，肾纤维化对象肾组织、肾小管上皮细胞和患者血清中cilp1的相对表达水平上调。
[0010]
本发明cilp1作为肾纤维化生物标志物的应用，通过收集正常人及慢性肾脏病(1-5期)患者血清，elisa试剂盒检测cilp1在血清中的含量；
[0011]
慢性肾衰患者与健康人血清cilp1差异比较，慢性肾衰患者与健康人血清cilp1的elisa结果，慢性肾衰患者cilp1的血清浓度高于正常人；结果可以证实cilp1可以作为评价指标。
[0012]
本发明cilp1作为肾纤维化生物标志物的应用，通过对收集的符合标准的慢性肾脏病(1-5期)患者肾脏组织，进行masson染色检测肾脏纤维化程度，并通过免疫荧光技术检测cilp1在肾脏的表达情况，并以tgf-β1作为纤维化指标评估cilp1的预测情况；
[0013]
肾脏疾病患者肾脏组织的masson(马松染色)，计算纤维化百分比，反应组织纤维化程度；对应患者cilp1的免疫荧光强度，进行相关性分析，相关系数r＝0.3063；
[0014]
同时，肾脏疾病患者肾脏组织中masson的面积(％)与cilp1免疫荧光强度比较，进一步验证了cilp1作为肾纤维化生物标志物。
[0015]
本发明cilp1作为肾纤维化生物标志物的应用，针对性的建立动物模型进行验证，通过uuo大鼠试验，包括：
[0016]
s1：构建假手术组、uuo试验组大鼠模型；
[0017]
具体包括：将大鼠适应性喂养一周后，给予两组大鼠腹腔注射5％水合氯醛麻醉，局部剃毛后常规消毒铺孔巾，沿腹正中线依次切开皮肤和肌肉，游离肾脏和输尿管，用组织钳托起左侧输尿管中段部位，假手术组常规缝合肌肉和皮肤，uuo组止血钳夹住输尿管，在两端用4-0号丝线分两次结扎左侧输尿管近肾盂段，剪断输尿管，然后常规缝合肌肉和皮肤；
[0018]
s2：21天后处死大鼠，收集肾脏组织标本，he、masson染色观察肾脏纤维化程度，通过免疫荧光技术检测cilp1在肾脏的表达情况，并以tgf-β1作为纤维化指标评估cilp1的预测情况；
[0019]
通过uuo大鼠肾脏组织中masson的面积(％)与cilp1免疫荧光强度比较，免疫荧光结果表明cilp1荧光强度随纤维化程度增加而增加；
[0020]
放射性肾损伤小鼠试验，包括：
[0021]
s1：将c57小鼠30只，按体重分层随机数字表法，分为3组，每组10只，分为正常对照组、10gy放射剂量组和20gy放射剂量组。
[0022]
s2：将小鼠适应性喂养一周后，正常对照组小鼠正常不进行干预，放射组小鼠单次10gy放射剂量组(10gy)和20gy放射剂量组分别用电子线一次性照射小鼠腹腔，2个月后处死两组小鼠；
[0023]
s3：收集小鼠肾脏组织，he、masson染色观察肾脏纤维化程度，通过免疫荧光技术检测cilp1在肾脏的表达情况，并以tgf-β1作为纤维化指标评估cilp1的预测情况。
[0024]
首先，计算各个组小鼠肾脏组织的masson(马松染色)，计算纤维化百分比，反应组织纤维化程度；对应小鼠肾脏组织表达cilp1的免疫荧光强度，进行相关性分析：
[0025]
二者有相关性，相关系数r＝0.686；
[0026]
针对放射性肾损伤小鼠肾脏组织中masson的面积(％)与cilp1免疫荧光强度比较，免疫荧光结果表明cilp1荧光强度随纤维化程度增加而增加；
[0027]
验证cilp1可以作为肾纤维化生物标志物的应用。
[0028]
本发明cilp1作为肾纤维化生物标志物的应用，肾小管上皮细胞系(hk-2)通过tgf-β1进行诱导纤维化(上皮间质转分化)造模，比较正常细胞组与诱导干预组中cilp1表达情况，用western blotting和qpcr技术进行检测。
[0029]
本发明的另一目的在于，提供cilp1作为肾纤维化生物标志物在诊断肾纤维化产品中的应用；
[0030]
所述诊断肾纤维化产品包括但不限于试剂、试剂盒。
[0031]
一种用于诊断肾纤维化的试剂盒，所述试剂盒包含检测肾组织、肾小管上皮细胞和患者血清中cilp1的相对表达水平上调的试剂。
[0032]
本发明的另一目的在于，提供cilp1在预测肾脏纤维化及其严重程度中的应用。
[0033]
本发明的有益效果：
[0034]
本发明提供cilp1作为肾纤维化生物标志物的应用，本发明证实了cilp1与肾纤维化且显著呈正相关，cilp1可作为肾脏纤维化的无创诊断性生物标志物，具备高敏感性和高特异性；
[0035]
提供cilp1作为肾纤维化生物标志物在诊断肾纤维化产品中的应用，通过检测肾组织、肾小管上皮细胞和患者血清中cilp1的相对表达水平，为肾纤维化早期诊断提供依据。
[0036]
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
[0037]
图1为本发明实施例1所述慢性肾衰患者组与健康人群组血清cilp1的elisa结果；
[0038]
图2为本发明实施例2所述肾脏疾病患者肾脏组织中masson的面积百分比(％)与cilp1免疫荧光强度相关性分析；
[0039]
图3为本发明实施例2所述肾脏疾病患者肾脏组织中masson的面积(％)与cilp1免疫荧光强度结果；
[0040]
图4为本发明实施例3所述uuo大鼠肾脏组织中masson的面积(％)与cilp1免疫荧光强度结果；
[0041]
图5为本发明实施例4所述放射性肾损伤小鼠肾脏组织中masson的面积(％)与cilp1免疫荧光强度结果；
[0042]
图6为本发明实施例4所述放射性肾损伤小鼠肾脏组织中masson的面积百分比(％)与cilp1免疫荧光强度相关性分析；
[0043]
图7为本发明实施例4所述hk-2细胞中clip1蛋白的western blotting结果；
[0044]
图8为本发明实施例4所述hk-2细胞中clip1基因表达的qpcr结果；
具体实施方式
[0045]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将结合附图对实施例对本发明进行详细说明。
[0046]
实施例1
[0047]
临床试验数据分析
[0048]
收集正常人及慢性肾脏病(1-5期)患者血清，elisa试剂盒检测cilp1在血清中的
含量；通过收集正常人及慢性肾脏病(1-5期)患者血清各20例，通过elisa试剂盒检测cilp1在血清中的含量，结果如图1所示：
[0049]
图1中，横坐标为分组信息(健康人群组与慢性肾衰患者组)；纵坐标为cilp1的血清浓度；两组间clip1含量有差异。
[0050]
慢性肾衰患者组与健康人群组的血清中cilp1差异比较，慢性肾衰患者与健康人血清cilp1的elisa结果显示慢性肾衰患者cilp1的血清浓度高于正常人；结果可以证实cilp1可以作为评价指标。
[0051]
实施例2
[0052]
本实施例选择符合标准的12例肾脏疾病患者；
[0053]
通过对收集的符合标准的慢性肾脏病(1-5期)患者肾脏组织，进行masson染色检测肾脏纤维化程度，并通过免疫荧光技术检测cilp1在肾脏的表达情况，并以tgf-β1作为纤维化指标评估cilp1的预测情况，并且与临床指标(血肌酐、血尿素氮等指标)相结合阐述；
[0054]
收集肾脏疾病患者数据情况如下表：
[0055]
表1肾脏疾病患者数据情况
[0056][0057]
如图2所示，肾脏疾病患者肾脏组织的masson(马松染色)，计算纤维化百分比，反应组织纤维化程度；对应患者cilp1的免疫荧光强度，进行相关性分析，相关系数r＝0.3063；
[0058]
如图3所示，选取编号为2、6、12的上述患者，肾脏疾病患者肾脏组织中masson的面积(％)与cilp1免疫荧光强度比较；
[0059]
从图3的左侧视图中可以看出，三个患者的masson染色结果表示纤维化程度依次递增(从上到下依次为编号2、6、12的上述患者)；
[0060]
从图3的右侧视图中可以看出，免疫荧光结果表明cilp1荧光强度随纤维化程度增加而增加，右侧视图中dapi：细胞核；cilp1：绿色；tgf-β1：红色；merge：cilp1与tgf-β1重叠展示(从上到下依次为编号2、6、12的上述患者)；
[0061]
基于肾脏疾病患者肾脏组织中masson的面积百分比(％)与cilp1免疫荧光强度相
关性分析，以及肾脏疾病患者肾脏组织中masson的面积(％)与cilp1免疫荧光强度比较，可以看出，进一步验证了cilp1作为肾纤维化生物标志物。
[0062]
实施例3
[0063]
uuo大鼠试验
[0064]
s1：构建假手术组、uuo试验组大鼠模型；
[0065]
具体包括：将大鼠适应性喂养一周后，给予两组大鼠腹腔注射5％水合氯醛麻醉，局部剃毛后常规消毒铺孔巾，沿腹正中线依次切开皮肤和肌肉，游离肾脏和输尿管，用组织钳托起左侧输尿管中段部位，假手术组常规缝合肌肉和皮肤，uuo组止血钳夹住输尿管，在两端用4-0号丝线分两次结扎左侧输尿管近肾盂段，剪断输尿管，然后常规缝合肌肉和皮肤；
[0066]
s2：21天后处死大鼠，收集肾脏组织标本，he、masson染色观察肾脏纤维化程度，通过免疫荧光技术检测cilp1在肾脏的表达情况，并以tgf-β1作为纤维化指标评估cilp1的预测情况；
[0067]
如图4所示，uuo大鼠肾脏组织中masson的面积(％)与cilp1免疫荧光强度比较：从图4可以看出，正常对照组(control)、uuo模型组(uuo)的肾脏组织中masson的面积(％)与cilp1免疫荧光强度比较，免疫荧光结果表明cilp1荧光强度随纤维化程度增加而增加。(dapi：细胞核；cilp1：绿色；tgf-β1：红色；merge：cilp1与tgf-β1重叠展示。
[0068]
图4中，control为正常组，uuo为模型组，依次对应上下内容，同时进行dapi：细胞核；cilp1：绿色；tgf-β1：红色；merge：cilp1与tgf-β1共染对比，结果也证实了免疫荧光结果表明cilp1荧光强度随纤维化程度增加而增加；
[0069]
验证了cilp1作为肾纤维化生物标志物的应用。
[0070]
实施例4
[0071]
放射性肾损伤小鼠试验
[0072]
s1：将c57小鼠30只，按体重分层随机数字表法，分为3组，每组10只，分为正常对照组、10gy放射剂量组和20gy放射剂量组。
[0073]
s2：将小鼠适应性喂养一周后，正常对照组小鼠正常不进行干预，放射组小鼠单次10gy放射剂量组(10gy)和20gy放射剂量组分别用电子线一次性照射小鼠腹腔，2个月后处死两组小鼠；
[0074]
s3：收集小鼠肾脏组织，he、masson染色观察肾脏纤维化程度，通过免疫荧光技术检测cilp1在肾脏的表达情况，并以tgf-β1作为纤维化指标评估cilp1的预测情况。
[0075]
首先，计算各个组小鼠肾脏组织的masson(马松染色)，计算纤维化百分比，反应组织纤维化程度；对应小鼠肾脏组织表达cilp1的免疫荧光强度，进行相关性分析：
[0076]
如图5所示，二者有相关性，相关系数r＝0.686；
[0077]
针对放射性肾损伤小鼠肾脏组织中masson的面积(％)与cilp1免疫荧光强度比较，如图6所示：
[0078]
放射性肾损伤小鼠分为正常对照组(control)、10gy放射剂量组(10gy)、20gy放射剂量组(20gy)；
[0079]
通过dapi：细胞核；cilp1：绿色；tgf-β1：红色；merge：cilp1与tgf-β1共染实验，从上之下依次为正常组、10gy放射剂量组(10gy)、20gy放射剂量组(20gy)，通过结果可以得
出，放射剂量的相关性，同时免疫荧光结果表明cilp1荧光强度随纤维化程度增加而增加；
[0080]
验证了cilp1作为肾纤维化生物标志物的应用。
[0081]
实施例5
[0082]
肾小管上皮细胞系(hk-2)通过tgf-β1进行诱导纤维化(上皮间质转分化)造模，比较正常细胞组与诱导干预组中cilp1蛋白表达情况，用western blotting和qpcr技术进行检测；
[0083]
如图7所示，hk-2细胞western blotting结果：
[0084]
第4-5代hk-2(肾小管上皮细胞)分为两组，对照组及tgf-β1诱导组，对照组不做处理，tgfβ组以2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的tgf-β1细胞因子诱导24h，计算两组cilp1的蛋白表达量；
[0085]
与正常对照组相比，随着tgf-β1浓度的升高，cilp1的表达量逐渐增加；
[0086]
如图8所示，hk-2细胞qpcr结果：
[0087]
第4-5代hk-2(肾小管上皮细胞)分为两组，对照组及tgfβ1诱导组，对照组不做处理，tgf-β1组以10ng/ml的tgf-β1细胞因子诱导24h，计算两组cilp1的mrna表达量；
[0088]
与正常对照组相比，cilp1的的mrna表达量较正常升高，两组cilp1的mrna表达量有差异，且有统计学意义(p≤0.05)。
[0089]
本发明提供cilp1作为肾纤维化生物标志物的应用，本发明证实了cilp1与肾纤维化且显著呈正相关，cilp1可作为肾脏纤维化的无创诊断性生物标志物，具备高敏感性和高特异性；
[0090]
提供cilp1作为肾纤维化生物标志物在诊断肾纤维化产品中的应用，通过检测肾组织、肾小管上皮细胞和患者血清中cilp1的相对表达水平，为肾纤维化早期诊断提供依据。
[0091]
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。