一种用于肝硬化食管胃静脉曲张的诊断和分层的蛋白标记物及其应用

1.本发明属生物医药技术领域，具体涉及一种用于肝硬化食管胃静脉曲张的诊断和分层的蛋白标记物及其应用。


背景技术：

2.肝硬化(cirrhosis)是由一种或多种病因引起的慢性、进行性、弥漫性肝脏疾病，肝脏弥漫性纤维化、再生结节和假小叶形成是其主要的病理特征。食管胃静脉曲张(gastro-esophageal varices，gov)是肝硬化门静脉高压的并发症，肝硬化患者中每年约有3％～12％发展为gov，8％～12％的患者由小静脉曲张发展为大静脉曲张。食管胃静脉曲张破裂出血(esophageal variceal bleeding，evb)是肝硬化患者主要的死亡原因，年发生率为5％～15％，急性出血病死率高达15％～35％。大静脉曲张破裂出血的情况下，6周死亡率约为11.1％～40％，胃食管静脉红色征的存在、静脉曲张的大小和肝硬化的严重程度被认为是静脉曲张出血最重要的预测因素。自1992年第一次baveno共识研讨会以来，就对使用筛查胃镜(esophagogastroduodenoscopy，egd)检测所有肝硬化患者的高风险静脉曲张(high-risk varice，hrv)提出了建议，建议肝硬化患者需每年进行一次egd检查，从而筛查静脉曲张。目前，egd仍是鉴定静脉曲张存在和判断静脉曲张大小的首选方法。然而，有很大比例的肝硬化患者不存在静脉曲张或hrv，因此内镜检查是一种不理想的筛查试验，而且egd的缺点有侵入性内镜相关的并发症以及其相对昂贵的价格，也会造成患者得不适，这些缺陷推动了静脉曲张检测新方法的研究。
3.在过去的十年中，越来越多的注意力集中于微创或非侵入性的新方法作为egd筛检胃食管静脉曲张的替代方法，以排除和纳入hrv，从而减少或避免使用egd这些侵入性方法。蛋白组学技术的运用，使得疾病生物标志物的发现和鉴定获得长足的发展。由于血液样本具有创伤少，获得容易等特点，使得血液成为理想的蛋白来源。


技术实现要素：

4.本发明第一方面的目的，在于提供检测生物标志物的物质在制备用于肝硬化静脉曲张诊断或预后评估的产品中的应用。
5.本发明第二方面的目的，在于提供检测生物标志物的物质在制备用于肝硬化静脉曲张分层的产品中的应用。
6.本发明第三方面的目的，在于提供生物标志物作为靶点在制备治疗或预防肝硬化静脉曲张的药物中的应用。
7.本发明第四方面的目的，在于提供一种标志物组合。
8.本发明第五方面的目的，在于提供一种产品。
9.本发明第六方面的目的，提供试剂盒的应用。
10.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
11.本发明的第一个方面，提供检测生物标志物的物质在制备用于肝硬化静脉曲张诊断或预后评估的产品中的应用，所述生物标志物包括ada2、svep1、vcl、lect2和calm3中的一种或多种。
12.优选地，所述检测生物标志物的物质包含定量检测生物标志物的物质。
13.优选地，所述检测生物标志物的物质包括在基因和/或蛋白水平上检测生物标志物的物质。
14.优选地，所述物质包括通过酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、放射免疫测定法、免疫共沉淀法、免疫印迹法、高效液相色谱法、毛细管凝胶电泳法、近红外光谱法、质谱法、免疫化学发光法、胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术、表面等离子共振技术、免疫-pcr技术、生物素-亲和素技术、pcr或生物芯片法检测所述生物标志物表达量的物质。
15.优选地，所述检测生物标志物的物质选自：对生物标志物具有特异性的物质、生物标志物特异性的探针、基因芯片、pcr引物。
16.优选地，所述对生物标志物具有特异性的物质为(b1)～(b3)中的任一种：
17.(b1)特异性结合生物标志物的抗体；
18.(b2)特异性结合生物标志物的配体蛋白或多肽；
19.(b3)特异性识别生物标志物的非蛋白类化合物。
20.优选地，所述的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、功能性抗体片段、抗体fab区，纳米抗体、嵌合抗体、多特异性抗体中的至少一种。
21.优选地，所述ada2和svep1在肝硬化并发重度静脉曲张患者中表达上调。
22.优选地，所述calm3、vcl和lect2在肝硬化并发重度静脉曲张患者中表达下调。
23.优选地，所述生物标志物为ada2和svep1。
24.优选地，所述生物标志物为lect2、calm3和vcl。
25.优选地，所述产品包括但不限于试剂、试剂盒、试纸、芯片。
26.优选地，所述产品的受试样品选自待测对象的体液、组织、细胞、排泄物中的至少一种。
27.本发明的第二个方面，提供检测生物标志物的物质在制备用于肝硬化静脉曲张分层的产品中的应用，所述生物标志物包括ada2、svep1、vcl、lect2和calm3中的一种或多种。
28.优选地，所述检测生物标志物的物质包含定量检测生物标志物的物质。
29.优选地，所述检测生物标志物的物质包括在基因和/或蛋白水平上检测生物标志物的物质。
30.优选地，所述物质包括通过酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、放射免疫测定法、免疫共沉淀法、免疫印迹法、高效液相色谱法、毛细管凝胶电泳法、近红外光谱法、质谱法、免疫化学发光法、胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术、表面等离子共振技术、免疫-pcr技术、生物素-亲和素技术、pcr或生物芯片法检测所述生物标志物表达量的物质。
31.优选地，所述检测生物标志物的物质选自：对生物标志物具有特异性的物质、生物标志物特异性的探针、基因芯片、pcr引物。
32.优选地，所述对生物标志物具有特异性的物质为(b1)～(b3)中的任一种：
33.(b1)特异性结合生物标志物的抗体；
34.(b2)特异性结合生物标志物的配体蛋白或多肽；
35.(b3)特异性识别生物标志物的非蛋白类化合物。
36.优选地，所述的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、功能性抗体片段、抗体fab区，纳米抗体、嵌合抗体、多特异性抗体中的至少一种。
37.优选地，所述ada2和svep1在肝硬化并发重度静脉曲张患者中表达上调。
38.优选地，所述calm3、vcl和lect2在肝硬化并发重度静脉曲张患者中表达下调。
39.优选地，所述生物标志物为ada2和svep1。
40.优选地，所述生物标志物为lect2、calm3和vcl。
41.优选地，所述产品包括但不限于试剂、试剂盒、试纸、芯片。
42.优选地，所述产品的受试样品选自待测对象的体液、组织、细胞、排泄物中的至少一种。
43.本发明的第三个方面，提供生物标志物作为靶点在筛选治疗或预防肝硬化静脉曲张的药物中的应用，所述生物标志物包括ada2、svep1、vcl、lect2和calm3中的一种或多种。
44.优选地，所述生物标志物由ada2和svep1组成；或所述生物标志物由lect2、calm3和vcl组成。
45.本发明的第四个方面，提供一种标志物组合，所述标志物组合为ada2和svep1；或lect2、calm3和vcl。
46.本发明的第五个方面，提供一种产品，包含检测本发明第四方面的标志物组合的物质。
47.本发明的第六个方面，提供试剂盒在下述任一项中的应用；
48.(1)在制备用于肝硬化静脉曲张诊断的产品中的应用；
49.(2)制备用于肝硬化静脉曲张分层的产品中的应用；
50.(3)制备用于肝硬化静脉曲张筛查的产品中的应用；
51.(4)制备用于肝硬化静脉曲张预后评估的产品中的应用；
52.(5)制备鉴别肝硬化无静脉曲张和肝硬化并发重度静脉曲张的产品中的应用；
53.所述试剂盒包括用于检测生物标志物的试剂，所述生物标志物包括ada2、svep1、vcl、lect2和calm3中的一种或多种。
54.本发明的有益效果是：
55.本发明通过对nva患者和lvb患者血液进行蛋白组学分析，筛选出ada2、svep1、calm3、vcl和lect2显著性差异蛋白，其中ada2和svep1在lvb患者中表达上调，calm3、vcl和lect2在lvb患者中表达下调，上述五种差异蛋白可作为生物标志物，通过检测其表达量实现肝硬化食管胃静脉曲张进行诊断和分层，可适用于lvb相关检测产品的开发，从而应用于临床lvb患者的诊断。
56.进一步，对上述生物标志物构建roc曲线，结果表明ada2的诊断效率最高，auc为0.779，95％ci(0.660～0.898)，最大约登指数对应的敏感性为0.667，特异性为0.8，ada2和svep1的组合模型构建的roc曲线中，auc为0.819，95％ci(0.711～0.927)，lect2、calm3和vcl的组合模型构建roc曲线中，其auc为0.732，95％ci(0.604～0.860)。
57.利用本发明提供生物标记物对肝硬化患者的血液进行检测，可快速简单的的诊断或筛查出lvb患者。相对于目前常用的诊断手段(侵入性的胃镜检查)，通过检测患者血液不会对患者造成不适，易被患者接受，且价格相对低廉。
附图说明
58.图1为差异蛋白筛选流程图。
59.图2为tmt非靶向定量蛋白组学分析中质谱数据结果统计图。
60.图3为lvb/nva组血浆差异表达蛋白结果图。
61.图4为prm靶向蛋白组学分析中差异蛋白分析结果图，图中，#表示p＜0.05，##表示p＜0.01。
62.图5为差异蛋白ada2单独鉴别肝硬化食管胃静脉曲张的roc。
63.图6为差异蛋白svep1单独鉴别肝硬化食管胃静脉曲张的roc。
64.图7为差异蛋白lect2单独鉴别肝硬化食管胃静脉曲张的roc。
65.图8为差异蛋白calm3单独鉴别肝硬化食管胃静脉曲张的roc。
66.图9为差异蛋白vcl单独鉴别肝硬化食管胃静脉曲张的roc。
67.图10为差异蛋白ada2和svep1联合单独鉴别肝硬化食管胃静脉曲张的roc。
68.图11为差异蛋白calm3、vcl和lect2联合鉴别单独鉴别肝硬化食管胃静脉曲张的roc。
具体实施方式
69.以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
70.应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
71.本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
72.实施例1
73.为了分析肝硬化静脉曲张的影响因素，发明人对来自南方医院前瞻性肝硬化队列(clinical-trials.gov:nct 04123509)2019年4月至2020年1月中符合纳入/排除标准的代偿期肝硬化患者共计205例的血液标本进行分析，其中含无静脉曲张(nva)患者147例和并发重度静脉曲张(lvb)＝58例患者。患者纳入标准：(1)临床(超声、ct、mir诊断)或病例确诊为肝硬化；(2)年龄在18～75岁之间。患者排除标准：(1)失代偿期肝硬化(腹水、肝性脑病、静脉曲张破裂出血、自发性腹膜炎、肝肾综合征等失代偿期事件)；(2)目前使用那受体阻滞剂；(3)有既往肝手术史；(4)过去或现在有肝细胞癌(hcc)、其他肿瘤和/或门静脉血栓形成；(5)过去6个月内有静脉曲张破裂出血；(6)有行tips、脾脏切除术或脾栓塞术；(7)既往有套扎、硬化剂及组织胶等静脉曲张治疗史。
74.采集上述205例患者血液标本后，室温静置60min，然后1000rpm离心15min，收集血浆标本，分装后于-80℃冰箱保存备用。利用统计学中倾向性评分匹配方法对血浆样本进行组间基本数据分析，然后进行单因素和多因素logistic回归。结果发现在多因素logistic回归中，血小板(plt)和脾脏硬度(ssm)与肝硬化高危静脉曲张有关。将plt和ssm纳入模型进行ps匹配。在ps匹配队列中，1:1匹配后共有34对患者匹配成功。nva组和lvb组的ps匹配后，两组匹配后无显著性差异。34对中有4对血浆标本不符合标准，其中1对中有1例存在轻度溶血，其余3对中各有1例血浆标本总量不符合组学分析，最终共计30对进行组学分析。按照患者入组基线时间顺序，入组时间的前9对患者(nva患者和lvb患者各9例)进行tmt(tandem mass tag)非靶向定量蛋白组学分析，入组的30对(nva患者和lvb患者各30例)均
进行prm(parallel reaction monitoring)靶向蛋白组学分析(图1)。
75.实施例2tmt非靶向定量蛋白组学分析
76.具体操作步骤如下：
77.(1)蛋白提取
78.从-80℃冰箱中取出各血浆样品，在4℃条件下，12000g离心10min，去除细胞碎片，将上清液转移至新的离心管，然后用piercetmtop 12abundant protein depletion spin columns kit(thermo scientific)严格按照说明书说明及要求去除高丰度蛋白，得到各蛋白样品，最后利用bca试剂盒测定蛋白样品的蛋白浓度。
79.(2)胰酶酶解
80.取等质量各蛋白样品于离心管中，加入裂解液(美国sigma)并将体积调整一致，再加入二硫苏糖醇(dtt，终浓度为5mm)，56℃还原30min；加入碘乙酰胺(iaa，终浓度为11mm)，并室温避光孵育15min。将烷基化好的样本转移到超滤管，室温12000g离心20min，用0.01μg/μl的nh4hco3溶液置换尿素3次；以胰蛋白酶:蛋白样本的体积比为1:50加入胰蛋白酶，37℃酶解过夜；室温12000g离心10min，回收肽段，随后用ddh2o回收肽段一次，两次肽段溶液合并。
81.(3)tmt标记
82.蛋白质经胰酶酶解后，所得到的肽段用strata x c18(phenomenex)除盐，然后真空冷冻干燥。严格按照tmt试剂盒操(美国thermo)作说明对肽段进行标记，基本操作如下：标记试剂解冻后用乙腈溶解，与肽段混合，在室温中孵育2h，将标记后的肽段混合，再除盐，最后真空冷冻干燥。
83.(4)高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，hplc)分级
84.将标记后的肽段使用高ph反向hplc分级，色谱柱型号及规格为agilent 300extend c18(5μm粒径，4.6mm内径，250mm长)。具体操作如下：肽段分级条件为8％～32％的乙腈、ph设定为9，60min分离60个组分，随后肽段合并成14个组分，合并后得到的组分经真空冷冻干燥，等待进行后续操作。
85.(5)二维液相色谱-质谱(2d-lc-ms/ms)联用分析
86.步骤(4)得到的肽段先用液相色谱流动相a相(0.1v/v％甲酸水溶液)溶解，然后使用easy-nlc 1000超高效液相系统分离。流动相a为含0.1v/v％甲酸和2v/v％乙腈的水溶液；流动相b为含0.1v/v％甲酸和90v/v％乙腈的水溶液。液相梯度条件设置如下：0～40min，7％～25％的流动相b；40～52min，25％～35％的流动相b；52～56min，35％～80％的流动相b；56～60min，80％的流动相b。流速保持在500nl/min。肽段经超高效液相系统分离后，注入nsi离子源中进行电离，然后使用q exactive plus质谱分析。离子源电压为2.1kv，肽段母离子及其二级碎片均使用高分辨orbitrap。一级质谱扫描范围设定为400～1500m/z，扫描分辨率设定为70000；二级质谱扫描范围固定起点设定为100m/z，二级扫描分辨率设定为35000。数据采集模式使用数据依赖型扫描(dda)程序。为提高质谱有效利用率，自动增益控制(agc)设定为5e4，信号阈值设定为38000ions/s，最大注入时间设定为130ms，串联质谱扫描的动态排除时间设定为30s避免母离子的重复扫描。
87.通过质谱分析共得到360796张二级谱图。质谱二级谱图经蛋白理论数据搜库后，得到可利用有效谱图数为32272张，谱图利用率为8.9％。通过谱图解析共鉴定到8421条肽
段，其中特异性肽段为8040条，共鉴定到956个蛋白，其中833个为定量蛋白(定量蛋白表示至少一个比较组有定量信息)(图2)。
88.将鉴定到的有定量信息的833个蛋白质，以1.2倍为差异表达变化阈值，以t检验进行统计学分析，p值《0.05为显著性差异阈值，在定量蛋白中，发现在lvb vs nva比较组中有34个蛋白表达发生上调，10个蛋白表达发生下调(图3)。
89.实施例3prm靶向蛋白组学分析
90.为了验证tmt非靶向定量蛋白组学的结果，发明人用prm靶向蛋白组学对差异蛋白(表达上调的34个蛋白、表达下调的10个蛋白)进行了验证。
91.结果发现，在44个差异蛋白和2个非差异蛋白中，有28个蛋白得到了定量信息，其中5个蛋白得到了差异验证(p《0.05)(表1)。在prm验证到的5个差异蛋白中，有两个差异蛋白和tmt实验一致，表现为上调蛋白，分别为腺苷脱氨酶2(adenosine deaminase 2，ada2)和人五聚域包含蛋白1(sushi，von willebrand factor type a，egf and pentraxin domain-containing protein 1，svep1)；有两个蛋白则和tmt实验相反，表现为下调蛋白，分别为钙调蛋白3(calmodulin-3，calm3)和纽带蛋白(vinculin,vcl)；存在一个蛋白(白细胞趋化因子-2(leukocyte cell-derived chemotaxin-2，lect2))虽然在tmt分析中无差异，但prm验证发现其为下调蛋白(图4)。综上，ada2和svep1在lvb组中上调，calm3、vcl和lect2在lvb组中下调。
92.表1prm蛋白定量结果
93.94.实施例4差异蛋白对肝硬化食管胃静脉曲张诊断和分层的评估
95.通过tmt和pmr分析比较肝硬化无静脉曲张患者和肝硬化合并重度静脉曲张患者的出的5个差异蛋白(ada2、svep1、calm3、vcl和lect2)，，为了进一步评估筛选出的差异蛋白对肝硬化患者并发重度静脉曲张的诊断效率，发明人对筛选出的差异蛋白构建roc曲线预测肝硬化患者并发重度静脉曲张。
96.roc曲线结果显示，ada2的诊断效率最高，auc为0.779，95％ci(0.660～0.898)，最大约登指数对应的敏感性为0.667，特异性为0.8(图5)；svep1的auc为0.652，95％ci(0.512～0.791)(图6)；lect2的auc为0.634，95％ci(0.492～0.775)(图7)；calm3的auc为0.641，95％ci(0.493～0.788)(图8)；vcl的auc为0.631，95％ci(0.485～0.778)(图9)。进一步根据logistic向前逐步回归方法，将差异蛋白ada2和svep1建立组合模型并构建roc曲线，结果表明，其auc为0.819，95％ci(0.711～0.927)(图10)。将差异蛋白lect2、calm3和vcl建立组合模型并构建roc曲线，结果表明，其auc为0.732，95％ci(0.604-0..860)(图11)。
97.上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。