ATR-FTIR快速检测顺反维生素K1含量的方法与流程

atr-ftir快速检测顺反维生素k1含量的方法
技术领域
1.本发明涉及维生素k1顺反异构体含量检测技术领域。更具体地说，本发明涉及一种atr-ftir快速检测顺反维生素k1含量的方法。


背景技术：

2.维生素k1是维持人体健康必不可少的营养素，影响着人体生理机能的正常运转，凝血功能是其主要的生理功能，是人体内肝脏合成凝血酶原(凝血因子ⅱ)、斯图尔特因子(凝血因子
ⅹ
)、转变加速因子前体(凝血因子ⅶ)和血浆促凝血酶原激酶(凝血因子
ⅸ
)所必需的物质，激活凝血因子是机体凝血功能正常发挥的必要条件。维生素k1常作为一种营养补充剂添加到保健品中，对于维生素k1缺乏症有很好的预防作用。维生素k1常以混合物形式存在，包括顺式维生素k1和反式维生素k1，反式维生素k1具有生理活性，而顺式维生素k1几乎没有生理活性。在2020版中国药典对顺式维生素k1含量做出了规定，规定以高效液相色谱法测定顺式维生素k1，其含量不得超过21％。但该方法操作比较繁琐，前处理麻烦，耗时久，需要专业人员操作，因此不利于维生素k1中顺式异构体快速测定以及生产过程的实时监控。因此，探索一种可以快速测定维生素k1顺反异构体含量的方法，对于生产监控、药品质量快速评价方面具有重要意义。


技术实现要素：

3.本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
4.为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种atr-ftir快速检测顺反维生素k1含量的方法，包括以下步骤：
5.步骤一、制备多个不同梯度浓度的顺式维生素k1和反式维生素k1的混合标准样液；
6.步骤二、检测多个混合标准样液的atr-ftir数据；
7.步骤三、将步骤二中的atr-ftir数据导入光谱分析软件，进行标准正态变量变换预处理得到反式维生素k1的预处理光谱数据；
8.步骤四、以多个混合标准样液中反式维生素k1的实际含量作为因变量y，以对应的反式维生素k1的预处理光谱数据作为自变量x，在光谱分析软件中建立偏最小二乘回归模型；
9.步骤五、检测待测样液的atr-ftir数据，然后导入光谱分析软件，进行标准正态变量变换预处理得到预处理光谱数据，将该预处理光谱数据输入步骤四建立的偏最小二乘回归模型，输出得到该待测样液的反式维生素k1的含量。
10.优选的是，还包括：
11.步骤六、将步骤二中的atr-ftir数据导入光谱分析软件，进行一阶导数预处理得到顺式维生素k1的预处理光谱数据；
12.步骤七、以多个混合标准样液中顺式维生素k1的实际含量作为因变量y，以对应的
顺式维生素k1的预处理光谱数据作为自变量x，在光谱分析软件中建立偏最小二乘回归模型；
13.步骤八、检测待测样液的atr-ftir数据，然后导入光谱分析软件，进行一阶导数预处理得到预处理光谱数据，将该预处理光谱数据输入步骤七建立的偏最小二乘回归模型，输出得到该待测样液的顺式维生素k1的含量。
14.优选的是，混合标准样液中顺式维生素k1的含量占0～100％，每间隔5％含量设置一个混合标准样液，每个含量的混合标准液设置3个，顺式维生素k1的浓度范围为0～100μg/ml。
15.优选的是，将多个混合标准样液随机划分为训练集和验证集，训练集为混合标准样液数的3/4，基于训练集的反式维生素k1的实际含量和对应的反式维生素k1的预处理光谱数据建立偏最小二乘回归模型，基于验证集的反式维生素k1的实际含量和对应的反式维生素k1的预处理光谱数据验证该偏最小二乘回归模型。
16.优选的是，基于训练集的顺式维生素k1的实际含量和对应的顺式维生素k1的预处理光谱数据建立偏最小二乘回归模型，基于验证集的顺式维生素k1的实际含量和对应的顺式维生素k1的预处理光谱数据验证该偏最小二乘回归模型。
17.优选的是，atr-ftir的光谱范围为650～4000cm-1
，分辨率为4cm-1
。
18.优选的是，混合标准样液的溶剂为异丙醇。
19.本发明至少包括以下有益效果：本发明建立了定量预测模型(两个偏最小二乘回归模型)，用定量模型对未知样品进行检测。该方法可以解决现有维生素k1顺反异构体检测方法耗时，费力，难以实时生产监控的问题。本发明具有精准性高，样品用量少，简单，快速的优点。
20.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
21.图1为本发明的其中一种技术方案的混合标准样液的原始图谱；
22.图2为本发明的其中一种技术方案的标准正态变量变换的预处理图谱；
23.图3为本发明的其中一种技术方案的多元散射校正的预处理图谱；
24.图4为本发明的其中一种技术方案的一阶导数的预处理图谱；
25.图5为本发明的其中一种技术方案的二阶导数的预处理图谱；
26.图6为本发明的其中一种技术方案的一阶导数预处理的顺式维生素k1的含量预测结果；
27.图7为本发明的其中一种技术方案的标准正态变量变换预处理的反式维生素k1的含量预测结果。
具体实施方式
28.下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
29.需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所
述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
30.1、仪器设备
31.atr-ftir光谱(傅里叶变换衰减全反射红外光谱)获取采用美国赛默飞公司nicolet is20傅里叶变换红外光谱仪，配备znse晶体；样品原始谱图通过omnic9.0软件采集。光谱预处理及偏最小二乘回归模型建立通过tq analyst 8.3软件执行。
32.2、样品
33.取顺式维生素k1标准品、反式维生素k1标准品各1mg，分别加入10ml容量瓶。采用异丙醇定容至刻度。然后将采用异丙醇溶解的顺式维生素k1、反式维生素k1相互混合，使得顺式维生素k1的含量为二者总和质量的0～100％，相邻两个含量间隔为5％，共设计21个含量的混合标准样液。每个含量的混合标准样液重复混合3次，共得到63个的混合标准样液。顺式维生素k1的浓度范围为0～100μg/ml。
34.3、红外光谱采集
35.在室温下对每个混合标准样液进行检测，扫描次数为16次，分辨率为4cm-1
，扫描范围为650～4000cm-1
。方法为采用移液枪吸取200μl混合标准样液滴加在znse体上，测定混合标准样液的atr-ftir数据，测定前对背景进行扫描。
36.4、atr-ftir数据预处理
37.原始谱图存在基线偏移，仪器噪声等影响，因此有必要对原始谱图进行光谱预处理来消除无关信息的影响。采用四种不同预处理方法对原始图谱(如图1所示)进行预处理。不同预处理图谱如图2～5所示。从63份混合标准样液中随机选取12份混合标准样液作为验证集，用于检验模型预测能力。
38.4.1、偏最小二乘回归模型建立
39.通过tq analyst计算与顺式维生素k1含量变化相关的红外区域，这些区域1380～1395cm-1
，1428～1453cm-1
，3707～3723cm-1
。与反式维生素k1含量变化相关红外区域为952～1035cm-1
、1299～1343cm-1
、3707～3734cm-1
。利用这些红外区域在tq analyst中建立不同预处理下的偏最小二乘回归模型。顺式维生素k1、反式维生素k1实际含量作为因变量y，预处理后的光谱数据作为自变量x。
40.4.2、混合标准样注中顺式维生素k1和反式维生素k1的含量预测
41.将验证集数据导入偏最小二乘回归模型中，表1展示了不同预处理下偏最小二乘回归模型对顺式维生素k1的含量预测结果。表2展示了不同预处理下偏最小二乘回归模型对反式维生素k1的含量预测结果。对于验证集来说，一阶导数预处理为最佳的顺式维生素k1的含量预测结果，预测相关系数r为0.996，均方根误差为2.42μg/ml(图6所示)，标准正态变量变换预处理为最佳的反式维生素k1的含量预测结果。预测相关系数r为0.9956，均方根误差为2.46μg/ml(图7所示)。
42.表1.不同预处理方法对顺式维生素k1的含量预测结果的影响
43.[0044][0045]
备注：rc(训练集相关系数)；rmsec(训练集均方根误差)；rv(验证集相关系数)；rmsep(验证集均方根误差)。
[0046]
表2.不同预处理方法对反式维生素k1的含量预测结果的影响
[0047][0048]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。