用于小分子筛选富集拉曼增强活性衬底的制备方法与应用

1.本发明属于属于分子信号检测领域，涉及用于小分子筛选富集拉曼增强活性衬底的制备方法与应用。


背景技术：

2.本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.近年来，sers检测作为一种特异性检测手段，由于其具有高效检测、高准确度、高灵敏性而在各种领域普遍推广。但是在实际应用中，单纯的sers检测手段又会遇到很多问题。在遇到低浓度、有杂质分子的待检测物时会出现分子富集不匀、样品亲和力差、干扰分子影响检测的情况，这很大程度的阻碍了sers的广泛应用。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供用于小分子筛选富集拉曼增强活性衬底的制备方法与应用，采用该衬底可以在检测低浓度且有杂质干扰的检测物时，实现对目标分子的富集和筛选。
5.为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
6.第一方面，一种用于小分子筛选富集拉曼增强活性衬底的制备方法，其包括如下步骤：
7.(1)将玻璃片在乙酸锌的乙醇溶液中浸泡，然后将浸泡结束的玻璃片进行烘干处理，使其表面形成一层氧化锌的籽晶层；
8.(2)将所得到的玻璃片放入乙酸锌和六亚甲基四胺的混合水溶液中，然后进行水浴加热，使玻璃表面生长氧化锌纳米线；
9.(3)在生长了氧化锌纳米线的玻璃片表面热蒸镀银层；
10.(4)镀银后的氧化锌玻璃片浸泡在六水合硝酸锌和二甲基咪唑的甲醇混合液中，在银层表面上生长zif-8；使用甲醇冲洗、充分干燥后便可以作为拉曼衬底进行使用。
11.进一步的，步骤(1)中，首先分别使用丙酮、乙醇、去离子水对玻璃片洗涤，去除其表面杂质。
12.进一步的，生长氧化锌籽晶层是使用的浓度为0.002-0.01m的乙酸锌乙醇溶液；浓度优选为0.005m。
13.进一步的，步骤(1)中，浸泡时间为10-20s，优选为15s。
14.进一步的，后续在籽晶层上生长氧化锌纳米线使用的是浓度为0.005-0.02m的乙酸锌和六亚甲级四胺的混合水溶液，浓度优选为0.01m。
15.进一步的，水浴加热80-100℃，时间为0.5-2h，优选为95℃，1h。
16.进一步的，热蒸镀的条件为：蒸发电流为60-80a，沉积速率为0.11-0.13nm/s，沉积
时间为280-440s。
17.进一步的，生长zif-8所使用的是0.01-0.03m六水合硝酸锌和0.01-0.03m2-甲基咪唑的混合甲醇溶液，浓度优选均为0.025m。
18.经过实验证实，本发明制备的用于小分子筛选富集拉曼增强活性衬底，不仅可以针对以小分子为检测物的复杂混合溶液实现小分子的富集和筛选，而且检测灵敏度较高，对4-巯基吡啶的最低检测浓度可达到10-9
m。
19.第二方面，一种上述用于小分子筛选富集拉曼增强活性衬底在重金属检测中的应用。优选的，为针对汞离子的检测；更优选的，分别是针对人体尿液、动物粪便、植物培养土壤中的汞离子进行检测。
20.第三方面，一种对汞离子检测的方法。将所述用于小分子筛选富集拉曼增强活性衬底浸泡在4-巯基吡啶溶液中，使得4-巯基吡啶充分附着于银纳米线上；将浸泡后的用于小分子筛选富集拉曼增强活性衬底再浸泡到含汞离子的溶液中，随后取出，进行拉曼检测。
21.进一步的，取出后使用酒精冲洗掉没有附着在拉曼衬底上的4-巯基吡啶。
22.由于zif-8本身存在的富集作用，会将更多的汞离子富集到银纳米线上，而汞离子会与4-巯基吡啶发生连接，这样的连接会导致4-巯基吡啶的拉曼信号强度增大，从而做到了对汞离子的检测。
23.本发明的有益效果为：
24.本发明制备了一种用于小分子筛选富集拉曼增强活性衬底，我们通过在银纳米线表面上生长zif-8，充分利用zif-8的小孔径、高孔隙率、大比表面积的特点，使衬底同时具备对小分子的富集能力和阻碍大分子干扰的能力。可以用于直接检测含有大颗粒干扰物的污染物。而且zif-8会使衬底具有更高的检测灵敏度。没有zif-8的衬底对4-巯基吡啶的最低检测浓度为10-8
m，但是有zif-8的衬底对4-巯基吡啶的最低检测浓度可以达到10-9
m。而且本次公开方法操作简单、花费时间短、成本低，适合在多个领域应用。
附图说明
25.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
26.图1为本发明实施例1制备的拉曼增强活性衬底的扫描电镜(sem)图；
27.图2为本发明实施例2制备的拉曼增强活性衬底的扫描电镜(sem)图；
28.图3为本发明实施例3制备的拉曼增强活性衬底的扫描电镜(sem)图；
29.图4为本发明实施例4制备的拉曼增强活性衬底的扫描电镜(sem)图；
30.图5为本发明实施例5制备的拉曼增强活性衬底的扫描电镜(sem)图；
31.图6为本发明实施例1～5制备的拉曼增强活性衬底对r6g检测灵敏度对比的表征图；
32.图7为本发明实施例1～5制备的拉曼增强活性衬底对4-atp检测灵敏度对比的表征图；
33.图8为本发明实施例1制备的拉曼增强活性衬底对4-mpy检测灵敏度的表征图；
34.图9为本发明实施例3制备的拉曼增强活性衬底对4-mpy检测灵敏度的表征图；
35.图10为本发明实施例3制备的拉曼活性衬底经过4-mpy修饰后对汞离子检测灵敏
度的表征图；
36.图11为本发明实施例3制备的拉曼活性衬底经过4-mpy修饰后对汞离子检测的抗干扰(来自于其他重金属的干扰)性表征图；
37.图12为本发明实施例3制备的拉曼活性衬底经过4-mpy修饰后对人体尿液中的汞离子的检测；
38.图13为本发明实施例3制备的拉曼活性衬底经过4-mpy修饰后对土壤中的汞离子的检测；
39.图14为本发明实施例3制备的拉曼活性衬底经过4-mpy修饰后对鸡粪中的汞离子的检测。
具体实施方式
40.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
41.鉴于现有sers检测小分子时容易受到大分子或者大粒径的颗粒影响缺陷，本发明提出了的用于小分子筛选富集拉曼增强活性衬底及制备方法与应用。
42.本发明的一种典型实施方式，提供了一种用于小分子筛选富集拉曼增强活性衬底及制备方法，使用水浴加热使玻璃表面生长氧化锌纳米线，然后在生长氧化锌纳米线的玻璃表面热蒸镀银层，再生长多层zif-8。
43.本发明通过热蒸镀银层增加拉曼信号，然后通过生长zif-8,使得大分子无法通过zif-8到达拉曼衬底的电磁增强区域。
44.该实施方式的一种或多种实施例中，生长氧化锌籽晶层是使用的浓度为0.005m的乙酸锌乙醇溶液，后续在籽晶层上生长氧化锌纳米线使用的是浓度为0.01m的乙酸锌和六亚甲级四胺的混合水溶液，氧化锌纳米线生长使用的水浴加热温度为95
°
。
45.该实施方式的一种或多种实施例中，热蒸镀的条件为：蒸发电流为60～80a，沉积速率约为0.11～0.13nm/s，沉积时间为280～440s。
46.该实施方式的一种或多种实施例中，生长zif-8所使用的是0.025m六水合硝酸锌和2-甲基咪唑的混合甲醇溶液。
47.该系列种实施例中，干燥过程采用氮气流干燥。
48.本发明的另一种实施方式，提供了一种可筛选小分子的拉曼增强活性衬底，由上述制备方法获得。
49.经过实验证实，本发明制备的可筛选小分子的拉曼增强活性衬底，不仅能够直接对复杂的溶液进行检测，而且检测灵敏度较高，其对4-mpy的最低检测浓度可达到10-9
m。
50.本发明的第三种实施方式，提供了一种上述用于小分子筛选富集拉曼增强活性衬底在检测汞离子中的应用。并对人体尿液、鸡粪、土壤进行了汞离子的检测。
51.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
52.本发明实施例中采用的材料如下：
53.六亚甲基四胺(c6h
12
n4,99％)购于国药化学试剂有限公司、乙酸锌(c4h6o4zn,
99％)、罗丹明6g(c
28h31
n2o3cl,ar)、甲醇(ch3oh)购于国药化学试剂有限公司、乙醇(c2h5oh)购于国药化学试剂有限公司、2-甲基咪唑(c4h6n2)、五水合硝酸锌(znno3·
5h2o)、4-巯基吡啶(c5h5ns)、对氨基苯硫酚(c6h6ns)。
54.钠离子标样、银离子标样、镍离子标样、铅离子标样、镉离子标样、铬离子标样、锌离子标样、钴离子标样、钙离子标样、铜离子标样、钡离子标样、镁离子标样、汞离子标样(购于中国标准物质中心)
55.实施例1
56.氧化锌籽晶层的生长：
57.将2
×
2cm的玻璃片依次用丙酮，乙醇和去离子水依次洗涤15分钟，并用氮气流干燥。
58.将清洗后的玻璃片浸入乙酸锌乙醇溶液(0.005m)中浸泡15s，然后放到270度的加热台上烘干30分种。然后重复浸泡、烘干两次。让玻璃片表面均匀生长籽晶层。
59.氧化锌纳米线生长：
60.首先配制0.01m乙酸锌脱水物和0.01m六亚甲基四胺的混合水溶液，将配制好的溶液倒入可密封的容器中，然后将表面生长有氧化锌籽晶层的玻璃片竖直放入容器中，并将容器置于95度的水浴锅中进行水浴加热，让玻璃片表面生长氧化锌纳米线。待反应进行一个小时以后，将玻璃片取出，使用去离子水进行冲洗，冲洗以后用氮气流进行干燥处理。
61.热蒸发镀银层：
62.通过热蒸发将一薄层银沉积在铜网的表面上。蒸发材料是高纯度ag颗粒，蒸发电流设置为70a，沉积速率约为0.12nm/s，沉积时间为375s，获得拉曼增强活性衬底。其扫描电镜(sem)图如图1所示。
63.实施例2
64.氧化锌籽晶层的生长：
65.将2
×
2cm的玻璃片依次用丙酮，乙醇和去离子水依次洗涤15分钟，并用氮气流干燥。
66.将清洗后的玻璃片浸入乙酸锌乙醇溶液(0.005m)中浸泡15s，然后放到270度的加热台上烘干30分种。然后重复浸泡、烘干两次。让玻璃片表面均匀生长籽晶层。
67.氧化锌纳米线生长：
68.首先配制0.01m乙酸锌脱水物和0.01m六亚甲基四胺的混合水溶液，将配制好的溶液倒入可密封的容器中，然后将表面生长有氧化锌籽晶层的玻璃片竖直放入容器中，并将容器置于95度的水浴锅中进行水浴加热，让玻璃片表面生长氧化锌纳米线。待反应进行一个小时以后，将玻璃片取出，使用去离子水进行冲洗，冲洗以后用氮气流进行干燥处理。
69.热蒸发镀银层：
70.通过热蒸发将一薄层银沉积在铜网的表面上。蒸发材料是高纯度ag颗粒，蒸发电流设置为70a，沉积速率约为0.125nm/s，沉积时间为360s。
71.zif-8薄膜生长：
72.分别配制0.025m硝酸锌甲醇溶液和0.025m二甲基咪唑甲醇溶液，将配制好的两种溶液充分混合以后，将拉曼衬底竖直放入溶液中，让衬底表面生长一层zif-8薄膜。待反应进行30分钟后，将衬底取出，用甲醇冲洗并用氮气流进行干燥。便得到了用于小分子筛选富
集拉曼增强活性衬底。其扫描电镜(sem)图如图2所示。
73.实施例3
74.氧化锌籽晶层的生长：
75.将2
×
2cm的玻璃片依次用丙酮，乙醇和去离子水依次洗涤15分钟，并用氮气流干燥。
76.将清洗后的玻璃片浸入乙酸锌乙醇溶液(0.005m)中浸泡15s，然后放到270度的加热台上烘干30分种。然后重复浸泡、烘干两次。让玻璃片表面均匀生长籽晶层。
77.氧化锌纳米线生长：
78.首先配制0.01m乙酸锌脱水物和0.01m六亚甲基四胺的混合水溶液，将配制好的溶液倒入可密封的容器中，然后将表面生长有氧化锌籽晶层的玻璃片竖直放入容器中，并将容器置于95度的水浴锅中进行水浴加热，让玻璃片表面生长氧化锌纳米线。待反应进行一个小时以后，将玻璃片取出，使用去离子水进行冲洗，冲洗以后用氮气流进行干燥处理。
79.热蒸发镀银层：
80.通过热蒸发将一薄层银沉积在铜网的表面上。蒸发材料是高纯度ag颗粒，蒸发电流设置为70a，沉积速率约为0.12nm/s，沉积时间为375s。
81.zif-8薄膜生长：
82.分别配制0.025m硝酸锌甲醇溶液和0.025m二甲基咪唑甲醇溶液，将配制好的两种溶液充分混合以后，将拉曼衬底竖直放入溶液中，让衬底表面生长一层zif-8薄膜。待反应进行30分钟后，将衬底取出，用甲醇冲洗并用氮气流进行干燥。再重复生长第二层zif-8薄膜后便得到了用于小分子筛选富集拉曼增强活性衬底。其扫描电镜(sem)图如图3所示。
83.实施例4
84.氧化锌籽晶层的生长：
85.将2
×
2cm的玻璃片依次用丙酮，乙醇和去离子水依次洗涤15分钟，并用氮气流干燥。
86.将清洗后的玻璃片浸入乙酸锌乙醇溶液(0.005m)中浸泡15s，然后放到270度的加热台上烘干30分种。然后重复浸泡、烘干两次。让玻璃片表面均匀生长籽晶层。
87.氧化锌纳米线生长：
88.首先配制0.01m乙酸锌脱水物和0.01m六亚甲基四胺的混合水溶液，将配制好的溶液倒入可密封的容器中，然后将表面生长有氧化锌籽晶层的玻璃片竖直放入容器中，并将容器置于95度的水浴锅中进行水浴加热，让玻璃片表面生长氧化锌纳米线。待反应进行一个小时以后，将玻璃片取出，使用去离子水进行冲洗，冲洗以后用氮气流进行干燥处理。
89.热蒸发镀银层：
90.通过热蒸发将一薄层银沉积在铜网的表面上。蒸发材料是高纯度ag颗粒，蒸发电流设置为70a，沉积速率约为0.12nm/s，沉积时间为375s。
91.zif-8薄膜生长：
92.分别配制0.025m硝酸锌甲醇溶液和0.025m二甲基咪唑甲醇溶液，将配制好的两种溶液充分混合以后，将拉曼衬底竖直放入溶液中，让衬底表面生长一层zif-8薄膜。待反应进行30分钟后，将衬底取出，用甲醇冲洗并用氮气流进行干燥。再重复生长第二层和第三层zif-8薄膜后便得到了用于小分子筛选富集拉曼增强活性衬底。其扫描电镜(sem)图如图4
所示。
93.实施例5
94.氧化锌籽晶层的生长：
95.将2
×
2cm的玻璃片依次用丙酮，乙醇和去离子水依次洗涤15分钟，并用氮气流干燥。
96.将清洗后的玻璃片浸入乙酸锌乙醇溶液(0.005m)中浸泡15s，然后放到270度的加热台上烘干30分种。然后重复浸泡、烘干两次。让玻璃片表面均匀生长籽晶层。
97.氧化锌纳米线生长：
98.首先配制0.01m乙酸锌脱水物和0.01m六亚甲基四胺的混合水溶液，将配制好的溶液倒入可密封的容器中，然后将表面生长有氧化锌籽晶层的玻璃片竖直放入容器中，并将容器置于95度的水浴锅中进行水浴加热，让玻璃片表面生长氧化锌纳米线。待反应进行一个小时以后，将玻璃片取出，使用去离子水进行冲洗，冲洗以后用氮气流进行干燥处理。
99.热蒸发镀银层：
100.通过热蒸发将一薄层银沉积在铜网的表面上。蒸发材料是高纯度ag颗粒，蒸发电流设置为70a，沉积速率约为0.12nm/s，沉积时间为375s。
101.zif-8薄膜生长：
102.分别配制0.025m硝酸锌甲醇溶液和0.025m二甲基咪唑甲醇溶液，将配制好的两种溶液充分混合以后，将拉曼衬底竖直放入溶液中，让衬底表面生长一层zif-8薄膜。待反应进行30分钟后，将衬底取出，用甲醇冲洗并用氮气流进行干燥。再重复生长第二层、第三层和第四层zif-8薄膜后便得到了用于小分子筛选富集拉曼增强活性衬底。其扫描电镜(sem)图如图5所示。
103.实施例1～实施例5为采用zif-8生长0、1、2、3、4层的拉曼增强活性衬底，其对大分子的抗干扰能力(以r6g为例)以及对小分子(以4-atp为例)的富集后的拉曼增强效果如图7、8所示，r6g具体检测方法为：将5μl溶于乙醇的r6g(10-5
m)溶液依次滴加实施例1～实施例5的拉曼增强活性衬底表面上，待自然干燥后进行拉曼测试，从检测结果可以看出在生长有两层以及两层以上的zif-8的拉曼活性衬底上r6g的拉曼信号几乎无法被检测。4-atp具体检测方法为：将实施例1～实施例5的拉曼增强活性衬底在4-atp中进行充分的浸泡吸附，待自然干燥后进行拉曼测试，可以看出4-atp的拉曼信号随着zif-8层数的增大呈先增大后减少的趋势，其中生长有两层zif-8的拉曼增强活性衬底在进行检测时对4-atp的拉曼信号强度最大。所以我们可以认为生长有两层zif-8的拉曼增强活性衬底在实施例1～实施例5中具备最好的小分子富集效果并且也具备对大分子的抗干扰能力。
104.为表征zif-8薄膜对拉曼增强活性衬底的拉曼增强效果，将5μl溶于乙醇的4-mpy溶液分别滴加在实施例1和实例3制备的拉曼增强活性衬底表面，待自然干燥后进行拉曼测试。测试结果如图8～9所示，图8为没有zif-8薄膜的拉曼增强活性衬底对不同浓度4-mpy的表面增强拉曼光谱，可以看出，对4-mpy的最低检测浓度可达到10-8
m，具有较高的灵敏度；图9为有zif-8薄膜的拉曼增强活性衬底对不同浓度4-mpy的表面增强拉曼光谱，可以看出，对4-mpy的最低检测浓度可达到10-9
m，具有更高的灵敏度。
105.采用实施例3制备的拉曼增强活性衬底检测溶液中的汞离子：
106.1.汞离子检测机理：拉曼活性衬底经过4-mpy的修饰后在汞离子溶液中进行浸泡
后检测汞离子，经过4-mpy修饰的拉曼活性衬底在汞离子溶液浸泡时，汞离子与4-mpy上的氮原子的相互作用改变了吡啶环上的电子分布，导致4-mpy分子的重新取向趋向于与银纳米线表面更垂直的吸附方式，使得4-mpy的拉曼信号得到增强。我们通过4-mpy信号的增强检测溶液中的汞离子。
107.2.4-mpy的修饰：由图9可以看出拉曼活性衬底在经过充分吸附后10-5
m的4-mpy所测得的拉曼信号最强，我们可以认为10-5
m的4-mpy经过充足的吸附时间后可以最大程度的附着在拉曼活性衬底上。所以我们选择10-5
m的4-mpy去修饰拉曼活性衬底。我们将拉曼活性衬底浸入10-5
m的4-mpy中，经过充足的吸附(15分钟)后将拉曼衬底取出并使用酒精冲洗掉没有附着在拉曼衬底上的4-mpy。
108.3.hg离子检测：
109.将被修饰的拉曼活性衬底分别在不同浓度的hg离子溶液中进行浸泡、在经过充分吸附(30分钟)后进行检测。
110.将样品放入拉曼共焦显微光谱仪(labram hr evolution)下进行检测，测试过程中，随机选取十五个点，参数设置为，每8s获取一次信号，探测器重复曝光两次，每秒显示实时采集图像，光强设置为0.5％，激光选取532nm波长，光栅设置为1800gr/mm。
111.检测结果如图10所示，拉曼增强活性衬底的最低检测浓度为10-10
m。
112.hg检测的抗干扰性检测
113.将被修饰的拉曼活性衬底分别在10-6
m的汞离子、钠离子溶液、银离子溶液、镍离子溶液、铅离子溶液、镉离子溶液、铬离子溶液、锌离子溶液、钴离子溶液、钙离子溶液、铜离子溶液、钡离子溶液、镁离子溶液中进行浸泡、在经过充分吸附(30分钟)后进行检测。
114.将样品放入拉曼共焦显微光谱仪(labram hr evolution)下进行检测，测试过程中，随机选取十五个点，参数设置为，每8s获取一次信号，探测器重复曝光两次，每秒显示实时采集图像，光强设置为0.5％，激光选取532nm波长，光栅设置为1800gr/mm。
115.检测结果如图11所示，我们可以看出在检测其他离子时4-mpy的拉曼信号也有增强，但是在检测hg离子时的增强程度要远大于此。所以我们可以看出经过4-mpy修饰的拉曼活性衬底可以做到特异性检测hg离子。
116.采用实施例3制备的拉曼增强活性衬底检测人体尿液、鸡粪、土壤中的汞离子：
117.含汞离子的土壤检测液的制备：首先称量2g的土壤，将土壤倒入8ml酒精中，然后在溶液中倒入2ml 10-4
m 4-mpy，将混合溶液超声处理15分钟。
118.含汞离子的鸡粪检测液的制备：首先称量2g的鸡粪，将鸡粪倒入8ml酒精中，然后在溶液中倒入2ml 10-4
m汞离子溶液，将混合溶液超声处理15分钟。
119.含汞离子的人体尿液检测液的制备：取8ml人体尿液，然后在溶液中倒入2ml 10-4
m汞离子溶液，将混合溶液超声处理15分钟。
120.我们将拉曼活性衬底浸入10-5
m的4-mpy中，经过充足的吸附(15分钟)后将拉曼衬底取出并使用酒精冲洗掉没有附着在拉曼衬底上的4-mpy。将样品放入拉曼共焦显微光谱仪(labram hr evolution)下进行检测，测试过程中，随机选取十五个点，参数设置为，每8s获取一次信号，探测器重复曝光两次，每秒显示实时采集图像，光强设置为0.5％，激光选取532nm波长，光栅设置为1800gr/mm。(保存在检测汞离子前拉曼衬底上4-mpy的拉曼信号)
121.我们将经过修饰的拉曼活性衬底分别在在含汞离子的土壤检测液、含汞离子的鸡
粪检测液、含汞离子的人体尿液检测液进行充足时间的浸泡。
122.将样品放入拉曼共焦显微光谱仪(labram hr evolution)下进行检测，测试过程中，随机选取十五个点，参数设置为，每8s获取一次信号，探测器重复曝光两次，每秒显示实时采集图像，光强设置为0.5％，激光选取532nm波长，光栅设置为1800gr/mm。
123.人体尿液、土壤、鸡粪的检测结果如图12、13、14所示。
124.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。